Doktori értekezés. Kövesi István. Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományi Doktori Iskola. Témavezető: Dr. Fidy Judit egyetemi tanár, az MTA tagja

Átírás

1 Funkconáls jelentőségű ks molekulák (antagonsták és alloszterkus effektorok) kötődésének hatása a fehérjeszerkezetre. Számítógépes szmulácós vzsgálatok Doktor értekezés Köves István Semmelwes Egyetem Gyógyszertudomány Doktor Iskola Témavezető: Dr. Fdy Judt egyetem tanár, az MTA tagja Hvatalos bírálók: Dr. Smon István, DSc. tudományos főmunkatárs MTA tagja Dr. Farkas Ödön, Ph.D. egyetem docens Szgorlat bzottság elnöke: Dr. Enyed Péter, DSc egyetem tanár, az MTA tagja Szgorlat bzottság tagja: Dr. Papp Elemér egyetem docens, Ph.D. Dr. Kraszmr Kolev egyetem adjunktus, Ph.D. Budapest

2 Rövdítések: CaM: kalmoduln TFP: trfluorperazn DPD: N-(3,3,-dphenylpropyl)-N'-[1-R-(3,4-bs-butoxyphenyl)-ethyl]- propylene- damne MDS: molekuladnamka szmulácó HbA: humán hemoglobn DPG: dfoszfoglcerát IHP: noztol hexafoszfát RMSD: root mean square devaton RMSF: root mean square fluctuaton PBFE: Posson Boltzmann szabadentalpa VdW: van der Waals Els: elektrosztatkus kölcsönhatás - -

3 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés A molekuladnamka szmulácók szerepe a gyógyszerhatás mechanzmusok vzsgálatában 5 1. A vzsgált fehérjekomplexek élettan jelentősége A hemoglobn oxgénkötésének alloszterkus regulácója A hemoglobn szerkezete A HbA oxgénkötése és annak szerkezet következménye A HbA allosztérkus effektora A kalmoduln gátlásának jelentősége A kalmoduln szerkezete A CaM bológa funkcója és szerepe a gyógyszerkutatásban A CaM antagonstá Célktűzések HbA alloszterkus effektor komplexek és az alegységek közt kapcsolat CaM-antagonsta komplexek 4. Módszerek 5.1 A molekulamechanka közelítés A molekulaszerkezet potencáls enegrája 6.1. A potencáls energa függvény, kovalens és nemkovalens kölcsönhatások, a CHARMM erőtér Hdrogénkötés A hdrofób kölcsönhatás Az antagonsták és effektorok paraméterezése 31. Az energamnmalzácó 3.3 Az oldószer hatásának fgyelembevétele 35.4 A molekuladnamka közelítés A mozgásegyenletek és a potencáls energa közt kapcsolat Az atom sebességek értelmezése Az ntegrátorok A nyomás és a hőmérséklet szabályozása Peródkus peremfeltételek A nem kovalensen kötött atomok egymás közt kölcsönhatása és fgyelembevételének problémá Felfűtés és ekvlbrácó 4.5 A trajektóra analízse A root mean square devaton (RMSD), a referencától való átlagos eltérés A grácós rádusz A fluktuácók Elektrosztatkus szabadentalpaszámítások a CaM antagonsta komplexeknél Oldószer által elérhető felület (SASA)

4 .6 Komplex szerkezetek meghatározása dokkolással 47.7 Egy tpkus molekuladnamka szmulácós vzsgálat menete Eredmények HbA n végzett számítások eredménye Az allosztérkus effektorok kötődése az R állapotú HbA hoz R-HbA alloszterkus effektorokkal alkotott komplexek vzsgálatából kapott eredmények értelmezése Alloszterkus effektorok hatása a HbA alegységek közt kapcsolatára Az alegységek közt kapcsolatok vzsgálatán kapott eredmények értelmezése CaM on végzett számítások eredménye Az antagonsták számított CHARMM paramétere Az RMSD, a grácós rádusz és az atom fluktuácók eredménye Az elektrosztatkus és a van der Waals kölcsönhatás vzsgálata A hdrogénkötés és a hdrofób kölcsönhatás vzsgálata Posson Boltzmann szabadentalpa számítások CaM -on végzett számítások eredményenek dszkusszója 7 4. Következtetések HbA n végzett munka eredményeből levont következtetések Allosztérkus effektorok kötődése az R-állapotú HbA hoz Az effektorkötés hatása a HbA alegységek közt kapcsolatra CaM-on végzett munka eredményeből levont következtetések Összefoglalás Summary Köszönetnyílvánítás Függelék Ewald összegzés Hőmérséklet és nyomás szabályozása 8 9. Saját közlemények Az értekezés témájában megjelent közlemények Egyéb közlemények Előadások, poszterek Irodalomjegyzék

5 1.Bevezetés 1.1 A molekuladnamka szmulácó szerepe a gyógyszerhatás mechanzmusok vzsgálatában A számítógépes szmulácós módszerek egyre szélesebb körben nyernek alkalmazást kondenzált rendszerek szlárd testek, folyadékok, molekulák- kéma és fzka tulajdonságanak értelmezésére atom szntű szerkezetük alapján. A jelen dolgozatban molekuladnamka szmulácós (MDS) eredményekről számolok be. Ezek a számítások molekulák röntgenkrsztallográfa vagy NMR spektroszkópa módszerrel meghatározott atom szerkezetéből ndulnak k és a klasszkus fzka egyenletet felhasználva szmulálják a molekulaszerkezetnek a vzsgált tulajdonság szempontjából releváns környezet körülmények (vzes fázs, onok jelenléte, kölcsönhatás más molekulákkal, hőmérséklet, nyomás) hatására történő megváltozását. A fzka szerkezetvzsgáló módszerek eredményenek alkalmazásánál ugyans nem szabad elteknten attól, hogy mlyen módszerrel történt a molekulaszerkezet meghatározása. A röntgendffrakcós mérés krstályos állapotban jellemz a molekula szerkezetét, az NMR spektroszkópa pedg gen tömény oldatban és ezek a körülmények jelentős határfeltételeket jelenthetnek az atom szerkezetre nézve. Az MDS számítások révén lehetőség van a kísérlet körülmények korrekcójára és ezáltal a natív környezetre jellemző molekulaszerkezet meghatározására. A fzka szerkezetvzsgáló módszerek érzékenységének növekedése, a kértékelő módszerek fnomodása, valamnt a számítástechnka rohamos fejlődése a módszert egyre hatékonyabb kutató-fejlesztő eszközzé tesz. Amnt említettük, a szmulácós munkának egyk eredménye az, hogy a kísérletleg meghatározott szerkezetet korrgálja. Talán még fontosabb azonban, hogy a módszer lényegéből adódóan eredményként megkapjuk mnden egyes atom kötésnek a hőmérséklet által lehetővé váló dőbel változását fluktuácóját. Ezt tükröz a dnamka szó a módszer elnevezésében. Körülbelül 30 éve vetődött fel először az a gondolat 1, hogy a molekulaszerkezetek atom mozgásanak, a konformácós dnamkának specáls vonása vannak. Jellemzőek egy-egy molekulára ll. molekularészletre. Ma már - 5 -

