(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1731 A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1731 B (1) Int. Cl.: C12N 1/09 (06.01) A61K 3/12 (06.01) A61K 38/00 (06.01) A61K 39/00 (06.01) A61K 48/00 (06.01) A61P 3/00 (06.01) G01N 33/3 (06.01) G01N 33/74 (06.01) C12P 21/02 (06.01) C07K 14/82 (06.01) C07K 16/32 (06.01) C12N /07 (.01) C12N / (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/JP 0/ () Elsõbbségi adatok: JP (72) Feltaláló: SUGIYAMA, Haruo, Osaka, (JP) (73) Jogosult: International Institute of Cancer Immunology, Inc., Suita-shi, Osaka (JP) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) WT1-eredetû rákantigénpeptidek HU T2 A leírás terjedelme oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.

2 A találmány tárgyköre A találmány tárgyát WT1-eredetû rákantigénpeptidek alkalmazása képezi. A technika állása A WT1 gént (Wilm-féle 1¹es tumorgén) a gyermekkori vesedaganatok közé tartozó Wilm-féle daganat egyik okozójaként számon tartott génként azonosították [Cell, 09, (1990); Nature 343, 774, (1990)]. A WT1 gén a WT1 transzkripciós faktort kódolja, és a WT1 számos folyamatban például sejtproliferációban, ¹differenciációban és ¹apoptózisban, illetve szöveti fejlõdésben tölt be fontos szerepet [Int. Rev. Cytol. 181, 11 (1998)]. A WT1 gént eredetileg tumorszuppresszor génként azonosították, a további vizsgálatok azonban fényt derítettek arra, hogy a WT1 gén leukémiában és különféle szilárd rákos megbetegedésekben így tüdõrákban és mellrákban expresszálódik, ami arra utal, hogy a WT1 gén inkább a daganatok növekedését elõmozdító onkogénként funkcionál. Továbbá, in vitro azt is kimutatták, hogy periferiális vérbõl származó, HLA A*01¹re vagy HLA A*22¹re pozitív mononukleáris sejtek WT1-eredetû peptidekkel való serkentésekor a peptidre specifikus, citotoxikus T¹limfocitákat (CTL¹ek) indukálnak és aminek következtében a leukémiából vagy szilárd daganatból származó, endogén WT1¹et expresszáló sejtek elpusztulnak. Ezen eredmények demonstrálták, hogy a WT1 a rák elleni immunterápia ígéretes célpontja [Int. J. Hematol 76, 127 (02)]. Azonban annak tisztázására eddig még nem került sor, hogy vajon a WT1 tartalmazza¹e a HLA A26 antigén megkötésére képes peptidrész(eke)t, illetve hogy van(nak)¹e egyáltalán ilyen peptid(ek) vagy sem. Ezenfelül, a HLA A*01-hez (a HLA A2 antigének egyik tagja) kötõdni képes rákantigénpeptid kötõszekvenciáját ugyan már kikövetkeztették [WO 00/1879 sz. nemzetközi közzétételi irat], eddig csak néhány rákantigénpeptid bizonyult hatékonynak [WO 00/062 sz. és WO 00/ sz. nemzetközi közzétételi iratok] A találmány leírása A találmány tárgyát WT1-eredetû rákantigénpeptidek, azok CTL-indukálóként való alkalmazása, és hasonlók képezik. A találmány oltalmi köre a szabadalmi igénypontokban van meghatározva. Intenzív kutatásokat folytattunk WT1-eredetû új rákantigénpeptidek azonosítása céljából. Ennek eredményeként feltártuk, hogy a SEQ ID NO: 2, 8 és 9 alatt meghatározott peptidek HLA A26¹ra korlátozott CTLeket képesek indukálni. Azaz, elõször mi ismertük fel, hogy a WT1 olyan rákantigénpeptid-rész(eke)t tartalmaz, amely(ek) a számos HLA antigénalosztály közül a HLA A26 antigénhez kötõdik(nek) és CTL¹ek felismerik õket. E felismerés olyan újszerû rák elleni vakcinaterápia kifejlesztéséhez vezetett, amely WT1¹re specifikus CTL-eket képes indukálni HLA A26¹ra pozitív rákos betegekben. A találmány szerinti, fentiekben említett WT¹1-eredetû rákantigénpeptid és az ezt kódoló polinukleotid és hasonlók CTL-indukálóként, nevezetesen rákvakcinaként, hatékonyan alkalmazhatók. Ezenfelül, a találmány szerinti rákantigénpeptidek kimutatásra szolgáló ágensként hatékonyan alkalmazhatók WT1¹re specifikus CTL¹ek kimutatására. A találmány e felismeréseken alapul. Eszerint, a találmány tárgyát képezik a következõk: (1) A SEQ ID NO: 2, 8 és 9 bármelyike alatt meghatározott aminosavszekvenciájú peptid alkalmazása HLA A26¹ra pozitív betegekben rákos megbetegedés kezelésére vagy gátlására szolgáló gyógyászati készítmény elõállítására. (2) Az (1) pont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyászati készítmény rákvakcina. (3) A SEQ ID NO: 2, 8 és 9 bármelyike alatt meghatározott aminosavszekvenciájú peptidet tartalmazó gyógyászati készítmény HLA A26¹ra pozitív betegekben rákos megbetegedés kezelésére vagy gátlására. (4) A (3) pont szerinti gyógyászati készítmény, amely CTL-indukálóként kerül alkalmazásra. () A (3) pont szerinti gyógyászati készítmény, amely rákvakcinaként kerül alkalmazásra. (6) Antigénbemutató sejt, amely bemutatja az (1) pontban leírt peptid és egy adott HLA A26 antigén közötti komplexet. (7) CTL, amely felismeri az (1) pontban leírt peptid és egy adott HLA A26 antigén közötti komplexet. (8) Az (1) pontban leírt peptidet tartalmazó HLAmonomer, ¹dimer, ¹tetramer vagy ¹pentamer egy adott HLA A26 antigénnel együtt. (9) Reagens a WT1-eredetû, HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptidre specifikus CTL¹ek kimutatására, ahol a reagens összetevõként a (8) pontban leírt HLA-monomert, ¹dimert, ¹tetramert vagy ¹pentamert tartalmaz. Eszerint a találmány tárgyát képezik a következõk: (1) Az emberi WT1-nek a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciájából származó peptid, amelynek HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptid aktivitása van; (2) A fenti (1) pont szerinti peptid, amely az emberi WT1-nek a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciájából egymással szomszédos 8 11 aminosavat tartalmaz vagy azokból áll; (3) A fenti (1) vagy (2) pont szerinti peptid, amely a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 vagy SEQ ID NO: 9 alatt megadott aminosavszekvenciát tartalmazza. (4) A SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 vagy SEQ ID NO: 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló rákantigénpeptid. () A fenti (1) (4) pontok bármelyikében leírt peptidet tartalmazó epitóppeptid. (6) A fenti (1) () pontok bármelyikében leírt peptidet kódoló polinukleotid. (7) A (6) pontban leírt polinukleotidot tartalmazó expressziós vektor. (8) A fenti (7) pontban leírt expressziós vektort tartalmazó sejt. (9) Eljárás az (1) () pontok bármelyikében leírt peptid elõállítására, amely során a fenti (8) pontban leírt sejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek mellett a peptid expresszálódhat. 2

3 () A fenti (1) (4) pontok bármelyikében leírt peptidet specifikusan kötõ antitest. (11) Antigénbemutató sejt, amelyen az emberi WT1-nek a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciájából származó, HLA A26¹ot kötõ, és a fenti (2) (4) pontok bármelyikében leírt rákantigénpeptid és HLA A26-antigén között létesült komplex bemutatásra kerül. (12) CTL, amely felismeri az emberi WT1-nek a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciájából származó, HLA A26¹ot kötõ, és a fenti (2) (4) pontok bármelyikében leírt rákantigénpeptid és HLA A26- antigén között létesült komplexet. (13) Gyógyászati készítmény, amely a fenti (1) () pontok bármelyikében leírt peptidet, a fenti (7) pontban leírt expressziós vektort, a fenti (8) pontban leírt sejtet, a fenti (11) pontban leírt antigénbemutató sejtet, vagy a fenti (12) pontban leírt CTL¹t, gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt tartalmazza. (14) A (13) pont szerinti gyógyászati készítmény, amely CTL-indukálóként kerül alkalmazásra. (1) A (13) pont szerinti gyógyászati készítmény, amely rákvakcinaként kerül alkalmazásra. (16) HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer vagy ¹pentamer, amely az emberi WT1-nek a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciájából származó, HLA A26¹ot kötõ, és a fenti (2) (4) pontok bármelyikében leírt rákantigénpeptidet és HLA A26-antigént tartalmaz. (17) Reagens a WT1-eredetû, HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptidre specifikus CTL¹ek kimutatására, amely reagens összetevõként a (16) pontban leírt HLAmonomert, ¹dimert, ¹tetramert vagy ¹pentamert tartalmazza. A találmány tárgyát WT1-eredetû rákantigénpeptidek, az ezeket kódoló polinukleotidok, az ezeket tartalmazó CTL-indukálók, és hasonlók képezik. A találmány szerinti CTL-indukáló rákvakcinaként alkalmazható. A találmány szerinti rákvakcina sok, HLA A26¹ra pozitív betegen alkalmazható Az ábrák rövid leírása 1. ábra: Azon kísérletek eredményeit bemutató grafikon, amelyekben a SEQ ID NO: 3 alatt meghatározott peptiddel ingerelt (pulzált) (kitöltött körök) vagy nem ingerelt (üres körök) T2¹célsejteken végzett serkentéssel indukált CTL¹ek citotoxikus aktivitását vizsgáltuk. Az ábra függõleges tengelyén a specifikus citotoxicitási aktivitás (specifikus lízis, %) a vízszintes tengelyen pedig az E/T arány (az effektorsejtek számának /E/ a célsejtek számához /T/ viszonyított aránya) van feltüntetve. 