Bioinformatika előad

Átírás

1 5.. előad adás Prof. Poppe László BME Szerves Kémia és Technológia Tsz. Bioinformatika proteomika Előadás és gyakorlat

2 Fehérje térszerkezet t megjelenítése A fehérjék meglehetősen összetett szerkezetek, ezért speciális eszközökre van szükség a megjelenítésükhöz. Az ábrán egy relativ kisméretű fehérje, az acilfoszfatáz (PDB kód 2ACY) szerkezete látható. Egyszerűsítések nélkül még ennek a kisméretű fehérjének a szerkezete is kezelhetetlen

3 Fehérje térszerkezet t megjelenítése A fehérjel rjelánc (backbone) megjelenítése RasMol A fehérjelánc lefutása simított interpolált görbével jeleníthető meg (2ACY)

4 Swiss PDB Viwer: Fehérje térszerkezet t megjelenítése A fehérjel rjelánc szekunder szerkezeti elemek szerinti megjelenítése A fehérjelánc lefutása a szekunder szerkezetnek megfelelő szalagokkal jeleníthető meg (2ACY)

5 Fehérje térszerkezet t megjelenítése A fehérje szekunder szerkezeti elemek szerinti sematikus megjelenítése A fehérje a szekunder szerkezetnek megfelelő sematikus elemekkel megjelenítve (2ACY)

6 Fehérje térszerkezet t megjelenítése A fehérje szerkezet fejlett vegyes módúm megjelenítése A fehérje szerkezet fejlettebb programokkal vegyes módon is megjeleníthető (2ACY)

7 Összerendelések sek megjelenítése A többszörös összerendelések megjelenítése és vizuális elemzése a leghatékonyabb eszköz amivel a molekuláris biológiával foglalkozó kutató dolgozhat, akár a laboratóriumi asztalról. Ne is gondoljunk azonban hatékony eszközre - felhasználásra, ha nem alkalmazunk kölönböző színeket az aminosavak kölönböző fizikokémiai típusai szerint. Szín Sárga Zöld Magenta Piros Kék Oldallánc típusa Kicsi, apoláris Hidrofób Poláris Negatív töltésű Pozitív töltésű Aminosavak Gly,, Ala, Ser, Thr Cys,, Val, Ile, Leu,, Pro, Phe, Tyr,, Met, Trp Asn, Gln,, His Asp, Glu Lys, Arg

8 Összerendelések sek megjelenítése A színezés és vizuális megjelenítés fontossága tioredoxin enzimek példáján: A tioredoxin enzimek minden sejtben megtalálhatóak. A biológiai folyamatok széles skálájában részt vesznek, mint pl sejtosztódás, véralvadás, csírázás, inzulin lebontás, oxidatív sérülések javítása, stb... Közös hatásuk a proteinek diszulfid hídjainak redukciója. Az E. coli tioredoxin szerkezete egy központi ötszálú β-redős lemezt tartalmaz, minden oldalról α-hélixekkel körbevéve. A hélixeket és a redőket az α és β szimbólumok jelzik. Elvárható, hogy a többi tioredoxin enzimek többé-kevésbé, de nem teljesen megegyező szerkezeti elemeket tartalmaznak, mint az E. coli enzim. A következő néhány képen a tioredoxin enzimek példáján láthatjuk a színek alkalmazását többszörös összerendelések és szerkezeti elemzés során

9 Többszörös összerendelések sek megjelenítése (a) Az E. coli tioredoxin és homolgjai aminosav szekvenciáinak többszörös összerendelése. Néhány szekvenciát a végeknél elvágva láthatunk. A tábla számai az E. coli szekvencia pozícióinak felelnek meg (felső sor). A hélix (α) és redő (β) hozzárendelések az E. coli tioredoxin kísérleti szerkezetéből származnak (PDB kód: 2TRX)

10 Szekvencia Logo megjelenítése (b) Az E. coli tioredoxin és homolgjai aminosav szekvenciáinak többszörös összerendeléséből származtatott szekvencia Logo (Szekvencia Logo: T. Schneider and M. Stephens; Webszerver (S.E. Brenner): Jól láthatóak a konzervált szerkezeti részletek és az ezekben részt vevő aminosavak sajátságai

11 Térszerkezet megjelenítése (c) Az E. coli tioredoxin [2TRX] szerkezete egy központi ötszálú β-redős lemezt tartalmaz, minden oldalról α-hélixekkel körbevéve. Az aminosavak számozása megegyezik a szekvencia összerendelés táblázatban találhatóval. Az N- és C-terminális részek és minden tizedik C α atom (gömbök) kiemelve láthatóak. A reaktív diszulfid hidak a Cys32 és Cys35 aminosavak között sárga. A többszörös szekvencia összerendelések segítségéval remélhetjük hogy egyes szerkezeti és működési sajátságok azonosíthatóak