6 egyértelmű, hogy a bológa makromolekulák konformácós dnamkájának specáls vonása meghatározóak a bokéma aktvtás szempontjából. A munkacsoport, ahol a PhD munkámat végeztem, fehérjék konformácós dnamkájának kísérlet és számítógépes vzsgálatával foglalkozk. A fehérjék túlságosan nagy molekulák ahhoz, hogy modellezésükre kvantummechanka módszereket alkalmazzunk, így a molekulamechanka és molekuladnamka megközelítést használtuk. Munkám során két fehérjemolekula esetén vzsgáltam antagonsták ll. allosztérkus effektorok hatását a molekulaszerkezetre és ezen keresztül a bológa funkcóra. Az egyk fehérje a humán hemoglobn (HbA) volt, ahol a fontos bológa funkcó a hemoglobn oxgén kötése volt. Ismeretes, hogy a HbA oxgénkötését a tetramer szerkezetű molekula alegységek között központ üregébe kötődő ks molekulák, allosztérkus effektorok módosítják. Korábban röntgenkrsztallográfa eredmények alapján feltételezték, hogy az effektorok az oxgénmentes T -állapotban kötődnek és gátolják az oxgénaffntást. 3 Irodalm eredmények 4 azt mutatják, hogy az allosztérkus effektorok képesek oxgént kötő R- állapotú HbA komplexben s reguláln az oxgén-affntást. R-állapotú HbA-effektor komplexről azonban nem skerült röntgenkrsztallográfa szerkezetvzsgálat eredményt nyern. Munkám kezdetén bekapcsolódtam azokba a vzsgálatokba, amelyek során mnd az R-, mnd a T-állapotban vzsgáltuk az allosztérkus effektorok kötődésének hatását a molekulaszerkezetre és a konformácós dnamkára. Ez a téma lehetőséget adott a molekuladnamka szmulácós módszerek megsmerésére. A másk fehérje a kalmoduln (CaM) volt. Ez egy kalcum jelátvvő, amely sokféle enzmet képes aktváln és ezáltal számos bokéma és élettan folyamatban vesz részt. A CaM targetmolekulához való kötődésének gátlása a gyógyszeres terápa egyk eszköze. 5 Munkámban CaM-antagonsták optmáls tulajdonságat vzsgáltam. Ez a téma sokrétűbb feladatnak bzonyult. Egyrészt alkalmaztam a HbA téma vzsgálata során megtanult technkákat, másrészt, mvel a rutn számítások eredménye nem adtak magyarázatot az alapvető kérdésekre, másfajta megközelítésekkel (Posson-Boltzmann szabadentalpa számítások) s megsmerkedtem. A dolgozatban ezt a témát fejtem k nagyobb részletességgel

7 1. A vzsgált fehérjekomplexek élettan jelentősége 1..1 A hemoglobn oxgénkötésének alloszterkus regulácója A hemoglobn szerkezete A humán felnőtt hemoglobn egy oxgénmegkötő molekula a vörösvértestekben, ezáltal kulcsfontosságú az oxgénszállításban. Vérben a koncentrácója átlagosan g/l. Egy HbA molekula összesen négy oxgénmolekulát tud megkötn, azonban a kötődés sorrendje és mechanzmusa a ma napg nem smert teljes egészében. Szerkezetleg a hemoglobn egy négy alegységből álló gömb alakú fehérje. A négy alegység közül kettő-kettő azonos amnosav összetételű, az egyk a 141 amnosavból álló α, a másk a 146 amnosavból álló β alegység. A két α és két β alegységből kalakuló tetramer szerkezetet a 1. ábrán mutatom be. Mnd a négy alegység tartalmaz egy-egy hem csoportot. Az oxgén ezekhez a hem csoportokhoz kötődk. A szerkezet oxgént nem kötő (T tense) állapotban jelentős méretű központ üreggel rendelkezk, amely oxgénnel telített (R relaxed) állapotban lényegesen ksebb méretű röntgenkrsztallográfa eredmények szernt. T-állapotban kmutatták, hogy a HbA természetes és mesterséges effektora a központ üregbe kötődnek. 6 R-állapotú komplexet azonban nem skerült kkrstályosítan. Feltételezték, hogy ebben az esetben a lecsökkent térfogatú központ üreg nem elegendő az effektor megkötésére. 7 A B 1a. ábra. Az oxgént nem kötő (T-állapotú) HbA szerkezete. Kék és vlágoskék jelöl az α alegységeket, pros és narancssárga a β alegységeket, a lla a hem csoportokat. 1b. A hem: Fe-protoporfrn IX szerkezete

8 1..1. A HbA oxgénkötése és annak szerkezet következménye Az oxgén a HbA-ban egy vas-porfrnhez, a hem csoporthoz kötődk. A hem csoportban a vas a profrnben lévő négy prrolgyűrű ntrogénjehez és a polpeptdlánc két hsztdnjéhez kapcsolódk. A hsztdnek közül az egykkel szoros (proxmáls hsztdn a. ábrán kékkel jelölve), a máskkal laza (dsztáls hsztdn a. ábrán zölddel jelölve) kapcsolatot alakít k, ez utóbb helyére kapcsolódk az oxgén. Ahhoz, hogy a hem csoport oxgént tudjon megkötn, a vas oxdácós számának kettőnek kell lenne 8. Ez a feltétel egyrészt a fent említett komplexképződéssel, másrészt az oxdált hemoglobn (methemoglobn) vsszaredukálása által valósul meg. Ezt a methemoglobn daforáz enzm végz 9. Proxmáls hsztdn Dsztáls hsztdn Fe Oxgén kötőhely Hem. ábra. Az oxgénkötőhely modellje. Kék jelöl a proxmáls hsztdnt, zöld a dsztáls hsztdnt, pros a porfrnt a sárga pedg az Fe + ont

9 Az oxgén kötésekor a hem spnállapota megváltozk. A vas d pályája ugyans a Jahn- Teller effektus 10 következtében nem ötszörösen degenerált, hanem felhasad egy kétszeresen degenerált magasabb energájú e g és egy háromszorosan degenerált alacsonyabb energájú t g pályára 10. Ha a hem csoporthoz oxgén kötődk, az elektronok mnd az alacsonyabb t g szntre kerülnek (low spn). Amkor oxgén nem kötődk, mndkét pályán lesznek elektronok (hgh spn). (Erre a spnváltozásra épül az MRI dagnosztka módszerek egyk ígéretes új területe a funkconáls MRI.) Ez az effektus hatással van a hem konformácójára s; az oxgént kötő hem csoport planárs, míg az oxgént nem kötő hem csoport planartása torzult (egyes atomok klépnek a molekula síkjából). a b e g Fe + Δ t g Deox hemoglobn Ox hemoglobn c e g d e g Δ Δ t g t g 3. ábra. Az Fe + elektronszerkezete: a: ötszörösen degenerált d pálya, b: Jahn-Teller effektus következtében felhasadt d pálya, c: nagy spnszámú (hgh spn) deox-hemoglobn hem csoportjában, d: ks spnszámú (low spn) ox-hemoglobn hem csoportjában. HIS HIS N ~.0 Å N ~.7 Å N Fe + Fe + N LS HS N N O 4. ábra. A hem csoport planartása a ks spnszámú (LS, damágneses) ox-hemoglobn (baloldalon) és a nagy spnszámú (HS, paramágneses) deox-hemoglobn (jobboldalon) esetén. A molekula atomjat a molekula síkjára merőleges vetületben mutatjuk be

10 Az oxgénnel való telítődés pontos mechanzmusa ma még nem tsztázott, de az már bztos, hogy kooperatív módon történk. Tehát az egyk oxgén bekötődése segít a több oxgén kapcsolódását. Ezt az s mutatja, hogy a hasonló szerkezetű, de csak egy alegységből álló moglobn telítés görbéje jelentősen eltér a HbA telítés görbéjétől. Ezen kívül a vérben lévő H + -koncentrácó és a CO -tenzó s befolyásolja az oxgénaffntást. CO hatására a HbA O -telítettsége csökken (Bohr-effektus), ugyans amkor a CO oldódk, H CO 3 keletkezk, am H + onok megjelenésével jár és ez csökkent az oxgénaffntást. Továbbá az oxgénaffntásra hat még a testhőmérséklet és más kéma anyagok (pl. allosztérkus effektorok) s. 5. ábra. A HbA és a moglobn oxgéntelítés görbéje. 11 A 5. ábrán látható, hogy a moglobnnál nncs kooperatvtás, így egy telítés görbével írhatjuk le az oxgénnel való telítődését, míg a HbA esetében, a telítést egy szgmodgörbével írjuk le. Tehát a hemoglobnnak annál nagyobb az oxgénaffntása, mnél nagyobb mértékben telített. A kooperatvtás mértékére a Hll-egyenletből 1 következtetünk. n [ L] n [ L] + K d Θ = (1)

