FEHÉRJESZINTÉZIS: a transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa. Bay Péter

Átírás

1 FEHÉRJESZINTÉZIS: a transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa Bay Péter

2 Fehérjeszintézis és poszttranszlációs módosítások A kódszótár A riboszóma szerkezete A fehérjeszintézis (transzláció) lépései i. Iniciáció ii. Peptidkötés képződése; peptidil-transzferáz iii. Elongáció és termináció A fehérjeszintézis gátlószerei Antibiotikumok Poszttranszlációs módosítások i. A fehérjék irányítása (targeting) ii. Foszforiláció, glikolizáció iii. Proteolízis

3 A kódszótár 64 kodont (nukleotidhármast) tartalmaz (A, G, C, U) 4 3 = 64 A nukleotidok és az aminosavak 1:1 megfelelése esetén az mrns csak 4 aminosavat kódolhatna, míg 2:1 esetében 4 2 =16 aminosavat. Ez utóbbi sem elégséges a fehérjékben előforduló 20-féle aminosav beépítésére. A nukleotidhármast tartalmazó genetikai kód, amikor az mrns-ben lévő 4 különböző bázis mindegyike a kodonban 3 lehetséges helyen fordulhat elő pedig 4 3 =64 különböző kodont alakít ki. a fehérjeszintézis során mindegyik kodonnak van jelentése 19 aminosavat 60 kodon határoz meg AUG (metionin) a startkodon - a láncközi metionint is ez jelöli 3 stopkodon (nonsense kodon): UAA, UAG, UGA

4 A kódszótár UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Phe Leu Leu Val Ile Met Ser Pro Thr Ala Tyr Stop His Gln Asn Lys Asp Glu Cys Arg Ser Arg Gly Stop Trp

5 A kódszótár 64 kodont (nukleotidhármast) tartalmaz (A, G, C, U) 4 3 = 64 a fehérjeszintézis során mindegyik kodonnak van jelentése 19 aminosav (60 kodon) 3 stopkodon (nonsense kodon): UAA, UAG, UGA AUG (metionin) a startkodon (a láncközi metionint is ez jelöli) A Met és a Trp kivételével a többi aminosavat egynél több kodon határoz meg: a genetikai kód degenerált 5 aminosavat már az első két nukleotid meghatároz 3 aminosavnak (Arg, Leu és Ser) hat kodonja van

6 UUU UUC UUA UUG Phe Leu UCU UCC UCA UCG A kódszótár Ser UAU UAC UAA UAG Tyr Stop UGU UGC UGA UGG Cys Stop Trp CUU CUC CUA CUG Leu CCU CCC CCA CCG Pro CAU CAC CAA CAG His Gln CGU CGC CGA CGG Arg AUU AUC AUA AUG Ile Met ACU ACC ACA ACG Thr AAU AAC AAA AAG Asn Lys AGU AGC AGA AGG Ser Arg GUU GUC GUA GUG Val GCU GCC GCA GCG Ala GAU GAC GAA GAG Asp Glu GGU GGC GGA GGG Gly A genetikai kód univerzális, néhány kivétel azonban ismert: az E. coliban az UGA szelenociszteint is kódol. A mitokondrium kódszótára is különbözik csekély mértékben.

7 Transzfer RNS: trns A trns az adapter szerepét látja el a fehérjeszintézisben: három jellegzetes hurok antikodon (7 nukleotidból áll) D-hurok (dihidrouridint tartalmaz) T-hurok (timidinpszeudouridin-citidin szekvencia) CCA-3 véghez kapcsolódik a szállított aminosav dihidrouridin: D pszeudouridin:

8 A trns szerkezete

9 Kodon antikodon kölcsönhatás

10 Kodon antikodon kölcsönhatás a kodon-antikodon kapcsolat komplementer a kodon 3. helyén lévő bázisa és az antikodon 1. helyén lévő bázisa közötti kapcsolat nem olyan szigorú: lötyögős ezért az adott trns több kodont is felismerhet (nem kell 61 trns) lötyögési szabályok C = G vagy I (inozin) A = U vagy I G = C vagy U U = A, G vagy I 3 trns Met 5 U A C A U G 5 mrns 3 trns Leu 3 5 egy trns Leu két leucin kodont is felismer G A U lötyögős bázis C U A 5 mrns G 3

11 Inozin = Citidin Lötyögő bázispárok Inozin = Adenozin Inozin = Uridin Guanozin = Uridin A lötyögési szabályok figyelembevételével legalább 31 trns szükséges a 61 kodon felismeréséhez, ennek ellenére kb. 50 trns található a sejtek fehérjeszintetizáló készletében.