12 Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A A legjobban konzervált régir giók k valósz színüleg megfelelnek az aktív v helynek. Az E. coli tioredoxin Cys32 és Cys35 aminosavak közötti reaktív diszulfid hidak a fehérje családon belül a konzerválódott WCGPC[K/R] motivumban találhatóak. A szekvencián belül további konzerválódott régiók is találhatóak: a PT (76 77) és a GA (92-93) aminosavak a szubsztrát kötésben fontosak

13 Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A A beszúrásokban/t sokban/törlésekben gazdag helyek valósz színüleg felszini hurkok. Konzervált Gly ill. Pro valósz színüleg fontos kanyaroknak (turn) felel meg. A kanyar (turn) egy nem szokásos főlánc konformáció, általában nagy mozgékonyságú glicineknél fordul elő. A konzervált Gly92 az E. coli tioredoxinban például egy kanyar része. Kanyart okozó szerkezeti rész lehet még a prolin. A konzervált Pro76 az E. coli tioredoxinban például szintén egy kanyar része

14 Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A 2 egységenk genként nt hidrofób b oldalláncokat a köztes k egységekben gekben változatosabb v és s hidrofil oldalláncokat is tartlamazó aminosavakkal tartalmazó szekvencia β-redő jelelétére utal. Ez a mintázat figyelhető meg az közötti β-redőnél

15 Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A A ~4 egységenk genként nt hidrofób b oldalláncokat tartalmazó szekvencia α-hélix jelelétére utal. (Az α-hélix menetemelkedése 3,6 aminosav). Ez a mintázat figyelhető meg a hely közötti α-hélixnél

16 Fehérjeszekvenci rjeszekvenciák és szerkezetek analízise 1. Egyszerű fehérje elemzések 2. Térszerkezet előrejelzése 2.1. A probléma bonyolultsága 2.2. A predikció szintjei D predikciók (másodlagos szerkezet, hozzáférhetőség, transzmembrán hélixek) 3. Térszerkezetek kísérleti meghatározása 3.1. Fehérje szerkezetek kristályos fázisban (Röntgen diffrakció) 3.2. Fehérje szerkezetek oldatfázisban (NMR módszerek) 4. Térszerkezetek elemzése 4.1. Másodlagos szerkezet elemzése 4.2. Fehérje szerkezet minősége 4.3. Szerkezeti motívumok 4.4. Kölcsönhatás ligandumokkal 4.5. Egyéb (töltésviszonyok, felszínek, üregek)

17 Egyszerű fehérje elemzések Fehérjeazonosítás (ld.: EXPASY Tools AACompIdent, Multident,...) AACompIdent:( Fehérje azonosítása aminosav összetétel ill. opcionálisan még pi (izoelektromos pont) és Mw (molekulatömeg) alapján a SwissProt/TrEMBL adatbázisokban (-> rangsorolt lista a bevitt adatokhoz hasonló fehérjékről -> esetleges távoli homológiák találhatóak!)

18 Fehérjeazonos rjeazonosítás tömegspektrometriai módszerekkel Adott proteázzal (pl. tripszin) való emésztés után a képződő peptid fragmentumok pontos molekulatömege tömegspektrometriával mérhető, így a fehérje azonosítható (tömeg ujjlenyomat mass fingerprinting) Elterjedt módszer: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry) MALDI-TOF: a fehérjét (ill. fragmentumait) UV elnyelő anyagba ágyazzák (mátrix), ezt a réteget pulzáló UV lézerrel besugározzák. Az ionizált molekulák leválnak a mátrixról. Az elektromos térben felgyorsított ionok becspódását detektáljuk. A becsapódásig eltelt időből (time of flight - TOF) számítható a tömeg

19 Fehérje elemzés Mass fingerprinting MOWSE, MASCOT: Az emésztéshez használt proteáz és a peptidtömegek megadásával rangsorolt listák nyerhetőek a megadott adatoknak megfelelő, elsődleges fehérje szekvencia adatbázisban (pl. OWL, SwissProt, stb. megtalálható fehérjékről

20 Térszerkezet előrejelz rejelzés s bonyolultsága Általános cél: határozzuk meg egy adott fehérje(szekvencia) azon konformációját, amelyhez a szabadentalpia globális minimuma tartozik. Kisebb modellek segítségével igazolható, hogy a feladat ún. NP nehéz, azaz a megoldáshoz szükséges idő a (fehérje)mérettel nempolinomiális függvény szerint (hanem gyorsabban) növekszik (tehát a probléma adott mérethatár fölött nem megoldható.) A valós fehérjék esetében a probléma legtöbbször kezelhető, mert a valós fehérjék szekvenciái meglehetősen specifikusak (evolúció során kiválogatódtak); a predikcióhoz tudásbázisként felhasználhatjuk a már ismert térszerkezeteket

21 Térszerkezet előrejelz rejelzés s szintjei

22 Térszerkezet előrejelz rejelzés s szintjei 1D: egy dimenziós string-ként leírható, az egyes aminosavakhoz rendelhető tulajdonságok Pl.: szekvencia, másodlagos szerkezet, oldószer általi elérhetőség, hidrofobicitás