2. ábra: Azon kísérletek eredményeit bemutató grafikon, amelyekben a SEQ ID NO: 3 alatt meghatározott peptiddel TF¹1 sejtvonalon (HLA A*01¹re pozitív és WT1¹et expresszáló sejtvonal) (kitöltött körök) vagy JY sejtvonalon (HLA A*01¹re pozitív, viszont WT1¹et nem expresszáló sejtvonal) (üres körök) végzett serkentéssel indukált a CTL¹ek citotoxikus aktivitását vizsgáltuk. Az ábra függõleges tengelyén a specifikus citotoxicitási aktivitás (specifikus lízis, %) a vízszintes tengelyen pedig az E/T arány van feltüntetve. 3. ábra: Azon kísérletek eredményeit bemutató grafikon, amelyekben a SEQ ID NO: 2 alatt meghatározott peptiddel ingerelt (kitöltött oszlop) vagy nem ingerelt (üres oszlop) B¹LCL-célsejteken végzett serkentéssel indukált a CTL¹ek citotoxikus aktivitását vizsgáltuk. Az ábra függõleges tengelyén a specifikus citotoxicitási aktivitás (specifikus lízis, %) van feltüntetve. 4. ábra: Azon kísérletek eredményeit bemutató grafikon, amelyekben a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt meghatározott peptiddel ingerelt (kitöltött oszlop) vagy nem ingerelt (üres oszlop) B¹LCL-célsejteken végzett serkentéssel indukált a CTL¹ek citotoxikus aktivitását vizsgáltuk. Az ábra függõleges tengelyén a specifikus citotoxicitási aktivitás (specifikus lízis, %) van feltüntetve. A találmány kivitelezésének legjobb módja A találmány tárgya az emberi WT1-nek a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciájából származó, és HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptid aktivitású peptid. Az emberi WT1-nek a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciája ismert szekvencia [Cell,, 09 (1990); NCBI adatbázisban az elérési száma:xp_ és P1944]. Az emberi WT1 aminosavszekvenciája a SEQ ID NO: 1 alatt van megadva. HLA A26 antigénként a HLA A*21, HLA A*22, HLA A*23 és hasonlók ismertek. A találmány tárgya a HLA A*21-nek nevezett HLA A26 antigén. Japán lakosságának körülbelül %-ában van HLA A26 antigén. Elõször sikerült felderíteni azt, hogy a WT1 aminosavszekvenciája olyan, a HLA A26 antigénhez kötõdni képes rákantigénpeptid-részeket tartalmaz, amelyeket a CTL¹ek felismernek, és ez vezetett a találmány szerinti megoldáshoz. A leírás szerinti értelemben az olyan aktivitása, mint a HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptidnek kifejezés azt jelenti, hogy egy adott peptidnek HLA A26 antigént kötõ aktivitása van és a citotoxikus T¹sejtek (CTL¹ek) felismerik a kérdéses peptidet. A kifejezés a HLA A26 antigénhez való kötõdés és CTL¹ek indukálása (CTL¹t indukáló aktivitású), vagy a HLA A26 antigénhez való kötõdés és CTL¹ek aktiválása (CTL¹t indukáló aktivitású) kifejezések szinonimája. A találmány szerinti rákantigénpeptid azonosítható a SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvenciában lévõ egymással szomszédos 8 11 aminosavból álló peptidrész (peptidjelölt) szintetizálásával és annak vizsgálatával, hogy a peptidnek van¹e vagy sem olyan aktivitása, mint a HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptidnek. 3

4 A peptidek szintézise a peptidkémia terén általában alkalmazott eljárás szerint kivitelezhetõ. Ilyen eljárás az irodalomban ismert [ld. például Peptide Synthesis, kiad.: Interscience, New York (1966); The Proteins, 2. köt., kiad.: Academic Press Inc., New York (1976); Peptide Synthesis, Maruzen, Inc., (197); Peptide-Gosei no Kiso to Jikken, Maruzen, Inc., (198); és Iyakuhin no Kaihatsu (Zoku), 14. köt., Peptide Synthesis, Hirokawasyoten (1991)]. A már ismert eljárásokkal megvizsgálható [ld. például, Tissue Antigen 61, 136 (03); és az alábbi példákban leírt eljárások] az is, hogy a peptidjelölt a HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptid¹e vagy sem. Ugyanilyen módon az is elemezhetõ, hogy a peptidjelölt olyan peptid¹e, amelynek olyan aktivitása van, mint a HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptidnek. Specifikusan, elõször az HLA A26 antigénre pozitív emberi alanyból periferiális vérbõl származó mononukleáris sejteket (PBMC¹k) izolálunk, és a peptidjelölt hozzáadása után (impulzus) tenyésztjük a kérdéses sejteket. Tenyésztés után, a tenyészetet néhány naponként hozzáadott peptiddel ismételten többször serkentjük a peptidre specifikus CTL¹ek amplifikálása céljából. Ezután citokinek például CTL¹ek által termelt ¹IFN vagy a CTL¹ek citotoxikus aktivitásának mérésével kimutatjuk a CTL¹ek peptidre specifikus reakcióit. A citotoxikus aktivitás, például, az 1 Cr felszabadulás vizsgálatával [Int. J. Cancer, 8, 317 (1994)] vagy hasonlókkal mérhetõ. A vizsgálatban alkalmazható célsejtek közé tartoznak, például, WT1¹re pozitív és HLA A26¹ra pozitív, 1 Cr-mal jelzett sejtek. Specifikus példák közé tartoznak olyan, 1 Cr-mal jelzett sejtek, amelyeket HLA A26 gént (például, Genbank elérhetõségi szám: D14) kódoló gén, WT1¹re pozitív és HLA A26¹ra negatív leukémia-sejtvonalba való bevitelével állítunk elõ. Amennyiben a fenti vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a CTL¹ek pusztítják a sejteket vagy citokineket termelnek, akkor a peptidjelöltet HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptidként vagy HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptid aktivitású peptidként azonosítjuk. A találmány tárgyát a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazó peptid képezi. Az ilyen peptid hosszát tekintve nincs semmilyen megkötés, feltéve, hogy a peptid rendelkezik a HLA A26 antigént kötõ aktivitással és a peptidet felismerik a CTL¹ek. Azonban ismert, hogy a HLA antigénnel szembeni kötõaktivitású peptid (rákantigénpeptid) általában 8 11 aminosavból áll. Eszerint a peptidnek a találmány tárgyát képezõ és a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazó rákantigénpeptid-része olyan peptid, amely elõnyösen 9 11 aminosavból, elõnyösebben 9¹ aminosavból áll. Ennél is elõnyösebb, ha olyan rákantigénpeptid, amely a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazza, és legelõnyösebben a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt meghatározott aminosavszekvenciából áll. A találmány szerinti peptidek bizonyos határok között változtathatók, amennyiben a változtatás során aktivitásuk megmarad. A leírás szerinti értelemben az aminosavak változtatása kifejezés aminosavszubsztitúciót, ¹deléciót és/vagy ¹addíciót jelent [az addíció azon eseteket is magában foglalja, amikor a peptid N¹ vagy C¹terminálisához adunk további aminosava(ka)t]. Elõnyös az aminosavszubsztitúció. Amennyiben a változtatásban aminosavszubsztitúcióra kerül sor, bármilyen számú aminosav, bármilyen pozícióban szubsztituálható, feltéve, hogy a rákantigénpeptid aktivitása fennmarad. Azonban, mivel a HLA antigént kötõ peptid általában 8 11 aminosav hosszúságú, a változtatás elõnyösen egy vagy több aminosavat érint. Ezenfelül a találmány tárgyát olyan peptid (úgynevezett epitóppeptid) is képezi, amely a találmány szerinti peptidet helper peptiddel vagy más rákantigénpeptiddel együtt tartalmazza. Jelenleg számos (több), egymáshoz kapcsolt CTLepitópból (antigénpeptidek) álló peptidrõl ( epitóppeptid ) kimutatták, hogy hatékony, CTL-eket indukáló aktivitása van. Például leírták, hogy PSA rákantigén-fehérjébõl származó, HLA