12 Az aminosavak aktiválása: aminoacil-trns-szintetázok aminoacil-trns-szintetázok kapcsolják az aminosavakat a trns molekulákhoz az mrns 20 különböző aminosavat kódolhat mindegyik aminosavnak specifikus aminoacil-trns-szintetáza van egyféle aminosavnak több adapter trns molekulája is lehet azonos aminosavat kódoló trns molekulákhoz ugyanaz a specifikus aminoacil-trns-szintetáz kapcsolja az aminosavat mindegyik aminoacil-trns-szintetázhoz kapcsolódik: a megfelelő aminosav ATP a megfelelő trns molekula vagy molekulák

13 R O aminosav trns ATP - = H 2 N-C-C-OH H - 3 R O adenilált (aktivált) aminosav PPi - = H 2 N-C-C-O-P-O-ribóz-adenin H - Aminosavak aktiválása: a trns feltöltése AMP R - = H 2 N-C-C-O - H O Indirekt energizálása a peptid kötés kialakulásának aminosav- trns (feltöltött trns)

14 Hírvivő RNS: mrns 5 sapka m 7 Gppp 5 -nemkódoló régió startkodon AUG kódoló régió 3 -nemkódoló régió UGA stopkodon AAUAAA (AAAA) n 3 poli(a) farok

15 Olvasási keret az AUG kodon jelzi az mrns-en a polipeptidlánc szintézisének startpontját. az olvasási keret a startkodon első nukleotidjától a stopkodonig tart....agagcgga.aug.gca.gag.ugg.cua.agc.aug.ucg.uga.ucgaauaaa... MET.ALA.GLU.TRP.LEU.SER.MET.SER frameshift - kereteltolódással járó mutáció (példánkban deléció)...agagcgga.aug.gca.ga.ugg.cua.agc.aug.ucg.uga.ucgaauaaa... az új olvasási keret hibás aminosavsorrendet eredményez...agagcgga.aug.gca.gau.ggc.uaa.gcaugucgugaucgaauaaa... MET.ALA.ASP.GLY stopkodon

16 A transzlációt befolyásoló mutációk hemoglobin Wayne (a 3 -terminális vég frameshift mutációja) Normális -globin.acg.ucu.aaa.uac.cgu.uaa.gcu GGA GCC UCG GUA.THR.SER.LYS.TYR.ARG A kékkel jelölt U bázis deléciója miatt: stopkodon Wayne -globin.acg.uca.aau.acc.guu.aag.cug.gag.ccu.cgg.uag.thr.ser.asn.thr.val.lys.leu.glu.pro.arg mutált régió stopkodon missense mutáció (pl. AGC Ser módosul AGA Arg) nonsense mutáció (pl. UGG Trp módosul UGA Stop) sense (továbbolvasó) mutáció (pl. UAA Stop módosul CAA Gln-ra a hemoglobin Constant Spring formában) néma mutációk (pl. CUA Leu változik CUG Leu) a transzlációt nem befolyásolják

17 A riboszómák: egy kisebb és egy nagyobb alegységből álló ribonukleoprotein részecskék prokarióta riboszóma 50S alegység 23S rrns 5S rrns 35 különböző fehérje 70S riboszóma 30S alegység 16S rrns 21 különböző fehérje eukarióta riboszóma 60S alegység 28S rrns 5S rrns 5.8S rrns 49 különböző fehérje 80S riboszóma 40S alegység 18S rrns 33 különböző fehérje