11 Ahol a Θ a telítettség mértéke, [L] az oxgén koncentrácója, a K d a dsszocácós állandó és az n a Hll-együttható, értéke 1<n<kötőhelyek száma. A HbA oxgénkötésének kísérlet vzsgálata (pl. allosztérkus effektorok hatásának vzsgálata) általában a Hll-egyenlet alapján történk. Az egyenlet fontos paraméterenek (n, K d ) meghatározásához először érdemes a Hll-egyenletet a következő alakra hozn: Θ log = n * log 1 Θ ( PO ) log( ) K d () Az egyenletben a PO az oxgén parcáls nyomása, a K d a dsszocácós állandó. Ha a log(po ) függvényében a log[(θ/(1- Θ)]-t ábrázoljuk (6. ábra), a meredekség megadja a Hll együtthatót, amt a kooperatvtás erősségének jellemzésére használnak. A. egyenlet bal oldala nullát ad, ha félg van telítve, azaz a Θ=0.5. Ezért a függvény X- tengely metszete megadja a logk d -t. 6. ábra. log[(θ/(1-θ)] a log(po ) függvényében (Hll-dagramm). 13 A 6. ábrából arra lehet következtetn, hogy nagyon alacsony oxgénkoncentrácón a tetramerek átlagosan csak egy oxgént kötnek, a Hll-koeffcens 1 körül érték, az első

12 oxgén ks affntású helyre lép be. Magasabb oxgénkoncentrácón a Hll koeffcens értéke 3 körül van, egy-egy oxgén kötődése elősegít a következő kötődését. Az utolsó oxgén kötődése vszont nem kooperatív, a Hll-koeffcens smét 1 körül, továbbá az utolsó oxgénmolekula nagy affntású kötőhelyre lép be. Az X-tengely metszete szernt a nagy affntású állapot kb. 100-szor erősebben köt oxgént mnt a ks affntású. A fent említettek szernt az egyk hem csoporton történő oxgénkötődés és konformácóváltozás hat a több hem környezetére s. Azonban a hem csoportok túlságosan távol vannak egymástól ahhoz, hogy egymással kölcsönhathassanak. A negyedleges szerkezet megváltozását röntgenkrsztallográfa eredmények gazolták: a HbA-nak két különböző konformácója van az R és a T. 14 A két állapot közt átmenetre több elmélet s létezk. A alábbakban smertetem a legfontosabbakat. Monod-Wyman-Changeux (MWC) modell szernt a fehérje alegysége funkconálsan egyformák, mnden alegység legalább kétféle konformácóban létezhet, és mnden alegységen egydejűleg történk a konformácóváltozás, tehát egy HbA tetrameren belül csak egyféle R- vagy T-állapotú HbA konformácójának megfelelő- alegység lehet. A konformácós állapotok egyensúlyban vannak és a lgandumkötés eltolja az egyensúlyt az R rányába. 14 Perutz szernt az alegységek közt sóhdaknak nagy szerepe van a T-R egyensúlyban. R-állapotban ezek a sóhdak hányoznak. Az elképzelés szernt az egyensúlyt elsődlegesen az Fe + onok hem síkjához vszonyított pozícója határozza meg. Ez pedg hat a sóhdakra, amelyek hatnak a vashoz kötődő hsztdnre. A proxmáls hsztdn pedg a porfrngyűrű síkjába kényszerít az Fe + ont. A modell szernt oxgénmegkötéskor egyben protonleadás s történk, am a sóhdak felszakadását, és ezen keresztül a T-R átmenetet okozza 15. Koshland és munkatársa szernt azonban nem egydejűleg történk a konformácóváltozás, hanem az egyes alegységek külön-külön változtatják meg a konformácókat és így kalakulhatnak kevert állapotok s amkor egy tetrameren belül jelen van mnd a T-, mnd az R-állapotú monomer. Azonban az egyk alegység konformácóváltozása elősegít a több alegység T-R átmenetét, és ennek következtében az oxgénmegkötést

13 A 7. ábrán bemutatott két modell közül m a MWC modellt választottuk, mvel ez összhangban van a globáls allosztéra modellel. Azonban a parcálsan telített HbA molekulákról ma még nem áll rendelkezésre röntgendffrakcós szerkezet am eldönthetné, hogy a két modell közül melyk írja le pontosabban a kooperatív oxgénkötést. 7. ábra. A Monod-Wyman-Changeux és a Koshland-Nemethy-Flmer modell összehasonlítása A HbA allosztérkus effektora A HbA-hoz természetes és mesterséges (gyógyszerhatóanyagként javasolt) allosztérkus effektorok s kötődhetnek. Ilyenek a klordon, az emlősökben a dfoszfoglcerát 18 (DPG), a madarakban az noztl-hexafoszfát 18 (IHP), lletve a mesterséges RSR13 19 és a bezafbrát 0 (BZF). Az IHP és a DPG komplexben a fehérje-effektor arány 1:1 1, az RSR13 és a BZF esetén 1:. 3 Az allosztérkus effektorok csökkentk az oxgénaffntást, ezáltal megkönnyítk a szállított oxgén leadását. DPG nélkül az oxgénaffntás körülbelül a moglobnéval lenne azonos, de DPG hatására annál 6-szor ksebb 8. A különbséget a 8. ábrán szemléltetem. A munkám során vzsgált allosztérkus effektorok szerkezetét a 9. ábrán mutatom be

14 8. ábra. DPG hatása a hemoglobn telítés görbéjére. Kék görbe jelöl a fzológás koncentrácónál ksebb, zöld a fzológás koncentrácónak megfelelőt, pros a fzológásnál nagyobb DPG koncentrácót. 11 DPG IHP RSR13 BZF 9. ábra. A HbA néhány természetes és mesterséges allosztérkus effektorának szerkezete Szerkezetleg közös, hogy mndegyk molekula vsel negatív töltést, ematt legnkább a poztív amnosavakhoz kötődnek. Így például a DPG esetén a β1 val1, β1 hs, β1 lys8, β1 hs143, β val1, β hs, β lys8, β hs143 vesz részt az

15 effektorkötésben, ahogy azt a 10. ábrán bemutatom. Eddg effektort kötő röntgendffrakcós szerkezet csak a T-állapotú hemoglobnról készült, lletve a Perutz féle modell szernt s csak a T-állapotú hemoglobnhoz kötődnek allosztérkus effektorok. 10. ábra. DPG kötőhely a hemoglobnon. Pros színnel a T-állapotú HbA-hoz kötődő DPG molekulát jelöltem. 4 Ebben a megközelítésben az effektornak az a szerepe, hogy a sóhdak stablzálása által csökkentse az oxgénaffntást a HbA-ban. Az rodalomban azonban a közelmúltban megjelentek másfajta elképzelések s az alloszterkus effektorok oxgénkötést moduláló hatásáról. Az a modell, amelyet Takash Yonetan professzor csoportja publkált, az úgynevezett a globáls allosztéra modell 5, számunkra különösen s érdekes volt. E szernt elsősorban maguk az allosztérkus effektorok szabályozzák az oxgénaffntást, azáltal, hogy az effektort kötő alegységek harmadlagos szerkezetét megváltoztatják. Ez a munkacsoport széleskörű oxgénaffntás vzsgálatakkal kmutatta, hogy az effektorok az R-állapotban s képesek reguláln az oxgén-affntást. A modell szernt a harmadlagos szerkezetváltozás fontosabb, mnt a korábban tárgyalt, sóhdakon alapuló negyedleges szerkezetváltozás. Más kutatók kísérlet eredménye s azt mutatják, hogy az effektorok az R-állapothoz s képesek kötődn. 6 7 Munkám kezdetén bekapcsolódtam azokba a vzsgálatokba, melyek során a munkacsoport Takash Yonetan professzor csoportjával együttműködve számítógépes szmulácós módszerekkel (molekuladnamka számításokkal kegészített dokkolással) gazolta, hogy a HbA R-állapotban s képes alloszterkus effektorok kötésére