A2¹re, A3¹ra, A11¹re vagy B3¹ra korlátozott, egymással összekapcsolt CTL-epitópokat tartalmazó peptid (körülbelül ¹mer) a megfelelõ CTL-epitópokra specifikus CTL-eket indukált in vivo [Journal of Immunology, 161, (1998)]. Ezenfelül CTL-epitóp(ok) és helper epitóp(ok) ligálásával elõállított peptidrõl (epitóppeptid) kimutatták, hogy hatékonyan indukál CTL-eket. A leírás szerinti értelemben, a helper epitóp kifejezés olyan peptidet jelent, amely képes CD4+ T¹sejteket aktiválni [Immunity., 1, 71 (1994)]. Ilyen helper epitóp például, a hepatitis B vírus HBVd-jének aminosava, a tetanusztoxin TT aminosava stb. A helper epitóp által aktivált CD4+ T¹sejtek különféle aktivitásokat képesek kifejteni, így például a CTL¹ek indukálása és fenntartása, differenciálódás, és olyan effektorok aktiválása, mint amilyenek a makrofágok stb., és ennek révén a helper epitópot fontosnak tartják az immunológiai tumorellenes válaszok terén. Az olyan peptidre, amelyben helper epitóp(ok) és CTL-epitóp(ok) vannak egymáshoz kapcsolva, konkrét példaként leírták, hogy HBV-bõl származó HLA A2¹re korlátozott antigénpeptideket (6 peptid), HLA A11¹re korlátozott antigénpeptideket (3 peptid) és helper epitópot tartalmazó peptidet kódoló DNS (minigén) a megfelelõ epitópok elleni CTL-eket indukált hatékonyan in vivo [Journal of Immunology, 162, (1999)]. Tulajdonképpen, CTL-epitópot (a gp 0 melanómaantigén pozíciójának megfelelõ rákantigénpeptid) helper epitóphoz (tetanusztoxinból származó T¹helper epitóp) ligálva tartalmazó peptidet vetettek alá klinikai tesztnek [Clinical Cancer Res., 7, (01)]. Eszerint a találmány szerinti peptidek közé olyan epitóppeptidek is tartoznak, amelyekben több epitóp van összeligálva, köztük a találmány szerinti fent említett peptidek, és amelyeknek CTL¹t indukáló aktivitása van. Amennyiben a találmány szerint feltárt módon a rákantigénpeptidhez ligálandó epitóp CTL-epitóp (rákantigénpeptid), akkor az alkalmas CTL-epitópok közé tartoznak például olyan, WT1-eredetû CTL-epitópok, amelyek képesek kötni a következõket: HLA A*01, 4

5 A*04, A*0, A*06, A*07,¹A11, A24, A31, A*6801, B7, B8, B*270, B37, Cw*01 vagy Cw*02 [Int. J. Hematol., 76, 127 (02); Int. J. Hematol., 78, 6 (03); WO 00/062 sz. és WO 00/1879 sz. nemzetközi közzétételi iratok]. E CTL-epitópok közül többet is össze lehet kapcsolni. A különféle HLA-molekulákhoz kötött antigének analízise alapján egyetlen CTL-epitóp hossza körülbelül 8 14 aminosav lehet [Immunogenetics, 41, 178 (199)]. Amennyiben a találmány szerint a rákantigénpeptidhez ligálandó epitóp helper epitóp, az alkalmazható helper epitópok közé tartozik például a fent említett, hepatitis B vírusból származó HBVd 28 1, tetanusztoxinból származó TT , WT1-eredetû helper epitóp (Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His, SEQ ID NO: ), és hasonlók. A helper epitóp körülbelül 13 aminosav, elõnyösen körülbelül aminosav hosszúságú lehet. Elõnyösen, a találmány szerinti epitóppeptidek a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott epitóppeptid és helper peptid. Elõnyösebben, a példák közé tartoznak az következõ epitóppeptidek: a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet és a SEQ ID NO: alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet tartalmazó epitóppeptid, a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet és tetanusz toxin-eredetû helper peptidet (például, Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu; SEQ ID NO: 6) tartalmazó epitóppeptid, illetve a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet és egy másik peptidet (Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu; SEQ ID NO: 7) [Clinical Cancer Res., 7, (01)] tartalmazó epitóppeptid. Több összeligált epitópot tartalmazó peptid (epitóppeptid) elõállítható a peptidszintézisre alkalmazott szokásos eljárással a fentiekben leírtak szerint. Több összeligált epitópot tartalmazó epitóppeptidet kódoló polinukleotiddal kapcsolatos szekvenciainformáció alapján, a szokásos DNS-szintézis eljárással és génsebészeti úton is elõállítható epitóppeptid. Elõnyösen, több összeligált epitópot tartalmazó epitóppeptid elõállítható oly módon, hogy a polinukleotidot ismert expressziós vektorba illesztjük, az eredményül kapott rekombináns expressziós vektorral gazdasejtet transzformálunk, a kapott transzformált sejteket tenyésztjük, és a tenyészetbõl kinyerjük a találmány tárgyát képezõ, több összeligált epitópot tartalmazó epitóppeptidet. Az eljárás végrehajtható, például, az irodalomban leírt valamelyik eljárás [ld.: Molecular Cloning, szerk.: Maniatis és mtsai., kiad.: CSH Laboratory (1983), DNA Cloning; szerk.: Glover, kiad.: IRL PRESS (198)] vagy az alábbiakban leírt eljárás alkalmazásával. Az így elõállított, több összeligált epitópot tartalmazó epitóppeptid CTL¹t indukáló aktivitása vizsgálható, például, a fentiekben említett 1 Cr-felszabadítási vizsgálattal. A találmány szerinti, fentiekben leírt peptidek (ideértve az epitóppeptideket) módosíthatók az N¹terminális aminosav aminocsoportján és/vagy a C¹terminális aminosav karboxilcsoportján. Eszerint, a találmány szerint feltárt peptidek oltalmi körébe tartoznak olyan peptidek, amelyek N¹terminális és/vagy C¹terminális aminosava módosítva van. Az N¹terminális aminosav aminocsoportjának módosítására szolgáló csoportba tartozik, például, a következõk közül választott 1 3 csoport: C 1 6 -alkilcsoport, fenilcsoport, cikloalkilcsoport és acilcsoport. Acilcsoportok közé tartoznak a következõk: C 1 6 -alkanoilcsoport, fenilcsoporttal szubsztituált C 1 6 -alkanoilcsoport, C 7 -cikloalkilcsoport, C 1 6 -alkil-szulfonilcsoport, fenil-szulfonil-csoport, C 2 6 -alkoxi-karbonilcsoport, fenilcsoporttal szubsztituált alkoxi-karbonilcsoport, C 7 -cikloalkilcsoporttal szubsztituált karbonilcsoport, fenoxi-karbonil-csoport, és hasonlók. C-terminális aminosavuk karboxilcsoportjánál módosított peptidek közé tartoznak, például, észterek és amidok. Észterek közé tartoznak C 1 6 -alkil-észterek, fenilcsoporttal szubsztituált C 1 6 -alkil-észterek, C 7 - cikloalkil-észterek, és hasonlók. Amidok közé tartoznak elõnyösen az egy vagy két C 1 6 -alkil-csoporttal szubsztituált amidok; egy vagy két, fenilcsoporttal szubsztituált C 1 6 -alkil-csoporttal szubsztituált amidok; amidcsoport nitrogénatomját magában foglaló, 7 tagú azacikloalként képezõ amidok, és hasonlók. A fent említett peptidet kódoló polinukleotid is a találmány tárgyát képezi. A találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotid lehet DNS vagy RNS formájában. A találmány szerinti polinukleotidok könnyen elõállíthatók a találmány szerinti peptidet kódoló aminosavszekvenciával vagy a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotidszekvenciával kapcsolatos információk alapján. Elõnyösen, a szintézis végezhetõ a DNS-szintézisre szolgáló általános eljárással vagy PCR-rel végzett amplifikálással. A SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából és helper epitópból álló peptidet tartalmazó epitóppeptidet kódoló polinukleotidok is a találmány tárgyát képezik. A SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet és a SEQ ID NO: alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet tartalmazó epitóppeptidet, a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet és tetanusztoxin-eredetû helper peptidet (például, Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu; SEQ ID NO: 6) tartalmazó epitóppeptidet, illetve a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptidet és egy másik peptidet (Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu; SEQ ID NO: 7) [Clinical Cancer Res., 7, (01)] tartalmazó epitóppeptidet kódoló polinukleotid. A találmány szerinti peptidet expresszáló rekombináns expressziós vektor elõállítható a fentiekben elõállított polinukleotid expressziós vektorba való beépítésével. A célra alkalmas expressziós vektor kiválasztható az alkalmazott gazda, cél, és hasonlók ismeretében, és idetartoznak plazmidok, fágvektorok, vírusvektorok és hasonlók.