18 Riboszóma ciklus a transzláció 5 3 irányban folyik az mrns molekulán az aminosavmaradékok az N-terminálissal kezdődően épülnek be nagy riboszóma alegység szintetizálódó peptidlánc N N 5 AUG UGA kis riboszóma alegység A poliszómát az mrns-sel összefűzött riboszómák alkotják. az alegységek disszociálnak INICIÁCIÓ ELONGÁCIÓ TERMINÁCIÓ

19 Iniciáció prokariótákban és eukariótákban A prokarióta mrns egyik belső AUG kodonjánál következik be az iniciáció Az E. coli lac operonját egyetlen policisztronos mrns kódolja több iniciációs AUG kodonnal lac I P O lac Z lac Y lac A AUG AUG AUG AUG 5 SD AUG AUG SD AUG iniciációs kodon Shine-Dalgarno szekvenciával belső Met kodon Shine-Dalgarno szekvencia nélkül iniciációs kodon Shine-Dalgarno szekvenciával A szintézis az N-terminális N-formil-metionin (fmet) beépítésével kezdődik. Az mrns olvasása 5 3 irányban.

20 Elongáció a prokariótákban mrns 30S Aminoacil hely Aminoacil trns E P A 50 S Peptidil hely Peptidil trns Üres (empty) hely AA 2

21 Termináció Prokariótákban három terminációs faktor van: RF 1 felismeri az UAG és UAA stopkodonokat. RF 2 felismeri az UGA és UAA stopkodonokat RF 3 a riboszóma szétesését segíti elő Eukariótákban egyetlen terminációs faktor (release factor: erf) van.

22 Eukarióta Prokarióta

23 A fehérjeszintézis iniciációja eukariótákban: az mrns kötődése eif-2 Met A trns met kötődik a kis alegységhez az eukarióta iniciációs faktor-2 (eif-2) segítségével 40S alegység A kis alegység a mrns 5 -sapka régiója utáni első AUG kodont felismeri (scanning) 5 -sapka AUG mrns

24 az AUG iniciációs kodon felismerése GTP hidrolizál GDP-vé eif-2a-gdp disszociál a komplexről (és több más molekula is ) a nagy riboszóma alegység kötődik 60S alegység eif-2a GDP M 5 AUG mrns 40S alegység

25 M A 5 AUG GCC mrns aminoacil-trns kötődik az A-helyhez M A létrejön az első peptidkötés 5 AUG GCC mrns az iniciáció befejeződik

26 A peptidkötés kialkulása P-hely NH 2 CH 3 -S-CH 2 -CH 2 -CH O=CC O trns A-hely NH 2 CH 3 -CH O=C O trns a peptidkötés kialakulását a peptidil-transzferáz katalizálja a peptidkötéshez szükséges energiát a trns feltöltésével az ATP szolgáltatja képződött peptid a P-helyről átkerül az A-helyre; az üres trns disszociál a P-helyről NH 2 CH 3 -S-CH 2 -CH 2 -CH O=C NH CH 3 -CH O=C OH O trns trns

27 Nagy riboszóma alegység 23S rrns (narancs és fehér) alkotja a peptidil-transzferáz egységet Adenin-2451 vesz részt a sav-bázis katalízisben Cech (2000) Science 289: Ban et al. (2000) Science 289: Nissen et al. (2000) Science 289:

28 Elongáció P PP P P a peptidkötés kialakulása után a szabad trns disszociál a P-helyről UCA GCA GGG UAG EF-1 a riboszóma egy kodonnal továbbcsúszik az mrns-en, a peptid-trns átkerül az A-helyről a P-helyre; a transzlokációt az elongációs faktor EF-2 biztosítja EF-2 P P P P P A a következő aminoacil-trns kötődik az A-helyhez; ehhez szükséges az EF-1 elongációs faktor UCA GCA GGG UAG az elongációhoz szükséges energiát két GTP hidrolízise szolgáltatja: egyik a transzlokációt, másik az aminoacil-trns kötődését biztosítja.