23 Térszerkezet előrejelz rejelzés s szintjei 2D: aminosavpárok közötti távolságok, kontaktusok Pl.: HB plot hidrogénhidas kötések elemzése)

24 Térszerkezet előrejelz rejelzés s szintjei 3D: az összes atomi koordináta megadása ab-initio módszerek Homológia modellezés

25 EXPASY Tools: 1D predikciók Másodlagos szerkezet

26 1D predikciók Másodlagos szerkezet 1. és 2. generációs módszerek: az egyes aminosavak különböző másodlagos szerkezetekben való előfordulási gyakoriságai alapján. Pontosság <70%, β-szerkezetre csak 28 48%, túl rövid α hélixek és β szálak Chou Fasman: α hélix: 6 egymás melletti aminosav közül 4 hélixbéli előfordulási valószínűsége legalább 1,03; β szál: 5 egymás melletti aminosav közül 3 β szálbéli előfordulási valószínűsége legalább 1,0. Kiterjesztés mindkét irányban, amíg 4 egymás melletti aminosav átlagos α hélix, ill. β szál képzési valószínűsége 1,0 alá nem csökken GOR (Garnier Osguthorpe Robson): 17 aminosav szélességű ablakban vizsgálja az aminosavakat, előfordulási gyakoriság alapján jósolja az ablak közepén található aminosav másodlagos szerkezetét 3. generációs módszerek: a vizsgált szekvenciákhoz hasonlóakból többszörös összerendezés, majd a többszörös összerendezésekben található információk felhasználása [pl. információk az együtt mutálódó aminosavakról (korrelált mutációk), amelyek a térszerkezetben általában egymáshoz közel vannak]. Mivel tehát a többszörös összerendezés információt tartalmaz a fehérje harmadlagos szerkezetéről, így lehetővé teszi a másodlagos szerkezet jóslását. Konszenzusos módszerek: több módszert (fejlettebb 2. és 3. generációs módszereket) alkalmaznak, és az eredmények konszenzusát veszik

27 B. Rost.: Meth. Enzymol. 1996, 266, Másodlagos szerkezet PHD módszerm 1. Rokon szekvenciák a SwissProt adatbázisból (BLAST program) 2. Többszörös összerendezés (MaxHom program) 3. Az összerendezés szűrése, jó homológok megtartása, újbóli összerendezés 4. A végső összerendezés alapján minden pozícióra elkészül az előforduló aminosavcserék profilja 5. Ez a neuronhálózat bemenete (két szintű: PHDsec és PHDhtm; vagy egy szintű: PHDacc)

28 PredictProtein: Másodlagos szerkezet PHD módszerm

29 PredictProtein: Másodlagos szerkezet PHD módszerm

30 Másodlagos szerkezet Konszenzus módszerm Ezen az ábrán három automata szekunder szerkezet predikció (PHD, SOPMA and SSPRED) látható 12 glutamil trna reduktáz szekvencia alatt A konszenzus szekvencia és a szemrevételezés tovább finomíthatja az eredményeket

31 JPred: Másodlagos szerkezet Konszenzus módszerm

32 JPred: Másodlagos szerkezet Konszenzus módszerm

33 Oldószer elérhet rhetőség g becslése se Oldószer elérhetőség becslés Az adott oldallánc felszíni vagy eltemetett Kezdetleges módszerek: az oldallánc hidrofobicitása alapján > gyenge eredmény Jobb becslés: evolúciós információ bevitele többszörös összerendezésekkel > 75% pontosságú jóslás (PHDacc) Az előző példákból látható volt, hogy a legtöbb szekunder szerkezet becslő program becslést ad az oldószer elérhetőségről is

34 2D predikciók Oldallánc kölcsk lcsönhatások becslése se Az összes oldallánc kölcsönhatás figyelembe vételével elvben felépíthető a 3D szerkezet (ld. később NMR módszerek) Kölcsönhatások becslésére felhasznált sajátságok/adatok: a szekvenciában távoli aminosavak együtt előforduló (korrelált) mutációi statisztikai adatok átlagtér potenciálok neuronhálózatok Az oldallánc kölcsönhatások becslésére tett eddigi próbálkozások nem jártak kielégítő eredménnyel

35 3D szerkezetek Kísérleti módszerekm? Valóság - Kísérlet Modell l??

36 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása HTP kristályos lyosítás

37 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása HTP kristályos lyosítási si eredmények

38 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása Röntgen krisztallográfia

39 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása NMR spektroszkópia pia Az NMR mérések során a magok mágneses perdületének változásai követhetőek a magok környezetétől függően. Értkető módon a magok érzékenyen reagálnak a kémiai környezet változásaira így a módszer erről ad információt. Az NMR spektroszkópusok alapvetóen a proteinek oldatfázis zisú szerkezetét képesek vizsgálni. Fontos információk nyerhetőek a fehérjék dinamikus viselkedéséről is

40 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása NMR módszer m lépéseil

41 Fehérj rjék k szerkezetének meghatároz rozása NMR spektroszkópia pia

42