6 Amennyiben a gazda Escherichia coli, alkalmas vektorok közé tartoznak, például, plazmidvektorok, például puc118, puc119, pbr322, pcr3, és hasonlók, és fágvektorok, például, ZAPII, gt11 és hasonlók. Ha a gazda élesztõ, alkalmas vektorok közé tartozik, például, a pyes2, pyeura3 és hasonlók. Amennyiben a gazda rovarsejt, alkalmas vektorok közé tartozik, például, a pacsghisnt¹a és hasonlók. Amennyiben a gazda állati sejt, alkalmas vektorok közé tartoznak, például, plazmidvektorok, így a pkcr, pcdm8, pgl2, pcdna3.1, prc/rsv, prc/cmv és hasonlók, illetve vírusvektorok, így retrovírus-vektor, adenovírus-vektor, adeno-asszociált vírus vektor, és hasonlók. A fenti expressziós vektorok adott esetben tartalmazhatnak olyan faktor(oka)t, mint amilyen az expresszió indukálására képes promoter (expressziót indukáló promoter), szignálszekvenciát kódoló gén, szelekcióra alkalmas markergén, terminátor, és hasonlók. Ezenfelül az expressziós vektor tartalmazhat további, a peptid tioredoxinnal, His-toldalékkal, GST-vel (glutation-s-transzferáz) vagy hasonlókkal képzett fúziós fehérjeként való expresszálására szolgáló, vagy az izolálást és tisztítást elõsegítõ szekvenciákat. Ilyen esetekre alkalmas vektorok közé tartoznak a következõk: gazdasejtekben mûködõ megfelelõ promotert (lac, tac, trc, trp, CMV, SV korai promoter stb.) tartalmazó GST-fúziósfehérje-vektorok, például pgex4t; toldalék szekvenciát (Myc, His stb.) tartalmazó vektorok, például pcdna3.1/myc-his; és tioredoxinnal és His-toldalékkal képzett fúziós fehérje expresszálására képes vektorok, például pet32a. A találmány szerinti, vektort tartalmazó transzformált sejtek elkészíthetõk a gazdasejtek fentiekben leírtak szerint elõállított expressziós vektorral végzett transzformációjával. Alkalmas gazdasejtek közé tartoznak Escherichia coli-eredetû, élesztõ¹, rovar- és állati sejtek. Escherichia colival kapcsolatos példák közé tartoznak E. coli K¹12 törzsek, például HB1, C0, JM9, DHa és AD494 (DE3). Élesztõvel kapcsolatos példák közé tartozik a Saccharomyces cerevisiae. Állati sejtekkel kapcsolatos példák közé tartozik az L929, BALB/c3T3, C127, CHO, COS, Vero és Hela sejtek. Rovarsejtekkel kapcsolatos példák közé tartozik az Sf9. Expressziós vektor gazdasejtekbe történõ bevitele végrehajtható a vonatkozó fenti gazdasejtekre alkalmas hagyományos eljárás alkalmazásával. Elõnyösen a bevitel kalcium-foszfát-eljárással, DEAE-dextrán-eljárással, elektroporációs eljárással és géntranszferre szolgáló lipid (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL) alkalmazásával végzett eljárással történhet. Az expressziós vektort tartalmazó transzformált sejtek szelektálhatók az indukálás után a gazdasejtek egy adott szelekciós markert tartalmazó hagyományos tápoldatban való tenyésztésével. A találmány szerinti peptid elõállítható a transzformált sejtek megfelelõ körülmények között (olyan körülmények, amelyek között a peptidek expresszálhatók) végzett tenyésztésével. Az eredményül kapott peptid standard biokémiai tisztítási eljárások alkalmazásával tovább izolálható és tisztítható. A tisztítási eljárások közé tartozik a kisózás, ioncserélõ kromatográfia, abszorpciós kromatográfia, affinitáskromatográfia, gélszûréses kromatográfia, és hasonlók. Amennyiben a találmány szerinti peptid tioredoxinnal, His-toldalékkal, GST-vel vagy hasonlókkal (lásd fenn) képzett fúziós fehérjeként került expresszálásra, a peptid izolálható és tisztítható a fúziós fehérjére vagy toldalékra jellemzõ tulajdonságok alkalmazásával végzett megfelelõ tisztítási eljárással. A találmány tárgya antitest, amely specifikusan köti a találmány szerinti peptidet. A találmány szerinti antitest egyetlen formára sem korlátozódik, és olyan poliklonális vagy monoklonális antitest lehet, amely a találmány leírásában antigénként ismertetett peptid ellen lett elõállítva. A fentiekben említettek szerint, a találmány szerinti antitestre vonatkozóan nincs semmilyen megkötés, feltéve, hogy a kérdéses antitest specifikusan köti a találmány szerinti peptidet. Ilyen antitestek például azok, amelyek specifikusan kötik a SEQ ID NO: 2,8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciát tartalmazó peptidet. Antitestek elõállítására szolgáló eljárások ismertek a technikában és ilyen hagyományos eljárásokkal [Current protocols in Molecular Biology, szerk.: Ausubel és mtsai., kiad.: John Wiley and Sons. (1987); Antibodies; A Laboratory Manual, szerk.: Lane, és mtsai., kiad.: Cold Spring Harber Laboratory Press, New York (1989)] elõállíthatók a találmány szerinti antitestek. Elõnyösen antitestek elõállíthatók nem emberi állat, például nyúl immunizálásával antigénként a találmány szerinti peptidet alkalmazva, és az antitestek hagyományos módon történõ kinyerésével az immunizált állat szérumából. Másfelõl monoklonális antitestek elõállíthatók nem emberi állat, például egér, a találmány szerinti peptiddel végzett immunizálásával, majd a kapott lépsejtek mielómasejtekkel végzett sejtfúziójával, és az antitestek kinyerésével az eredményül kapott hibridómasejtekbõl [Current protocols in Molecular Biology, szerk.: Ausubel és mtsai., kiad.: John Wiley and Sons (1987)]. Továbbá a találmány szerinti peptid elleni antitestek elõállíthatók úgy, hogy az immunválaszt a gazdától függõ különféle adjuvánsok alkalmazásával fokozzuk. Ilyen adjuvánsok közé tartoznak például a következõk: Freund-adjuváns; ásványi gélek, például alumíniumhidroxid; felületaktív anyagok, például lizolecitin, Pluronic poliol, polianion, peptid, olajemulzió, kürtõscsiga hemocianinja és dinitrofenol; emberi adjuvánsok, például BCG (Bacille de Calmette-Guerin) vagy Corynebacterium, és hasonlók. Ahogyan a fentiekben említettük, a találmány szerinti peptidet felismerõ antitestek és a találmány szerinti peptid aktivitását semlegesítõ antitestek könnyen elõállíthatók egy adott állatnak a találmány szerinti peptiddel hagyományos módon végzett immunizálásával. Az antitestek alkalmazhatók affinitáskromatográfiához, immundiagnosztikai eljárásokhoz és hasonlókhoz. Immunológiai diagnosztikai eljárások, az adott célnak megfe- 6

7 lelõen, például a következõk közül választhatók: immunblottolás, radioimmunvizsgálat (RIA), enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA), fluoreszcens vagy lumineszcens vizsgálat, és hasonlók. Az immunológiai diagnosztikai eljárások hatékonyak a megemelkedett WT1-expresszióval járó rák diagnosztizálásában. Ilyen rák, például, a vérrák, például leukémia, mielodiszpláziás szindróma, többszörös mielóma és rosszindulatú limfóma, és szilárd rákok, például gyomorrák, vastagbélrák, tüdõrák, mellrák, embrionális rák, májrák, bõrrák, hólyagrák, prosztatarák, méhrák, méhnyakrák és petefészekrák. A találmány tárgya olyan antigénbemutató sejt, amely a találmány szerinti peptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét mutatja be. Ahogyan az alábbi példákból kitûnik, a találmány tárgyát képezõ peptiddel végzett serkentés CTL-eket indukál, ami arra utal, hogy ott jelen vannak a találmány szerinti peptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét bemutató antigénbemutató sejtek, és hogy az antigénbemutató sejteket specifikusan felismerõ CTL¹ek indukálódtak. Az alábbiakban leírtak szerint, az ilyen, a találmány szerinti peptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét bemutató, antigénbemutató sejteket hatékonyan alkalmaztuk a sejtterápiában (DC-terápia). A találmány szerinti antigénbemutató sejtek közé tartozik bármilyen olyan sejt, amely a találmány szerinti rákantigénpeptid HLA A26 antigénnek képzett komplexét mutatja be, ahol a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptid és HLA A26 antigén komplexe dendritikus sejtek sejtfelszínén kerül bemutatásra. A sejtterápiában (DC-terápia) alkalmazott antigénbemutató sejtek elõállíthatók antigén-bemutatásra képes sejtek rákos betegbõl való izolálásával, a sejteknek a találmány tárgyát képezõ peptiddel való in vitro ingerlésével, vagy a találmány szerinti polinukleotid vagy a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó expressziós vektor bevitelével a sejtekbe, és annak lehetõvé tételével, hogy a sejtek felszínükön bemutassák a találmány szerinti rákantigénpeptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét. Az antigénbemutató képességû sejtek kifejezés nem egyetlen konkrét sejtre korlátozódik, hanem lehet bármilyen, a találmány szerinti peptidet bemutatni képes HLA A26 antigént a sejtfelszínen expresszáló sejt; azonban elõnyösek az ismerten különösen magas antigénbemutatási képességû dendritikus sejtek. Továbbá, az anyag, amellyel a fenti antigénbemutató képességû sejteket ingerlésnek vetjük alá, lehet a találmány szerinti peptid, vagy a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotid vagy a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazó vektor. A találmány tárgyát képezõ antigénbemutató sejtek elõállíthatók, például, antigénbemutató képességû sejtek rákos betegbõl való izolálásával, a sejteknek a találmány szerinti peptiddel (azaz SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló rákantigénpeptid) végzett in vitro ingerlésével, amelynek következtében komplex képzõdik a találmány szerinti rákantigénpeptid és egy adott HLA A26 antigén között [Cancer Immunol. Immunother., 46, 82 (1998); J. Immunol., 18, 1796 (1997); Cancer Res., 9, 1184 (1999)]. Dendritikus sejtek alkalmazása esetén, a találmány szerinti antigénbemutató sejtek elõállíthatók, például oly módon, hogy Ficoll-eljárással limfocitákat izolálunk a kérdéses rákos betegbõl származó periferiális vérbõl, eltávolítjuk a nem kitapadó sejteket, dendritikus sejtek indukálása céljából a kitapadó sejteket GM¹CSF és IL 4 jelenlétében inkubáljuk, és a találmány szerinti peptiddel végzett inkubálás útján ingereljük a dendritikus sejteket. Abban az esetben, ha a találmány szerinti antigénbemutató sejteket a találmány tárgyát képezõ peptidet kódoló polinukleotidnak (azaz SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló epitóppeptidet kódoló polinukleotid) vagy a kérdéses polinukleotidot tartalmazó expressziós vektornak a fentiekben említett, antigénbemutató képességû sejtekbe való bevitelével állítjuk elõ, az elõállítás történhet a Cancer Res., 6, 672 (1996) vagy J. Immunol., 161, 7 (1998) közleményekben leírt, vagy hasonló eljárással, már ha a polinukleotid DNS. Az antigénbemutató sejtek elõállítása RNS-sel és DNS-sel egyaránt megvalósítható [ld.: J. Exp. Med., 184, 46 (1996), vagy hasonlók]. A találmány tárgyát olyan CTL¹ek is képezik, amelyek felismerik a találmány szerinti rákantigénpeptid és HLA A26 antigén közötti komplexet. Ahogyan az alábbi példákban bemutattuk, a találmány tárgyát képezõ peptiddel végzett serkentés CTL-indukáló aktivitást eredményezett. Ez arra utal, hogy léteznek a találmány szerinti peptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét bemutató antigénbemutató sejtek, és hogy indukálódtak az antigénbemutató sejteket specifikusan felismerõ CTL¹ek. Ilyen, a találmány szerinti peptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét specifikusan felismerõ CTL¹ek az adoptív immunterápiában hatékonyan alkalmazhatók az alábbiakban leírtak szerint. A találmány szerinti CTL¹ek lehetnek bármilyen formában, azzal a feltétellel, hogy specifikusan felismerik a találmány szerinti peptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét. A találmány szerinti CTL¹ek közé tartozik monoklonális CTL és különféle klónokat tartalmazó CTL-keverék (populáció). Elõnyösen, ilyen CTL¹ek közé tartoznak, például, a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló peptid HLA A26 antigénnel képzett komplexét specifikusan felismerõ CTL¹ek. Az adoptív immunterápiában alkalmazott CTL¹ek elõállíthatók egy adott beteg periferiális vérébõl származó limfociták izolálásával, a sejteknek a találmány szerinti peptiddel (azaz a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló rákantigénpeptid) vagy a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotiddal (azaz a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciát tartalmazó epitóppeptidet kódoló polinukleotid), vagy a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazó expressziós vektorral végzett serkentésével [Journal of Experimental Medicine, 190, 1669 (1999)]. 7

8 A találmány szerinti, fentiekben leírt peptidek, expressziós vektorok, sejtek, antigénbemutató sejtek és CTL¹ek a vonatkozó anyagoknak megfelelõen kialakított formává alakítva aktív összetevõként alkalmazhatók CTL-indukálóként, azaz rákvakcinaként (részletesebben Id. alább). (1) Rákvakcina, amely aktív összetevõként a találmány szerinti peptidet tartalmazza. A találmány szerinti peptidnek CTL¹t indukáló aktivitása van, és az így indukált CTL¹ek citotoxikus hatás vagy limfokinek elõállítása révén rákellenes aktivitást fejthetnek ki. Ennélfogva, a találmány szerinti peptid alkalmazható a rák kezelésére vagy megakadályozására szolgáló vakcina aktív összetevõjeként. Eszerint, a találmány tárgya rákvakcina (rákvakcinaként alkalmazható gyógyászati készítmény), amely aktív összetevõként tartalmazza a találmány szerinti peptidet. A találmány szerinti vakcina HLA A26¹ra pozitív és WT¹re pozitív betegnek való beadása esetén, a peptid (azaz, a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló rákantigénpeptid) antigénbemutató sejtek HLA A26 antigénje számára bemutatásra kerül. Ezt követõen a bemutatott HLA A26 antigénkomplexet specifikusan felismerõ CTL¹ek proliferálódhatnak és elpusztíthatják a ráksejteket, ezáltal válik lehetségessé a rák kezelése vagy megakadályozása. A találmány szerinti rákvakcina alkalmazható a megemelkedett WT1- expresszióval járó rák kezelésére vagy megakadályozására. Ilyen rák, például, a vérrák, például leukémia, mielodiszpláziás szindróma, többszörös mielóma és rosszindulatú limfóma, és szilárd rákok, például gyomorrák, vastagbélrák, tüdõrák, mellrák, embrionális rák, májrák, bõrrák, hólyagrák, prosztatarák, méhrák, méhnyakrák és petefészekrák. Eszerint, a találmány egy másik megvalósítási módjában, a találmány tárgya a találmány szerinti rákvakcina hatékony mennyiségét tartalmazó, HLA A26¹ra pozitív és WT¹re pozitív betegben a rák kezelésében vagy megakadályozásában való alkalmazására szolgáló gyógyászati készítmény. Aktív összetevõként a találmány szerinti peptidet tartalmazó rákvakcina tartalmazhat egyetlen CTL-epitópot (azaz a SEQ ID NO: 2, 8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciából álló rákantigénpeptid) vagy aktív összetevõként olyan epitóppeptidet, amelyben egy adott peptid egy másik peptid(ek)hez (CTL-epitóp, helper epitóp stb.) van ligálva. Nemrég kimutatták, hogy több összekapcsolt CTL-epitópot (antigénpeptidet) tartalmazó epitóppeptidnek van hatékony CTLeket indukáló aktivitása in vivo. Például, leírták, hogy PSA rákantigén-fehérjébõl származó, HLA A2¹re, A3¹ra, A11¹re vagy B3¹ra korlátozott, egymással összekapcsolt CTL-epitópokat tartalmazó peptid (körülbelül ¹mer) a megfelelõ CTL-epitópokra specifikus CTL-eket indukált in vivo [Journal of Immunology, 161, (1998)]. Azt is leírták már, hogy összeligált CTL-epitópo(ka)t és helper epitópo(ka)t tartalmazó epitóppeptid hatékonyan képes CTL-eket indukálni. Amennyiben e formákban lévõ epitóppeptid kerül beadásra, a peptid beépül az antigénbemutató sejtekbe; a sejten belüli lebomlás során létrejött megfelelõ antigén HLA-antigénhez kötõdve komplexeket képez; az antigénbemutató sejtek felszínén a komplexek nagy sûrûségben kerülnek bemutatásra; és a komplexekre specifikus CTL¹ek hatékonyan proliferálódnak a testben és elpusztítják a ráksejteket. Ezen a módon érjük el a rák kezelését vagy megakadályozását. A hatékony sejtes immunitás elérése céljából, aktív összetevõként a találmány szerinti peptidet tartalmazó rákvakcina beadható gyógyászatilag elfogadható hordozóval például megfelelõ adjuvánssal együtt vagy részecskék formájában. Adjuvánsként az irodalomban leírtak [Clin. Microbiol. Rev., 7, (1994)] és hasonlók alkalmazhatók. Konkrét példák közé tartoznak a következõk: mikroorganizmusból származó összetevõk, citokinek, növényi