29 Termináció RF P P P P P UCA GCA GGG UAG amikor a transzláció stopkodonhoz ér a terminációs (release) faktor (RF) felismeri a stopkodont és kötődik az A-helyhez P P P P P P P P UCA GCA GGG UAG az RF katalizálja az elkészült polipeptidlánc hidrolízisét a hordozó trns-ről; a riboszóma disszociál

30 Fehérjeszintézis a mitokondriumokban Eltér az eukarióta sejt citoszoljában lévő transzlációs berendezéstől és a prokarióta riboszómára emlékezetet. A transzláció a mitokondrium matrixban történik. A mitokondriális DNS 2 rrns-gént 22 trns-gént és 13 fehérjét kódol. A többi mitokondriális fehérjét a nukleáris DNS kódolja. Csak 22 trns van, több a kodon-antikodon lötyögés. Négy eltérés is van az univerzális genetikai kódszótárban, pl. az UGA stopkodon a mitokondriumban triptofánt jelent. Az arginin két kodonja (AGA és AGG) viszont a mitokondriumban stopkodonként szolgál. A mitokondriális mrns-nek nincs 5 -sapkája, de van 3 -poli-a-farok régiója.

31 Antibiotikumok és toxinok gátolják a transzlációt (fehérjeszintézist) A fehérjeszintézis mechanizmusában részt vevő komponensek működésének a gátlása az egyik igen gyakran használt fegyver a kórokozó baktériumok ellen. A módszer alapja, hogy a prokarióták és eukarióták ribiszómái és transzlációs faktorai (fehérjéi) különböznek egymástól és így bizonyos vegyületek gátolják a fertőzést okozó baktériumok transzlációját és ezzel szaporodásukat (baktreiosztatikus hatásúak), míg a gazdaszervezet sejtjeiben a fehérjeszintézist nem károsítják. Az antiobiotikumok bizonyos gombák által termelt vegyületek, illetve ezek szintetikus származékai.

32 Fehérjeszintézis inhibitorok Inhibitor Mely szakaszt befolyásolja Kötőhely Kasugamycin trns kötődés 30S subunit Streptomycin iniciáció, elongáció 30S subunit Tetracycline aminoacil trns kötődés A-site Erythromycin peptidil transferáz 50S subunit Lincomycin peptidil transferáz 50S subunit Clindamycin peptidil transferáz 50S subunit Chloramphenicol peptidil transferáz 50S subunit

33 Poszttranszlációs módosítások - a polipeptidlánc további sorsa Bay Péter

34 A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások - Fehérje érés az ER-ben - Limitált proteolízis - Reverzibilis foszforiláció - Glikoziláció - Glikálás - Fehérje hidroxilálás

35 A fehérjék sejtorganellumba irányítása: szekréció 3. Az SRP kapcsolódik az SRP-receptorhoz az ER membrán citoszol felőli oldalán, a szignálpeptidet egy pórushoz irányítja 2. A szignál felismerő részecske a (SRP) kötődik a szignálpeptidhez b : a transzláció szünetel SRP SRP-receptor ER lumen c citoszol 5 AUG 1. A transzláció a citoszolban indul A riboszómák kötődése a durva endoplazmás retikulum membránjához a szignál felismerő részecske (signal recognition particle:srp) fehérjéből és RNS-ből áll; kötődik a szignálpeptidhez, a riboszómához és az ER membrán SRP-receptorához b szignálpeptid kb aminsavból áll a fehérje N-terminális részén (nem mindig) és elsősorban hidrofób, apoláris aminosavakból áll c ER = durva endoplazmás retikulum (riboszómákat tartalmaz kötött formában)

36 4. A transzláció szünetel, a polipeptid az ER lumenjéhez kerül 5. A szignál-peptidáz, amelyik az ER lumenjében van, lehasítja a szignálpeptidet citoszol ER lumen szignál-peptidáz 5 6. AZ SRP felszabadul, újabb ciklusban vehet részt 7. A riboszóma kapcsolódik az ER membránhoz; a durva endoplazmás retikulumon poliszóma alakul ki

37 8. A transzláció folytatódik: a polipeptid az ER lumenjébe kerül 9. A transzláció befejeződik, a kész fehérje az ER-en belül tovább módosul a szekréció előtt ER lumen A kész fehérje módosítások után szekretálódik citoszol 5 UGA