16 1.. A kalmoduln gátlásának jelentősége A kalmoduln szerkezete A kalmoduln (CaM) egy vszonylag ks méretű, 148 amnosavból álló 17kDa súlyú, gen sok felület negatív töltést tartalmazó, sokfunkcós fehérje. Mnden eukaróta sejtben megtalálható; a fehérjetömeg kb. 1%-át tesz k. Szerkezetleg két kalcumkötő domén és egy központ hélx alkotja. Mndkét kalcumkötő doménen két-két kalcum kötőhely található. Az 11. ábrán bemutatom a kalcummentes (naktív) és a kalcummal telített (aktív) kalmoduln szerkezetét, röntgenkrsztallográfa, lletve NMR spektroszkópa eredmények alapján. Emlékeztetek arra, hogy a kétféle mérés nagyon eltérő környezetet jelent a molekulára nézve és egyáltalán nem bztos, hogy az 11. ábrán bemutatott széles körben felhasznált szerkezetek relevánsak a natív környezet szempontjából. A kalcummentes kalmoduln szerkezetét NMR spektroszkópával határozták meg 1-1.8mM koncentrácójú oldatban. 9 Az ábra jobb oldalán látható, hogy a kékkel jelölt központ hélx hajlott és a szerkezet egésze kompaktabb mnt a bal oldalon található kalcummal telített kalmoduln röntgendffrakcós szerkezete. Ebben az esetben a szerkezetmeghatározás 0.7μM koncentrácójú oldatból növesztett trkln szmmetrájú krstályos mntán készült. A krstályvzet tartalmazott. 30 A CaM sok negatív töltésű amnosavat tartalmaz (kalcummentes -4, kalcummal telített -16), ezért vízben jól oldódk. A sokféle funkcónak köszönhetően számos CaM komplexről készült röntgendffrakcós és NMR spektroszkópával nyert szerkezet. A CaM EF-hand típusú kalcumkötő helyeken köt meg a kalcumot. EF-hand típusú kötőhelyek más fehérjékben más fémonokkal s kalakulhatnak. Közös bennük, hogy hat lgandummal oktaéderes szerkezetet és két hélx közt egy hurkot alkotnak (hélx-hurok-hélx motívum). A hurok leggyakorbb szekvencája a következő módon írható le: X Y Z - X -Y -Z, ahol X,Y,Z,-X,-Y,-Z a fémmel komplexet alkotó amnosavak, a jelöl az őket összekötő, de a fémmel komplexet nem alkotó amnosavakat. A CaM EF-hand típusú kötőhelyeben a kalcumon öt amnosavval -melyek közül az egyk kétfogú lgandum- és egy vízmolekulával alkot komplexet. Így a kalcum koordnácós száma hét. 31 Ezt a helyzetet sematkusan a 1. ábrán mutatom be. Munkámban fontos volt, hogy a CaM Ca-onjanak koordnácós helyzetét helyesen építsük be a számításokba

17 11. ábra. A kalcummal telített CaM (a fehérjeadatbankban az azonosítója: 1CLL, baloldalt) röntgendffrakcós és a kalcummentes CaM (a fehérjeadatbankban az azonosítója: 1CFC, jobboldalt) NMR szerkezete. Pros szalaggal a kalcumkötő doméneket, kék szalaggal az N és a C termnáls domént összekötő hélxet jelöltem. A narancssárga gömbök jelölk a kalcumonokat. 1. ábra. Az EF hand típusú kalcumkötőhely szerkezete a CaM molekulában. Az 1. táblázat a kalcumon kötésben részt vevő amnosavakat mutatja be. Az amnosavak mndegyke oxgénjével vesz részt a komplexkötésben, és az összes glutamnsav kétfogú lgandumként vselkedk

18 1. táblázat. A kalcum kötőhelyek kalakításában részt vevő CaM amnosavak. Az amnosavak az oxgénjükkel kapcsolódnak a kalcumonhoz. A számok az amnosavak CaM N termnálsától számított sorszáma. Ca kötőhely 1 Ca kötőhely Ca kötőhely 3 Ca kötőhely 4 ASP 0 ASP 56 ASP 93 ASP 19 ASP ASP 58 ASP 95 ASP 131 ASP 4 ASN 60 ASN 97 ASP 133 THR 6 THR 6 TYR 99 GLN 135 GLU 31 GLU 67 GLU 104 GLU 140 H O H O H O H O 1... A CaM bológa funkcója és szerepe a gyógyszerkutatásban Az eukaróta sejtekben a CaM funkcóját tekntve általánosan jelátvvőnek lehet nevezn. Számos enzm aktválásában játszk szerepet és így számos fontos élettan funkcó regulálásához járul hozzá. Ezt mutatja be sematkusan a 13. ábra. Apo CaM Ca + jel Cklkus nukleotd metabolzmus Ca + CaM Foszforlácó NO metabolzmus Defoszforlácó Ca + transzport 13. ábra. Példák a CaM enzmeket reguláló funkcóra

19 Röntgenkrsztallográfa eredmények a target fehérjével alkotott komplexekre vonatkozóan azt mutatják, hogy enzmek regulálása esetén a 4 Ca + ont kötő CaM molekula két kalcumkötő doménjének hdrofób zsebe kapcsolódnak a targethez, malatt a két domént összekötő hélx meghajlk. Erre látható példa a 14. ábrán a CaM - CaM függő proten knáz és a CaM - CaM függő proten knáz II komplexek szerkezetében. A hdrofób zsebeket alkotó amnosavak az N doménen a Phe19, Ile7, Leu3, Val35, Met36, Pro43, Leu48, Met51, Ile5, Val55, Ile63, Phe68, Met71, Met7, a C doménen a Phe9, Ile100, Leu105, Val108, Met109, Leu116, Val11, Met14, Ile15, Ala18, Val136, Phe ábra. A CaM különböző fehérjékkel alkotott komplexe A kék jelöl a kalmodulnt, a pros a targetfehérje CaM-kötő hélxét, a sárga a kalcumont

20 Azt a részletet a targetfehérjéken, amelyhez a CAM kapcsolódk, IQ motívumnak nevezzük. Az zoleucn(i) glutamn(q) párossal kezdődő IQ motívumok α-hélx szerkezetűek és az amnosavsorrendjük IQXXXRGXXXR. A betűk az amnosavak betűjele (I: zoleucn, Q: glutamn, R: argnn, G: glcn, X: bármlyen amnosav lehet). Általánosságban a CaM kötőhelyek amnosavsorrendje a következőképpen néznek k: [I,L,V]QXXXRXXXX[R,K], ahol az L jelöl a leucnt, a V a valnt és a K a lznt. 33 A szekvencából jól látszk a hélx bázkus-amffl jellege, hogy az egyk végén hdrofób, a másk végén poztív töltésű amnosavak találhatók. Az IQ motívum ezen tulajdonsága rányadók a CaM gátlás célját szolgáló molekulák tervezésében. Energetkalag s leírhatjuk a Ca ot kötő CaM komplex képzését a targetfehérjével. Ha a CaM négy kalcumont vesz fel (aktválódk), akkor vzes közegben feltehetően az 11. ábra bal oldalán láthatóhoz hasonló formát vesz fel. Ezt nevezzük aktvált formának. A felvett kalcumonok a körülöttük kalakuló oktaéderes koordnácó segítségével kmerevítk a fehérje két termnáls régóját: az eredmény két, egymáshoz egy rendezetlen összekötő régóval kapcsolt, sznte teljesen azonos szerkezetű domén lesz, amelynek oldószer által könnyen megközelíthető felületén hdrofób, a hdrofób rész körül pedg savas amnosavak helyezkednek el. Ez az állapot a CaM számára energetkalag kedvezőtlen ezért úgy próbál energetkalag kedvezőbb állapotba kerüln, hogy enzmhez kötődk. Az enzm-cam komplex aktválódása pedg sematkusan úgy képzelhető el, hogy pl. a kötőhely (IQ motívum) az enzm aktív centrumát naktívan tartja. Amkor a CaM kötődk az IQ motívumhoz, az enzm aktív centruma konformácóváltozás révén működőképessé válk, és képes lesz különféle bokéma folyamatok megndítására. Ez a séma megközelítőleg leírja a CaM szerepét a 13. ábrán feltűntetett foszforlácó, 34 defoszforlácó 34, NO-metabolzmus 35 és cklkus nukleotd 36 metabolzmus során. A CaM vízoldékony enzmeken kívül kapcsolódhat membránfehérjékhez s, és így képes részt venn például a kálum csatorna permeabltásának és a kalcum pumpa működésének szabályozásában s. Érdekes módon a CaM szerkezete jelentősen eltér a korábban tárgyalt enzmaktváláskor jellemző szerkezetétől. A 14. ábrán látható kálum csatornával alkotott komplexben a CaM maxmum két kalcumont köthet meg az N - 0 -