eredetû összetevõk, tengeri szervezetekbõl származó összetevõk, ásványi gélek, például alumínium-hidroxid; felületaktív anyagok, például lizolecitin és Pluronic polioiok, polianionok, peptidek, olajemulzió (emulziós készítmények) és hasonlók. Liposzómakészítmények, részecskekészítmények, amelyekben az összetevõ néhány m átmérõjû gyöngyökhöz van kötve, készítmények, amelyekben az összetevõ lipidekhez van kötve és hasonlók, szintén a találmány tárgyát képezik. A beadás történhet, például, intradermálisan, szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásan. Bár a készítményben a találmány szerinti peptid dozírozása beállítható a kezelendõ betegségnek, a beteg korának és testsúlyának megfelelõen, a dózis rendszerint a 0,0001 mg 00 mg, elõnyösen a 0,001 mg 00 mg, elõnyösebben a 0,1 mg mg közötti tartományba esik, amely elõnyösen párnaponként párhavonta egyszer adható be. (2) Aktív összetevõként a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazó vektort tartalmazó DNS-vakcina. Nemcsak a fentiekben felsorolt, találmány szerinti peptid, hanem a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazó expressziós vektor is lehet a rák kezelésére vagy megakadályozására szolgáló DNSvakcina aktív összetevõje. Eszerint, a találmány tárgya rákvakcina (rákvakcinaként alkalmazandó gyógyászati készítmény), amely aktív összetevõként a találmány szerinti peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazó expressziós vektort tartalmazza. Nemrég mutatták ki, hogy számos (több), egymáshoz ligált CTL-epitópból (antigénpeptidek) álló vagy egymáshoz ligált CTL-epitópo(kat) és helper epitópo(kat) tartalmazó epitóppeptidet kódoló polinukleotidnak hatékony, CTL-eket indukáló in vivo aktivitása van. Például leírták, hogy ligálással összekapcsolt, HBV-bõl származó HLA A2¹ra korlátozott antigénpeptideket (6 peptid), HLA A11¹re korlátozott antigénpeptideket (3 peptid) és helper epitópot tartalmazó peptidet kódoló DNS (minigén) a megfelelõ epitópok elleni CTL-eket indukált hatékonyan in vivo [Journal of Immunology, 162, (1999)]. Eszerint rákvakcina aktív összetevõje elõállítható a találmány szerinti epitóppeptidet kódoló polinukleotid megfelelõ expressziós vektorba való beépítésével. 8

9 Rákvakcina (DNS-vakcina) aktív összetevõjeként a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó expressziós vektor beadására a következõ eljárások alkalmazhatók. A találmány szerinti polinukleotid sejtekbe való bevitelére szolgáló eljárásban bármilyen, vírusvektorokat alkalmazó mód vagy más eljárások alkalmazhatók [Nikkei-Science, April, 4 (1994); Gekkan-Yakuji, 36, (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12 (1994); és az itt idézett hivatkozások]. Vírusvektort hasznosító eljárások közé tartoznak például azok, amelyekben a találmány szerinti DNS¹t DNS- vagy RNS-vírusba például retrovírus, adenovírus, adeno-asszociált vírus, herpeszvírus, vacciniavírus, poxvírus, poliovírus, vagy Sindbis vírus építjük, majd sejtekbe visszük be. Mindenekelõtt különösen elõnyös a retrovírust, adenovírust, adeno-asszociált vírust vagy vacciniavírust alkalmazó eljárás. További eljárások közé tartozik például az expressziós plazmid közvetlen intramuszkuláris injekciózásán alapuló eljárás (DNS-vakcinálás), liposzómaeljárás, Lipofectin-eljárás, mikroinjekció, kalcium-foszfáteljárás és elektroporáció. Elõnyös a DNS-vakcinálás és a liposzómaeljárás. A találmány szerinti polinukleotid a gyakorlatban gyógyszerként való alkalmazását illetõen van olyan in vivo eljárás, amelyben a polinukleotidot közvetlenül a testbe visszük be és van olyan ex vivo eljárás is, ahol a DNS¹t a testen kívül visszük be az emberi testbõl eltávolított sejtekbe, majd a sejteket újra visszavisszük a testbe [Nikkei-Science, April, 4 (1994); Gekkan- Yakuji, 36, (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12 (1994); és az itt idézett hivatkozások]. Elõnyösebbek az in vivo eljárások. In vivo eljárás esetén, a beadás a kezelendõ betegségtõl és szimptómáktól függõen bármilyen megfelelõ módon kivitelezhetõ. Például beadható intravénásan, intraarteriálisan, szubkután, intrakután, intramuszkulárisan stb. Amennyiben a beadás in vivo eljárással történik, a készítmény különféle formákban például oldatként beadható, bár jellemzõ, hogy a készítmény, például, olyan injekcióként van kiszerelve, amely aktív összetevõként a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó expressziós vektort tartalmaz. Az injekció, szükség szerint, hagyományos hordozókat tartalmazhat. A találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó expressziós vektort tartalmazó liposzómák vagy membránnal fuzionált liposzómák [például Sendai vírus (HVJ)-liposzómák] esetén, a liposzómák lehetnek liposzómakészítmény formájában (például, szuszpenzió, fagyasztott gyógyszer, centrifugálással töményített fagyasztott gyógyszer stb.). Bár a polinukleotidot tartalmazó expressziós vektort tartalmazó készítmény mennyisége beállítható, például, a kezelendõ betegségnek, a beteg korának és testsúlyának megfelelõen, a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó expressziós vektor mennyisége rendszerint a 0,0001 mg 00 mg, elõnyösen a 0,001 mg 00 mg, elõnyösebben a 0,1 mg mg közötti tartományba esik, ami párnaponként párhavonta egyszer adható be A találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó expressziós vektor rákos betegnek való beadásakor a polinukleotidnak megfelelõ polipeptid az antigénbemutató sejtekben nagy mennyiségben expresszálódik. Ezt követõen, sejten belüli lebomlással keletkezett rákantigénpeptidek HLA antigénekkel komplexeket képeznek; majd a komplexek az antigénbemutató sejtek felszínén nagy sûrûségben bemutatásra kerülnek; és a komplexeket specifikusan felismerõ CTL¹ek hatékonyan proliferálódnak a testben, és elpusztítják a ráksejteket. Ezen a módon érjük el a rák kezelését vagy megakadályozását. Aktív összetevõként a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó expressziós vektort tartalmazó rákvakcina alkalmazható a WT1 gén megemelkedett expressziójával járó rák kezelésére vagy megakadályozására. Ilyen rák, például, a vérrák, például leukémia, mielodiszpláziás szindróma, többszörös mielóma és rosszindulatú limfóma, és szilárd rákok, például gyomorrák, vastagbélrák, tüdõrák, mellrák, embrionális rák, májrák, bõrrák, hólyagrák, prosztatarák, méhrák, méhnyakrák és petefészekrák. (3) Rákvakcina, amely aktív összetevõként a találmány szerinti antigénbemutató sejteket tartalmazza. A találmány tárgya rákvakcina, amely aktív összetevõként a találmány szerinti antigénbemutató sejteket tartalmazza. Nemrég írtak le az irodalomban olyan sejtterápiát (DC terápia), amely során limfocitákat izoláltak rákos betegbõl származó periferiális vérbõl, a limfocitákból dendritikus sejteket indukáltak, a dendritikus sejteket peptiddel vagy hasonlókkal ingerelték in vitro, és a kapott antigénbemutató sejteket szubkután injekcióval vagy hasonlók révén visszavitték a betegbe [Cancer Immunol. Immunother., 46, 82 (1998); J. Immunol., 18, 1796 (1997); Cancer Res., 9, 1184 (1999); Cancer Res., 6, 672 (1996); J. Immunol., 161, 7 (1998); J. Exp. Med., 184, 46 (1996)]. Ennélfogva a találmány szerinti fentiekben leírt antigénbemutató sejtek a sejtterápiában rákvakcina aktív összetevõjeként alkalmazhatók. Elõnyös, ha a találmány szerinti, aktív összetevõként antigénbemutató sejteket tartalmazó rákvakcina fiziológiás sóoldatot, foszfáttal pufferelt sóoldatot (PBS), tápoldatot vagy hasonlókat tartalmaz az antigénbemutató sejtek stabil fenntartása céljából. Ez beadható, például, intravénásan, szubkután, vagy intradermálisan. A dózis a fentiekben citált hivatkozásokban leírtakhoz hasonló. Amikor a fenti rákvakcina visszavitelre kerül a beteg testébe, WT1¹re pozitív és HLA A26¹ra pozitív beteg testében specifikus CTL¹ek indukálódnak hatékonyan, ezáltal érjük el a rák kezelését vagy megakadályozását. Aktív összetevõként a találmány szerinti antigénbemutató sejteket tartalmazó rákvakcina alkalmazható a WT1 gén megemelkedett expressziójával járó rák kezelésére vagy megakadályozására. Ilyen rák, például, a vérrák, például leukémia, mielodiszpláziás szindróma, többszörös mielóma és rosszindulatú limfóma, és szilárd rákok, például gyomorrák, vastagbélrák, tüdõrák, mellrák, embrionális rák, májrák, bõrrák, 9