39 A proteolízis fajtái NH 2 COO _ NH 2 COO _ NH 2 COO _ Limitált proteolízis Degradáció

40 A proteolítikus enzimek felosztása Endopeptidázok Exopeptidázok NH 2 COO _ NH 2 COO _ NH 2 COO _ NH 2 Aminopeptidases Peptidyl-peptidases COO _ Carboxypeptidases Peptidyl-dipeptidases NH 2 COO _

41 -Emésztőenzimek aktiválódása -Sebgyógyulás, csontképződés - Metasztázis képzés, sejtmozgás az extracelluláris mátrixban - Polipeptid hormonok képződése - Virális polipeptidek processzálása - Szignáltranszdukció - Véralvadás A proteolízis biológiai jelentősége

43 Fehérje foszforiláció-defoszforiláció ADP- P ADP Protein kináz(ok) Protein Protein- P Protein foszfatáz(ok) P H 2 O

44 A reverzibilis foszforiláció-defoszforiláció típusai Módosított aminosav Sejtélettani hatás szerin treonin foszfo-szerin foszfo-treonin Pleiotrop hatású foszforiláció tirozin foszfo-tirozin Általában sejtfelszíni receptorhoz kötött foszforiláció. Általában a sejtproliferációt szabályozza. proliferáció

46 Az N- és O-glikoziláció összehasonlítása N- linked oligosaccharides O- linked oligosaccharides akceptor aminosav Asn Ser, Thr, hydroxylysin mikor? kotranszlációs poszttranszlációs kompartment ER, Golgi főleg Golgi (RER is) hordozó (carrier) dolikol - foszfát nincs hogyan? en bloc egyenként a szenhidrat lanc tipusos hossza monoszacharid egység 1-3 monoszacharid egység (kivétel: ABO vércsoport antigének) alcsoportok mannózban komplex N/A gazdag glikoproteinek NacGlc, Man NacGlc, Man Fuc, Gal, sziálsav

47 1,2 1,6 KÖZÖS ALAPVÁZ 1,2 1,3 1,6 1,4 1,4 Asn 1,2 1,2 1,3 MANNÓZ GAZDAG TÍPUS KÖZÖS ALAPVÁZ 2,3 1,4 1,2 1,6 1,4 1,4 Asn 2,6 1,4 1,2 1,3 KOMPLEX TÍPUS Sziálsav (N-Acetil-neuraminsav) N-Acetil-glükózamin Mannóz Galaktóz

48

50 Nem enzimatikus glikálás Hemoglobin, kollagén, szérum albumin, stb. vércukorszint függő módosítása. Hemoglobin A1c (minor Hgb frakció). C-1 glükóz + hemoglobin N terminusa = stabil kovalens Schiff bázis. glikált HbA1c: norm: 3-5% (diab.: 8-12%) az előző 3-6 hét vércukor szintjéről informál glikált szérum albumin: norm: 12% (diab.: 16-22%) az előző 1-2 hét vércukor szintjéről informál Az antidiabetikus terápia beállításának ellenőrzésében hasznos.

52 Fehérje Hidroxiláció Kollagén: tripla helix; Hidroxiprolin és hidroxilizin aminosavak felelősek a láncon belüli H-hidak kialakításáért, ami a szerkezeti stabilitás alapja.

53 Skorbut 1800-as évek A skorbut problémája megoldódott

54 Hidroxilálás és a C -Vitamin C Vitamin hiány (Skorbut): kötőszöveti betegség Jellemzői: Fáradtság, depresszió, ínygyulladás (gums), petechiak, csökkent sebgyógyulás Ok: nem képes hidroxiprolint (a kollagénben előforduló módosított aminosav) előállítani A hidroxiprolint a fehérje poszttranszlációs módosítása során a prolil hidroxiláz állítja elő. Az enzim Fe 2+ -t igényel a reakcióhoz, ami a reakció során Fe 3+ -O alakul.. Aszkorbinsav (C Vitamin) antioxidánsként regenerálja a Fe 2+ -t.