21 doménjén. Amkor a CaM két kalcum megkötésével aktválódk, mndkét doménjével kapcsolódk a membránfehérje megfelelő szakaszához, am a membránfehérjében konformácóváltozáshoz vezet, am knytja a csatornát. Amkor leadja a két kalcumont az N domén elenged a membránfehérjét és így záródk a csatorna A kalcumpumpával alkotott komplex esetén ellentétben a CaM enzm komplexekkel, a molekula csak a C-doménjével kötődk a targethez, am egy autonhbtor szerepet tölt be. Ha kalcumot vesz fel akkor a membránfehérje CaM kötő részletéhez kötődk és így aktválódk a pumpa, ha lecsökken a kalcumkoncentrácó akkor a CaM leadja a kalcumot és leválk a membránfehérje CaM kötő részéről és a pumpa naktívvá válk. 39 A fent említett bokéma folyamatokon túl a CaM gen sok más élettan folyamatban s részt vesz. Szerepe van az degműködésben, 40 zomösszehúzódásban, 41 és a sejtosztódásban 4 s. Az degrendszerben a CaM a CaM-függő knáz aktválásán keresztül részt vesz a memóra működésében, a neurotranszmtter szntézs, a neurotranszmtter kbocsátás, a Ca + homeosztázs, a génexpresszó, és a sznaptkus plasztctás szabályozásában. 40 A CaM neuronokban történő szabályozó tevékenysége kapcsolatban van az Alzhemer-kórral s, mvel az általa aktvált CaM-függő knáz részt vesz a tau-fehérje foszforlálásában. Végezetül a CaM nak szerepe van a sejtosztódás középső profázsában, a metafázsában és az anafázsában. 4 Ematt a CaM működését gátló szerek antmtotkus szerekként s használhatók A CaM antagonstá Az előző részben smertetett okok matt a CaM gátlása gyógyszeres beavatkozás eszköze lehet. A CaM gátlószere (antagonstá) a targetfehérjék IQ motívuma alapján hdrofób és bázkus részleteket tartalmazó molekulák lehetnek. A Ca + -al történő aktválás után kalakult szerkezet hdrofób zsebebe kötődnek a CaM célenzmevel versengve. Ezáltal meggátolják, hogy a CaM más enzmeket aktváljon. Ematt a CaM antagonsta komplexek szerkezete a legtöbb antagonsta esetében hasonlítanak a gátoln kívánt CaM target komplex szerkezetére. Példaként az 15. ábrán bemutatom a CaM - CaM függő proten knáz II 43 Illetve, a CaM nak egy antagonsta (trfluorperazn, - 1 -

22 TFP) 44 két molekulájával a alkotott komplexének szerkezetét. Az ábrán jól látszk, hogy mndkét komplexben a központ hélx hajlott és ránézésre a CaM hasonlóan vesz körül az antagonstát és a targetfehérjét. CaM antagonstájaként az alkalmazás területektől függően- többféle molekulaszerkezetre s történtek javaslatok. Például lehetnek fenotazn származékok mnt a dopamntermelődés gátlására használt trfluorperazn (TFP) 45, arrlalkamn származékok mnt például a N-(3,3,-dphenylpropyl)-N'-[1 R-(3,4-bs-butoxyphenyl)- ethyl]-propylenedamn (DPD), 46 szulfonamd származékok mnt a W Az anttumor szerként használt vnblasztn s CaM antagonsta, egyk származéka a KAR- (16. ábra) szelektvtást s mutat, mvel a mtózst gátolja, azonban a több CaM által szabályozott folyamatot nem A CaM-antagonsta arány s eltérő lehet a komplexekben. Például röntgendffrakcós szerkezetmeghatározásból kderül, hogy a CaM-TFP komplex esetében az arány 1:1 50, 1: 44, 1:4 51, 1:7 5 lehet. Természetesen, lyen eredmények után meg kell vzsgáln, hogy a natív körülményekre adoptált molekulaszerkezetre s jellemző-e a krstályos állapotban (esetleg különböző módon krstályosított mntákban) talált sztöchometra. Egy nemrég megjelent molekuladnamka szmulácós közlemény szernt például az 1:4 arányú komplexből már az első 500ps után két TFP molekula válk k, és a komplexben maradó két TFP molekula a C-doménen marad. 53 A nagyobb antagonsta-arány tehát valószínűleg kísérlet artfakt. Ezt az s alátámasztja, hogy a C- domén az egyetlen, amelyre a TFP köt a CaM-TFP 1:1 arányú komplexében 50 és az 1:4 es komplexben ez a legjobban defnált kötőhely. A szerkezetmeghatározások szernt a DPD és a W-7 1: arányban 46 47, a KAR- 1:1 arányban kötődk a kalmodulnhoz 48. A 16. ábrán a fent említett antagonsták szerkezetét mutatom be. - -

23 15. ábra. A CaM másodlagos szerkezetének az összehasonlítása a CaM/CaMKIIα és a CaM-TFP komplexben. A CH 3 N B NH (CH ) 6 O S O N (H C) 3 N CF 3 Cl S C CH 3 NH NH O CH 3 O CH 3 D N OH C H 5 N N H COOCH 3 C H 3 CO N H 3 C H H O N O O C H 5 Cl 16. ábra. Néhány CaM antagonsta szerkezete A: TFP, B: W-7, C:DPD, D: KAR