10 hólyagrák, prosztatarák, méhrák, méhnyakrák és petefészekrák. (4) Rákvakcina, amely aktív összetevõként a találmány szerinti CTL-eket tartalmazza. A találmány tárgya rákvakcina (rákvakcina gyógyászati készítmény), amely aktív összetevõként a találmány szerinti CTL-eket tartalmazza az igénypontokban meghatározottak szerint. A találmány szerinti CTL¹ek hatékonyan alkalmazhatók az adoptív immunterápiában alábbiakban leírtaknak megfelelõen. Melanómák esetében, az adoptív immunterápiában terápiás hatást figyeltek meg. Az eljárás során daganatba szûrõdõ T¹sejteket távolítottak el a betegbõl és nagy mennyiségekben tenyésztették ex vivo, majd visszatették azokat a kérdéses betegbe [J. Natl. Cancer. Inst., 86, 119 (1994)]. Továbbá, egérmelanómánál metasztáziselnyomást figyeltek meg akkor, amikor lépsejteket serkentettek TRP¹2 rákantigénpeptiddel in vitro a rákantigénpeptidre specifikus CTL¹ek amplifikálása céljából, és a CTL-eket átültetett melanómát hordozó egérnek adták be [J. Exp. Med., 18, 43 (1997)]. Ennek eredményeként olyan CTL¹ek proliferálódtak in vitro, amelyek specifikusan felismerték az antigénbemutató sejtek HLA-antigénje és a rákantigénpeptid között létesült komplexet. Eszerint, úgy hisszük, hogy hatékony lehet egy olyan, terápiás eljárás, amely rákra specifikus CTL¹ek proliferációjának céljából a perifériás vérbõl származó limfociták találmány szerinti peptiddel, polinukleotiddal vagy expressziós vektorral való serkentését és a CTL-eknek a betegbe való visszajuttatását tartalmazza. Eszerint, a találmány szerinti CTL¹ek rákvakcina aktív összetevõjeként alkalmazhatók az adoptív immunterápiában. Aktív összetevõként a találmány szerinti CTL-eket tartalmazó rákvakcina elõnyösen fiziológiai sóoldatot, foszfáttal pufferelt sóoldatot (PBS¹t), tápoldatot vagy hasonlókat tartalmaz a CTL¹ek stabil fenntartása céljából. Ez beadható, például, intravénásan, szubkután, vagy intradermálisan. A dózis a fentiekben citált hivatkozásokban leírtakhoz hasonló. Amikor a rákvakcina visszakerül a WT1¹re pozitív és HLA A26¹ra pozitív beteg testébe, a CTL¹ek ráksejtekre gyakorolt citotoxikus hatása fokozódik a beteg testében, és a rákos sejtek elpusztulnak. Ily módon kezelhetõ a rák. Aktív összetevõként a találmány szerinti CTL-eket tartalmazó rákvakcina alkalmazható a megemelkedett WT1- expresszióval járó rák kezelésére vagy megakadályozására. Ilyen rák, például, a vérrák, például leukémia, mielodiszpláziás szindróma, többszörös mielóma és rosszindulatú limfóma, és szilárd rákok, például gyomorrák, vastagbélrák, tüdõrák, mellrák, embrionális rák, májrák, bõrrák, hólyagrák, prosztatarák, méhrák, méhnyakrák és petefészekrák. A találmány tárgyát a találmány szerinti rákantigénpeptidet és HLA A26 antigént tartalmazó HLA-monomer, HLA-dimer, HLA-tetramer vagy HLA-pentamer is képezi. A rák immunterápiájában, a kezelés elõtt a kérdéses betegben egy adott rákantigén (rákantigénpeptid) elleni CTL-prekurzor sejtek gyakoriságának vagy mennyiségének, vagy egy adott rákantigénnel (rákantigénpeptiddel) végzett kezelés során a CTL-prekurzor sejtek gyakoriságának vagy mennyiségének vizsgálata fontos indikátor lehet a rákantigénre (rákantigénpeptidre) erõsen reagáló betegek kiválasztásában, a terápiás hatások nyomon követésében, vagy a kezelés fenntarthatóságának értékelésében. Daganatantigén-peptidet HLA-antigénnel együtt tartalmazó HLA-monomer, HLA-dimer, HLA-tetramer vagy HLA-pentamer reagensként alkalmazható antigénre (antigénpeptidre) specifikus CTL¹ek kimutatására, elõnyösen a CTL¹ek gyakoriságának vagy mennyiségének mérésére. A leírás szerinti értelemben a HLA-tetramer kifejezés egy HLA-antigén ¹láncának és egy 2-mikroglobulinnak egy adott peptiddel (antigénpeptiddel) való összekapcsolásával nyert komplex (HLA-monomer) biotinilálásával és avidinhez való kötõdéssel végzett tetramerizálással elõállított tetramert jelent [Science 279, (1998); és Science 274, (1996)]. A HLA-monomer olyan monomer, amelyet a fentiekben említett HLA-tetramer elõállítására alkalmaztunk, és amelyet egy HLA-antigén ¹láncának, egy 2-mikroglobulinnak és egy adott peptidnek (antigénpeptiddel) összekapcsolásával képzünk. A HLA-dimer HLA-antigén és lg (immunglobulin, például IgG1) fúziójával és a kapott fúzió 2-mikroglobulinhoz és antigénpeptidhez való kötésével állítunk elõ [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, (1993)]. HLA-dimerhez kötõdött antigénpeptid-specifikus CTL¹ek kimutathatók, például, jelzett anti-igg1 antitest IgG1-hez való kötõdésével. A HLA-pentamer egy nemrég kifejlesztett eljárás, és amely olyan pentamer, melyben öt, HLA-antigént és antigénpeptidet tartalmazó komplex molekula Coiled-Coil doménjein át polimerré kapcsolódott. Mivel a HLA-antigén-antigén peptidkomplex fluoreszcenciával vagy hasonlókkal jelezhetõ, az analízis áramlásos citometriával vagy hasonlókkal kivitelezhetõ a HLA-tetramerhez hasonlóan [ld. A fentiekben említett HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer és ¹pentamer egyedi gyártásban egyaránt beszerezhetõ olyan cégektõl, mint amilyen például a Prolmmune vagy BD Biosciences. Jelenleg, különféle antigénpeptideket tartalmazó HLA-tetramerek és hasonlók kereskedelmi forgalomban elérhetõk (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. stb.). A találmány szerinti HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer és ¹pentamer közé tartoznak például, konkrétan, a SEQ ID NO: 2,8 vagy 9 alatt megadott aminosavszekvenciát tartalmazó peptidet és HLA A26-antigént tartalmazó HLA-monomerek, ¹dimerek, ¹tetramerek és ¹pentamerek. Elõnyös, ha a CTL¹ek kimutatása HLA tetramer vagy HLA pentamer, elõnyösebben HLA tetramer alkalmazásával történik. Elõnyös, ha a HLA-monomer, ¹tetramer és ¹pentamer fluoreszcenciával van jelezve, így a kötõdött CTL¹ek könnyen kiválogathatók vagy kimutathatók az olyan kimutatási eljárásokkal, mint az áramlásos citometria, fluoreszcens mikroszkópia, és hasonlók. Például ilyenek közé tartoznak a következõk: fikoeritrinnel (PE), fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC), peridinil-kloro-

11 fill-proteinnel (PerCP), allofikocianinnal (APC), és hasonlókkal jelzett tartalmazó HLA-monomerek, ¹dimerek, ¹tetramerek és ¹pentamerek. A találmány szerinti HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer és ¹pentamer részét képezõ HLA A26 antigén (HLA A26 antigén ¹lánca) hagyományos eljárásokkal, például PCR, könnyen klónozható a HLA A26 antigén ismert bázisszekvenciájával kapcsolatos információk és például a GenBank D14 elérhetõségi számú szekvencia alapján. A találmány szerinti HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer és ¹pentamer részét képezõ 2-mikroglobulin elõnyösen emberbõl származik. Az emberi 2-mikroglobulin hagyományos eljárásokkal, például PCR, könnyen klónozható a 2-mikroglobulinnak a GenBank-ban AB elérhetõségi számon megadott, ismert bázisszekvenciájával kapcsolatos információk alapján. A HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer és ¹pentamer elõállításának folyamata a fentiekben ismertetett vonatkozó irodalomból jól ismert, bár a HLA-tetramert illetõen az elõállítás az alábbiakban röviden ismertetésre kerül. Elõször megfelelõ, fehérje expresszálására képes gazdasejtet, például E. coli- vagy emlõseredetû sejteket, HLA A26 ¹láncát expresszáló vektorral és 2-mikroglobulint expresszáló vektorral transzformáljuk, és lehetõvé tesszük az expressziót. Itt elõnyös az E. coli (például, BL21) alkalmazása. Oldható HLA-peptid komplex kialakítása céljából, a kapott monomer HLA A26 komplexet és a találmány szerinti peptidet összekeverjük. A kapott HLA-peptid komplex HLA A26 ¹Iáncának C¹terminális szekvenciáját BirA enzimmel biotiniláljuk. A biotinilált HLA-peptid komplex és fluoreszcensen jelzett avidin 4:1 arányban történõ összekeverésével HLAtetramert alakítunk ki. Elõnyös, ha a fentiekben leírt minden lépés után a kapott fehérjét gélszûréssel vagy valamilyen hasonló eljárással tisztítjuk. A fentiekben leírt HLA-monomert, ¹dimert, ¹tetramert és ¹pentamert kimutató ágensként hatékonyan alkalmazzuk HLA A26¹ot kötõ rákantigénpeptidekre specifikus CTL¹ek azonosítására. A találmány szerinti CTL-kimutató ágens például a következõ célokra alkalmazható: 1. Alkalmazható a találmány szerinti rákantigénpeptid elleni CTL-prekurzorok gyakoriságának vagy mennyiségének, vagy a rákantigénpeptiddel végzett kezelés elõtt. Ez lehetõvé teszi annak értékelését, hogy a kérdéses beteg miként reagál a rákantigénpeptidre. 