24 1.3 Célktűzések HbA-alloszterkus effektor komplexek Ebben a munkában a célunk az volt, hogy megvzsgáljuk vajon k tud e stabl szerkezet alakuln, ha a T-állapotú HbA komplexek szerkezetéhez hasonlóan a molekula R- állapotú szerkezetének központ üregébe alloszterkus effektor kötődk. Az effektorok három tpkus reprezentánsa esetén vzsgáltuk a kérdést: DPG, IHP és RSR13. Amennyben a dokkolással meghatározott szerkezetből kndulva energetkalag és dnamkalag stabl szerkezetet skerül meghatározn, ezt tekntjük az R-állapotú HbA effektorokkal alkotott komplexének. Ezután az volt a célunk, hogy az így kapott komplex szerkezeteket összehasonlítva a röntgenkrsztallográfás mérésekből smert T- állapotú komplexek szerkezetével, olyan paramétereket találjunk, amelyek funkconáls szempontból fontos jellemzést adhatnak az új szerkezetre nézve. A kooperatív oxgénkötésben fontos szerep tulajdonítható a HbA alegységek határfelület csatolásának. Ezért a határfelület kölcsönhatásokat elemeztük a hdrogén-hdak, a hdrofóbctás és a kötött vízmolekulák szempontjából CaM-antagonsta komplexek A munkám során két CaM-antagonsta komplex szerkezetét vzsgáltam: a CaM komplexét a gyógyászatban már smert trfluorperaznnal (TFP), amt az deggyógyászatban használnak a dopamntermelődés gátlására, és az újabban javasolt DPD-vel, amt szívrtmusszabályzásra javasoltak 54 (17. ábra). A munka onnan ndult k, hogy rodalm adatok alapján a két CaM-antagonsta 1: arányú komplex röntgendffrakcós szerkezete gen hasonló (ahogy az a 17. ábrán látszk), de a két komplex dsszocácós állandója jelentősen különböző. A CaM-TFP komplexben a dsszocácós állandó 1-8μM, a CaM-DPD ben 18nM. 58 Az antagonsták szerkezetéből következk, hogy a DPD molekulák csak van der Waals és hdrofób kölcsönhatások révén képesek kötődn, míg a TFP kötődését drekt elektrosztatkus kölcsönhatás s segít. A dsszocácós állandó mégs az utóbbnál jelentősen nagyobb. A röntgenkrsztallográfa eredmények alapján ezt a különbséget nem lehet értelmezn. Elsőként arra kerestem a választ, hogy a két szerkezet vzes oldatban, 300K en és - 4 -

25 ellenonok jelenlétében s hasonló e. Másodszor, a natív körülményeket szmuláló szerkezet és dnamka alapján meg akartam vzsgáln, hogy mért kötődk gyengébben a TFP, holott poztív töltésű csoportja s van, a DPD-nek pedg csak hdrofób és poláros része vannak. Azt reméltem, hogy az eredményekből általános következtetéseket s le lehet majd vonn arra nézve, hogy mlyen optmáls szerkezet tulajdonságokkal kell rendelkezne egy molekulának ahhoz, hogy funkconálsan gátoln tudja a CaM-t. 17. ábra. A CaM-DPD és a CaM-TFP röntgendffrakcós szerkezetének összehasonlítása. A szerkezet meghatározása során a DPD komplex krstály szmmetrája P3 1, mérete: a=b=40.13å, c=173.81å, 46 a TFP komplex esetében a szmmetra P3 1, a mérete: a=b=40.75å, c=177.57å. 44 A narancssárga gömbök jelölk a Ca + onokat, a zöld a C termnáls, a fekete az N termnáls domén hdrofób zsebet, a kék és a lla az antagonstákat. Módszerek A számítógépes molekulamodellezésnek gen sok fajtája létezk. A molekulamodellezés módszereket megkülönböztethetjük aszernt, hogy mlyen sznten vzsgáljuk az adott rendszert, mekkora molekulákat vzsgálunk, dőben változó, vagy állandó rendszert vzsgálunk, lletve, hogy a rendszer mlyen tulajdonságára vagyunk kíváncsak. A számítógépes molekulamodellezés egyk nagy csoportja a kvantumkéma modellezés. Ennek több csoportja van: a hullámfüggvények közelítésén alapuló Hartree

26 Fock módszer, 59 az elektronsűrűség potencáls energa kapcsolatán alapuló sűrűségfunkconál elmélet és a szemempírkus módszerek. Nagy molekulák esetén más módszereket alkalmaznak, mert a fent említett módszerekkel gen nagy lenne a számításgény. Ematt a nagy molekulák, mnt a fehérjék, nuklensavak, lpdek esetén jelentős leegyszerűsítések révén csökkenten kell a számításgényt. Ezt természetesen csak úgy lehet megtenn, ha ellenőrzzük, hogy a kísérlet eredményekkel még összevethető következtetésekre jussunk. Ilyen modell az úgynevezett molekulamechanka, ahol azt használjuk fel, hogy az elektronok a magokhoz képest jelentősen gyorsabban mozognak ezért a potencáls energa számításához az elektronok kölcsönhatásaval nem számolunk. A molekulamechanka 64 mnt módszer az atomokat merev gömbként, a kötéseket pedg rugóként írja le. Ez a módszer kéma reakcók leírására nem alkalmas, hszen ott kovalens kötések létrejötte, lletve felszakadása játszódk le, vszont lényegesen ksebb a számolásgénye. Ha a rendszer dőbel változását kívánjuk vzsgáln, molekuladnamkáról 65 beszélünk. A molekuladnamka szmulácó végeredményeként trajektórát kapunk amt a rendszer atom pozícó adott dő alatt bejárnak. Ha a rendszer konformácót nem az dő függvényében vesszük fel, hanem véletlenszerűen, akkor Monte Carlo 66 analízsről beszélünk. Ennek az az előnye, hogy sokkal több esetleg egymástól jobban eltérő konformácót s megkaphatunk kevesebb számítással. A módszer kválóan alkalmazható a rendszer termodnamka jellemzőnek a meghatározására és a konfgurácós tér feltérképezésére. Hátránya vszont, hogy a rendszer konformácójának az dőfüggéséről nem tudunk meg semmt. A következőkben áttekntem azokat a főbb az molekulaszmulácós módszereket, amelyeket a számításankban alkalmaztuk..1 A molekulamechanka közelítés.1.1 A molekulaszerkezet potencáls energája A közelítés célja a molekula atomokból történő felépítéséhez tartozó potencáls energa meghatározása. A közelítésben az energát atom-párok között kölcsönhatás energák összegeként adjuk meg, tehát az eljárás kndulópontja a molekula atom részletességű - 6 -

27 szerkezetének smerete, amelyet röntgendffrakcós vagy NMR spektroszkópa mérések adata szolgáltatnak. A molekulamechanka módszerben az atomok elektronállapotatól eltekntünk és az atomtörzseket gömbökkel reprezentáljuk. Az atomok között háromféle kölcsönhatást tételezünk fel: kovalens, elektrosztatkus és van der Waals kölcsönhatást. A kéma kötéseket rugókkal reprezentáljuk, és a kötés erősségét a Hook törvénynek megfelelően írjuk le. Az egyes atomok közt kölcsönhatások megadásához lyen módon szükség van az egyensúly kötéstávolságokra, kötésszögekre, és déderes szögekre és ezek erőállandóra. A másk két energatag leírásához pedg a parcáls töltések és a van der Waals ráduszok szükségesek, 67 amket vagy nfravörös spektroszkópával vagy kvantumkéma számításokkal kapnak meg és ezek alapján a molekula potencáls energája atom részletességgel felírható..1. A potencáls energa függvény, kovalens és nemkovalens kölcsönhatások, a CHARMM erőtér A rendszer potencáls energája klasszkus közelítésben függ a belső koordnátáktól mnt a kötéstávolságok, kötésszögek, déderes szögek, lletve a parcáls töltésektől és a Van der Waals ráduszoktól. 68 A molekuladnamka szmulácókban sokféle erőteret alkalmaznak. Attól függően, hogy mként veszk fgyelembe a hdrogéneket két nagy csoportjuk létezk: unted-atom és all-atom közelítés. A unted atom típusú erőterek a hdrogéneket nem különböztetk meg egymástól, ezáltal egy egyszerűbb modellhez jutnak. A unted-atom módszerek ematt sok számításdőt megtakarítanak, vszont kevésbé pontos eredményt adnak. A legsmertebb lyen erőtér a GROMOS. Az all-atom tpusúak mnden hdrogénatomot egyedleg fgyelembe vesznek. Az allatom erőterek közül a legsmertebbek az AMBER, CVFF, ESFF, CHARMM M a számítás során a CHARMM (Chemstry at HARvard of Molecular Mechancs) erőteret használtuk, am a potencáls energát (φ) a következő alakban vesz fgyelembe: E φ = E kötő + E nemkötő kötő Eb + Eθ + Eϕ + = E (3) E = E + E nemkötő vdw el ϖ - 7 -

28 A kötő energatagok a CHARMM erőtérben a következőképpen írják fel: E b = K köt b ( b ) b 0 E E E ϕ ϖ θ = ( θ θ ) = K szög K θ ϕ déderes szög = K mprop ϖ 0 [ + cos( nϕ δ )] 1 n = 1,,3,4,5, 6 (4) ( ϖ ) ϖ 0 Ahol a K b az adott kötés erőállandója (Hook törvény), b az adott kötés aktuáls kötéshossza, b 0 az egyensúly kötéstávolság, K θ az adott szög erőállandója, a θ az aktuáls kötésszög szöge, θ 0 az egyensúly kötésszög, a K ϕ a déderes szög megváltoztatásához szükséges erő, a ϕ az aktuáls kötésszög, n egy szmmetra koeffcens, am azt mondja meg hányszor van a déderes szöget alkotó négy atom energamnmumban 360 -on belül, δ a mnmumhoz tartozó szög. Az ω 0 az egyensúly síkból való klépés szög, az ω az aktuáls síkból való klépés szög. A nemkötő tagok a CHARMM erőtérben: Elektroszatkus kölcsönhatás az egymással kovalens kötésben nem lévő atomok között: qq j E el = (5) Dr nemkötő atompárok j Ahol a q és a q j az adott atomok parcáls töltése, az r j az -edk és a j edk atom távolsága, D a delektromos állandó. A semleges atomok és molekulák közt kétféle erőhatást tudunk leírn. Egy nagy távolság esetén működő vonzást (van der Waals lletve dszperzós kölcsönhatás) és egy ks távolságon működő taszítást (az átfedő elektronpárok eredményeként). A Lennard

29 Jones (L-J, 6-1 potencál) potencál ezt a két erőhatást írja le. A Lennard-Jones formula általunk használt alakja a következő E LJ 1 6 σ j σ j = 4ε (6) nemkötő rj rj atompárok Ahol ε a potencálvölgy mélysége, σ j a két atom véges távolsága az E=0 esetben, az r j a σ két atom távolsága. Az egyenletben az r 1 írja le a taszítást és az egyenletet a szmulácós programok egy egyszerűbb alakban használják: σ r 6 a vonzást. Az = Evdw 6 nemkötő atompárok A j Bj (7) 1 rj rj Ahol Aj =, B 1 4εσ j j =. 6 4εσ j.1.3 Hdrogénkötés A hdrogénkötésben egy nagy elektronegatvtású atomhoz kapcsolódó hdrogén és egy nemkötő elektronpárral rendelkező atom vesz részt. A hdrogénkötés létrejöttének a feltétele az, hogy legyen egy poztívan polározott hdrogénatom am egy nagy elektronegatvtású atomhoz kapcsolódk. Ilyen nagy elektronegatvtású atom a ntrogén, az oxgén, a klór és a fluór. Továbbá a hdrogénatom datív kötést létesít egy nemkötő elektronpárt tartalmazó atommal. A hdrogénkötés explct módon nem szerepel a potencáls energafüggvényben, ezért a számításához a HBPLUS programot használtuk. Ez a program geometra alapon a hdrogén és a nemkötő elektronpárt vselő atom közt távolság, lletve a hdrogén, a hdrogénhez kötődő nagy elektronegatvtású atom és a nemkötő elektronpárt vselő atom közt kötésszögekhatározza meg, hogy lehet e hdrogénkötés két atom közt vagy nem. A HBPLUS program meghatározza, hogy két molekula vagy molekularészlet közt hol van - 9 -

30 hdrogénhídkötés az atomtávolságok és a szögek alapján. A távolságkrtérum.7å és 3.3Å között van, a donor-h-akceptor szögnek 90 -nál nagyobbnak kell lenne A hdrofób kölcsönhatás A hdrofób kölcsönhatás egy specáls kölcsönhatás, am nem kölcsönhatás energa mnmalzálás következménye, hanem egy kölcsönhatás által létrejött, entrópaváltozás által s vezérelt folyamat. Ematt nagyon nehéz egzakt módon leírn. Fehérjék esetén legnkább a Kyte-Doolttle skálát szoktak alkalmazn a jellemzésére.. táblázat. Kyte-Doolttle hdrofóbctás táblázat 7 Amnosav: Kyte Doolttle érték (amnosavakra vonatkoztatva) Ala 1.8 Cys.5 Asp -3.5 Glu -3.5 Phe.8 Gly -0.4 Hs -3. Ile 4.5 Lys -3.9 Leu 3.8 Met 1.9 Asp -3.5 Pro -1.6 Glu -3.5 Arg -4.5 Ser -0.8 Thr -0.7 Val 4. Trp -0.9 Tyr

31 Ez a skála tartalmazza az összes amnosav kísérletleg meghatározott hdrofóbctását - amt szerves (pl. oktán) és vzes fázs közt megoszlás hányadosból kaphatunk meg. Ebből következtetn lehet egy fehérjerész hdrofób karakterére. A táblázat a hdrofób amnosavakat poztív számokkal, míg a polárs lletve töltéssel rendelkező amnosavakat negatív számokkal jelöl. A fent módszer a hdrofób sajátságot az amnosavakhoz rendel. A fent módszer a hdrofób paramétereket az amnosavakhoz rendel. Részletesebb képet kapunk két molekula, vagy két molekularészlet hdrofób kölcsönhatásaról ha atom sznten vzsgáljuk őket. Ezt fejezk k az alább egyenletek. b = S a S a R T (8) j j j j j B (9) = bj Ahol a b j az edk és a j-edk atom közt kölcsönhatás erősségét jellemző szám, az a és az a j az edk és a j-edk atom kísérletleg meghatározott hdrofób sajátságát jellemző szám, az S és az S j az -edk és a j-edk atom oldószer által elérhető relatív felszíne, R j 1 az -edk és a j-edk atom közt távolságfüggvény, am a leggyakrabban n, a Tj egy r szám, amnek az értéke vagy +1 vagy 1 lehet. Ha a két atom közt kölcsönhatás energetkalag kedvező akkor a T j =+1, ha kedvezőtlen akkor Ezeket a kölcsönhatásokat összegezve megkapjuk a teljes hdrofób kölcsönhatást a két molekula vagy molekularészlet közt. A B nem egy energatag, így nncs benne a potencáls energafüggvényben..1.5 Az antagonsták és effektorok paraméterezése M a vzsgált antagonstákhoz és az effektorokhoz tartozó parcáls töltéseket, az erőállandókat és az egyensúly geometra paramétereket a sűrűségfunkconál elmélet (DFT) alkalmazásával nyertük. Első lépésként vákuumban optmalzáltuk a

32 molekulageometrát, azaz megkerestük a mnmumhoz tartozó konformácót. Az antagonstákat és az allosztérkus effektorokat alkotó szén, ntrogén és oxgénatomok belső atompályának az elektronja nem vesznek részt a kéma kötésben, továbbá nem befolyásolják a töltéseloszlást, a szerkezetet és a rezgéseket, ezért a geometra optmálás esetén a belső atompályák elektronjat effektív magpotencállal vettük fgyelembe. 81. Az energamnmalzácó A molekulamechanka koncepcó alapján felírt potencáls energafüggvény lehetőséget ad arra, hogy megkeressük azt a konformácót, amhez a lehető legksebb potencáls energa tartozk. Ez egy továbblépést jelent a kísérlet szerkezetmeghatározó módszerek eredményehez képest, ahonnan a kndulás atomtávolságokat vettük, mvel a felírt energafüggvény lehetőséget ad a mérésekhez szükséges kísérlet kényszerfeltételek korrekcójára (pl. krstályos környezet helyett vzes környezet, ellenonok). Így a korrgált energafüggvény mnmuma jó esetben- olyan konformácóra vezet, am a natív állapotot a kísérlet adatoknál jobban közelít. A mnmalzálás módszerek lényege: Egy olyan konformácót (r*) keresünk, ahol az adott rendszer potencáls energája φ(r) mnmáls. A potencáls energafüggvény egy többváltozós függvény φ(r), amnek a r=(r 1, r, r 3N ) az atomok helyvektoraból képzett 3N komponensű vektor Descartes koordnáta rendszerben (N az atomok száma). A függvény mnmumhelyénél az összes változó szernt első derváltak értéke zérus, a másodk derváltak pedg poztívak. φ r ( r ) φ( r r * = 0; ) > 0; 1 3N (10) - 3 -

33 Mvel a makromolekulák potencáls energafüggvénye többnyre nem lneársak r-ben és sok mnmumhellyel rendelkeznek, numerkus módszereket használunk a mnmumhelyek felderítésére. Ezek a módszerek mnden egyes terácós lépés után változtatják a helyváltozókat úgy, hogy az energa csökkenjen, míg el nem ér egy lokáls mnmumot. A mnmalzácós módszerek ma még nem képesek meghatározn a globáls mnmumot. A mnmalzáló módszereket derváló és nem derváló módszerekre csoportosíthatjuk aszernt, hogy használják e a potencálfüggvény derváltjat vagy nem. A derváló módszerek kszámítják a potencáls energafüggvény derváltjat numerkus vagy analtkus módszerrel. A derváló módszereket s feloszthatjuk aszernt, hogy csak az első (elsőrendű módszerek), vagy az első és a másodk derváltakat (másodrendű módszerek) s használják. M elsőrendű módszereket használtunk, a leggyakrabban használt steepest descent és a conjugate gradent módszereket. A streepest descent módszer: A módszer lényege, hogy a 3N-dmenzós potencáls energafüggvény egy pontjából (r 3N ) az terácós eljárást a negatív gradens rányában ndítjuk el. Ennek mentén csökken leggyorsabban a potencáls energafüggvény. Ha a k-adk lépés rányát s k val jelöljük, akkor ez felírható a következő alakban: s k g k = 0, g k k (11) ahol g φ( ) = a potencáls energa gradense az r k konfgurácós helyen, a k a k- k r k adk lépést jelöl. A k-adk terácót követő új konfgurácót, az r k+1 et az alább összefüggéssel kapjuk: r λ k +1 = rk + k sk k > 0, k 0 λ (1) ahol a λ k az s k rányában történő lépéshosszként nterpretálható. Ezután elmegyünk a potencáls energafüggvény ezen rány szernt keresztmetszetének mnmumág

34 18. ábra. steepest descent módszer. Az első ábrán a potencáls energafelület egy részlete látható, am a potencáls energát ábrázolja, a Ramachandran dagrammnak megfelelő φ és ψ szögek függvényében. A másodk ábrán kválasztunk egy rányt am mentén megkeressük egy mnmumát, ahogy a harmadk ábra részletesen bemutatja. 8 Ha megtaláltuk az rány ment mnmumot akkor ebben a pontban s kszámítjuk a függvény gradensét. Ez lesz a következő terácós lépés ránya és ebben az rányban s megkeressük a függvény rány ment mnmumát. És ezt addg folytatjuk amíg el nem érjük a lokáls mnmumot. Ez a módszer főleg a mnmalzálás elején szokták használn mvel a mnmumtól távol jól konvergál, de a mnmumhoz közel már nem

35 Conjugate gradent módszer: A conjugate gradent módszer esetén az egyes terácók során használt gradensek ortogonálsak egymásra, míg az rányok konjugáltak. Az algortmus: a k adk terácó kndulás konformácója legyen r k, a mozgás ránya v k, ahol v k -t az r k pontból számolt gradensből, g k ból és a korább rányból, v k-1 -ből számítjuk. 68 v γ (13) k = g k + k vk 1 γ k tt egy skalár konstans, amely a következőképpen defnálható: g k g k γ k = (14) g g k 1 k 1 A módszer során használt terácós rányok és gradensek a következő összefüggéseket elégítk k: g v k 1 k = 0 ˆ n φ v = 0 (15) k 1 ( k 1) k k g g v k 1 k = 0 ahol a ˆ φ n ( k 1) k φ = r r k 1 k. A módszer azonban csak a másodk lépéstől használható, az első lépésnél az rány megegyezk a steepest descent nél használt negatív gradens rányával. Ez a módszer mnd a mnmumhoz közel, mnd a mnmumtól távol használható..3 Az oldószer hatásának fgyelembevétele A szmulácók során explct módon vettük fgyelembe a vízmolekulákat, vagys mnden vízmolekula mozgásával és kölcsönhatásával s számoltunk, így a fehérje-víz kölcsönhatásokról s képet kaphattunk. Gyakran alkalmazzák még az mplct megközelítést s, amkor a vízmolekulák jelenlétét egy folytonos közegként írják le és

36 nem a tényleges vízmolekulákkal való kölcsönhatást veszk fgyelembe, hanem csak a közeg delektromos állandóját. M azonban nem ezt a módszert használtuk. Az explct módszer azt jelent, hogy a szmulácó során mnden egyes vízmolekulának kszámítjuk a trajektóráját. A CHARMM erőtér többféle modellt tartalmaz a vízmolekulákra nézve. M a TIP3 modellt használtuk, amely a molekulát egy oxgén és két hdrogénatomból álló merev molekulaként kezel, ematt a potencáls energájából khagyja a kötésszögnek és a síkból való klépés torzós szögének megfelelő energatagokat..4 A molekuladnamka közelítés.4.1 A mozgásegyenletek és a potencáls energa közt kapcsolat A molekuladnamka során a klasszkus mozgásegyenleteket oldjuk meg atomokra és molekulákra azért, hogy megkapjuk a rendszer dőbel változását. A termodnamka jellemzőket (hőmérséklet, nyomás), a Maxwell-Boltzmann közelítéssel vesszük tekntetbe. A mozgásegyenlet Newton másodk törvényéből levezetve a következőképpen alakul: dv m = F vagy F = ma (16) dt Ahol F az erő, m a tömeg, v a sebesség, a t az dő, és a a gyorsulás. Ezt átrendezve kapjuk a következő összefüggést: d r m = F dt és F = r φ(r) (17) d r rj φ () r = m 1 N (18) dt

37 Ahol a φ(r) a potencáls energafüggvény, a r j φ a potencáls energafüggvény gradense, m az -edk atom tömege. A 17. egyenlet a potencáls energa amt fent részletesen kfejtettem- és a Newton féle mozgásegyenlet ezen keresztül a részecske helykoordnátá (r) lletve sebessége (v)- közt kapcsolatot -tehát a potencáls energa és a mozgásegyenletek közt kapcsolatot- mutatja be. Amennyben a részecskék helykoordnátának és sebességének az dőfüggésére vagyunk kíváncsak, a fent összefüggést numerkusan k kell ntegráln. A.4.3 as részben néhány széles körben használt ntegráló algortmust mutatok be..4. Az atom sebességek értelmezése A szmulácó előtt az atomokhoz kezdet sebességeket rendelünk véletlenszerűen a T hőmérséklet szernt, a Maxwell-Boltzmann eloszlás alapján. Ezt a következő összefüggés írja le: p m 1 m v x ( v ) = x exp πk BT k BT (19) Az egyenletben p(v x ) annak a valószínűsége, hogy az m tömegű -edk atom x rányú sebessége T hőmérsékleten v x..4.3 Az ntegrátorok A molekuladnamka szmulácók során a.1. ben leírt potencáls energafüggvényt ntegráljuk k numerkusan. Erre többféle algortmus létezk. Ilyenek a Verlet, Velocty Verlet, Verlet Leapfrog algortmusok. A Verlet algortmus esetén a rendszer soron következő állapotát az előző és az aktuáls állapotból számítjuk k. A kezdet t=0 dőpllanatban a sebességeket véletlenszerűen osztjuk el az egyes atomok közt az adott hőmérsékletnek megfelelően