2. Alkalmazható egy adott betegben lévõ CTL¹ek gyakoriságának vagy mennyiségének vizsgálatára a rákantigénpeptiddel végzett kezelés során. Ez lehetõvé teszi a terápiás hatások nyomon követését, a kezelés fenntarthatóságának értékelését és annak igazolását, hogy a kezelés kedvezõen alakul, és így tovább A CTL¹ek kimutatása történhet, specifikusan, oly módon, hogy egy adott betegbõl CTL-eket tartalmazó biológiai mintát (például PBMC¹t) izolálunk, a találmány szerinti HLA-tetramert vagy hasonlót érintkezésbe hozzuk a biológiai mintával, és áramlásos citometriával vagy hasonlóval mérjük a találmány szerinti, HLA-tetramerhez vagy hasonlóhoz kötött peptidre specifikus CTL¹ek gyakoriságát vagy mennyiségét. Példák A találmány szerinti megoldás részletesebb ismertetésre kerül a következõ példák segítségével, azonban a találmány oltalmi köre az igénypontokban van meghatározva. 1. példa HLA A*01¹et kötõ antigénpeptidek azonosítása Szilárd fázisú szintézissel megszintetizáltuk az emberi WT1 aminosavszekvenciája [Cell, 09 (1990), SEQ ID NO: 1] 7 1. pozícióinak megfelelõ, a SEQ ID NO: 3 alatt meghatározott aminosavszekvenciájú peptidet. Beleegyezõ nyilatkozat megszerzése után, HLA A*01¹re pozitív, egészséges alanyoktól vért vettünk és Ficoll-Hypaque elválasztóoldat alkalmazásával a vérmintákból periferiális mononukleáris sejteket (PBMCket) izoláltunk. Hibás TAP gén miatt az endogén peptidek HLA-nak való bemutatására képtelen, HLA A*01¹re pozitív T2¹sejtvonalakat [J. Immunol., 1763 (1993)] a SEQ ID NO: 3 alatt meghatározott peptiddel ( M, 2 óra) ingereltük, besugároztuk (700 cgy), és PBMC-kkel együtt inkubáltuk (a sejtszámot tekintve 1:1 arányban). Tápoldatként a következõket tartalmazó teljes tápoldatot alkalmaztuk: 4% AIM¹V tápoldat, 4% RPMI16 tápoldat, % inaktivált emberi szérum, 0,1 mm MEM nem esszenciális aminosavak, 0 ng/ml sztreptomicin, 0 NE/mL penicillin és 2 ng/ml 2¹merkaptoetanol. Hét nap elteltével, a másodszori serkentést hasonlóképpen végeztük, majd a rákövetkezõ napon az inkubációs keverékhez 2 NE/mL IL¹2¹t (Shionogi & Co., Ltd.) adtunk. Az összesen ötször történt serkentés után, a legutolsó serkentéstõl számított nap elteltével effektorsejteket nyertünk és azokat a citotoxicitás mérésére alkalmaztuk. CTL-eknek a célsejtekre kifejtett citotoxikus aktivitását 1 Cr-felszabadítási vizsgálattal mértük. Legömbölyített aljú, 96 lyukú lemezen, a 1 Cr-mal jelzett célsejteket (1 4 sejt/összesen 0 L) különbözõ számú effektorsejtettel inkubáltuk (0 L). A tenyésztés (37 C, 3 óra) után, a lemezeket a felülúszó (0 L) elválasztása céljából lecentrifugáltuk, majd megmértük annak ¹sugárzását. Specifikus citotoxicitást (specifikus lízis %) a következõk szerint számítottunk: (mért felszabadulás /cpm/ spontán felszabadulás /cpm/) specifikus lízis %= *0 (maximális felszabadulás /cpm/ spontán felszabadulás /cpm/) A spontán felszabadulás mérését a célsejtek tenyészetébõl vett felülúszóban, a maximális felszabadulás mérését pedig a célsejtek tenyészetébõl vett és 1% Triton X¹0-zal kezelt felülúszóban mértük. 11

12 A szignifikáns differencia mérését Student-féle t¹teszttel végeztük. A citotoxicitást a célsejtek, a serkentésre alkalmazott peptiddel ingerelt T2¹sejtek és a peptiddel nem ingerelt sejtek alkalmazásával mértük. Az eredményeket az 1. ábra mutatja be. A SEQ ID NO: 3 alatti peptiddel ingerelt T2¹sejtekkel végzett serkentéssel indukált CTL¹ek potensebb citotoxikus aktivitást fejtettek ki a peptiddel ingerelt T2¹sejteken, mint a peptiddel nem ingerelt T2¹sejteken (p<0,0). Ezen eredmények demonstrálták, hogy HLA A*01-pozitív emberi PBMC¹k SEQ ID NO: 3 alatti peptiddel végzett serkentésével indukált CTL¹ek specifikusan felismerik a SEQ ID NO: 3 alatti, WT1-eredetû peptidet. Ezt követõen megvizsgáltuk a SEQ ID NO: 3 alatti peptiddel indukált CTL¹ek TF¹1- és JY¹sejtvonalakra kifejtett citotoxikus aktivitását. A TF¹1-sejtvonal HLA A*01¹re pozitív és WT1¹et expresszál [J. Cell. Physiol. 1, 323 (1989)], míg a JY¹sejtvonal, bár HLA A*01¹re pozitív, ám WT1¹et nem expresszál [J. Biol. Chem. 22, (1997)]. Az eredményeket a 2. ábra mutatja be. A SEQ ID NO: 3 alatti peptiddel serkentett CTL¹ek a TF¹1-sejteket elpusztították de a JY¹sejteket nem (p<0,0). Ezen eredmények demonstrálják, hogy a SEQ ID NO: 3 alatti peptid intracellulárisan expresszált endogén WT1 processzálásával képzõdik, antigénként a HLA A*01 molekulával bemutatásra kerül, és ezt felismerik a CTL¹ek példa HLA A26-hoz kötõdõ antigénpeptidek azonosítása (1) Szilárd fázisú szintézissel megszintetizáltuk az emberi WT1 aminosavszekvenciájának [Cell, 09 (1990), SEQ ID NO: 1] pozícióinak megfelelõ, SEQ ID NO: 2 alatt meghatározott aminosavszekvenciájú peptidet. Beleegyezõ nyilatkozat beszerzése után, HLA A26¹ra pozitív, egészséges alanyokból PBMC-ket állítottunk elõ az 1. példában leírthoz hasonló módon, és a sejteket a SEQ ID NO: 2 alatt megadott peptid hozzáadásával serkentettük. Egy héttel késõbb, a PBMC-ket a SEQ ID NO: 2 alatt megadott peptiddel ingereltünk, és a sejteket serkentõkként (stimulálókként) alkalmaztuk a serkentés során. A serkentést összesen négyszer, hetente egyszer végeztük. Egy héttel késõbb, EB vírussal transzfromált B¹sejteket (B¹LCL) ingereltünk a SEQ ID NO: 2 alatt megadott peptiddel, és serkentõkként alkalmaztuk a serkentés során. Az utolsó serkentés után nappal, a citotoxikus aktivitást 1 Cr-felszabadítási vizsgálattal mértük az 1. példában leírtaknak megfelelõen, amelyben a SEQ ID NO: 2 alatt megadott peptiddel ingerelt vagy a peptiddel nem ingerelt B¹LCL-sejteket alkalmaztunk célsejtként. Az eredményeket a 3. ábra mutatja be. A SEQ ID NO: 2 alatti peptiddel serkentett CTL¹ek a B¹LCL-1-sejteken potensebb citotoxikus hatást fejtettek ki, mint a peptiddel nem ingerelt B¹LCL sejteken. Ezen eredmények demonstrálták, hogy HLA A26¹ra pozitív emberi PBMC¹k SEQ ID NO: 2 alatti peptiddel végzett serkentésével indukált CTL¹ek specifikusan felismerik a SEQ ID NO: 2 alatti, WT1-eredetû peptidet. Az itt alkalmazott HLA A26¹ra pozitív, egészséges alanyok genotípusáról tudtuk, hogy a HLA A*21¹be tartozik. 3. példa HLA A26-hoz kötõdõ antigénpeptidek azonosítása (2) Szilárd fázisú szintézissel megszintetizáltuk az emberi WT1 aminosavszekvenciája [Cell, 09 (1990), SEQ ID NO: 1] 12 1, , és pozícióinak megfelelõ, SEQ ID NO: 8, 9 és 2 alatt meghatározott aminosavszekvenciájú peptideket. Beleegyezõ nyilatkozat megszerzése után HLA A26¹ra pozitív, egészséges alanyokból PBMCket állítottunk elõ az 1. példában leírthoz hasonló módon, és a sejteket a SEQ ID NO: 8 alatt megadott peptid hozzáadásával serkentettük. Egy héttel késõbb, a PBMC-ket a SEQ ID NO: 8 alatt megadott peptiddel ingereltük, és sejteket serkentõkként alkalmaztuk a serkentés során. A serkentést összesen háromszor, hetente egyszer végeztük. A háromhetes serkentés után, negatív szelekciós eljárással CD8¹ra pozitív sejtekre nézve dúsítást végeztünk. Továbbá a SEQ ID NO: 8 alatt megadott peptiddel kétszer serkentettünk. Az utolsó serkentés után nappal, a citotoxikus aktivitást 1 Cr-felszabadítási vizsgálattal mértük az 1. példában leírtaknak megfelelõen, amelyben a SEQ ID NO: 8 alatt megadott peptiddel ingerelt vagy a peptiddel nem ingerelt B¹LCL-sejteket alkalmaztunk célsejtként. A fentiekben leírtakhoz hasonlóan végeztünk kísérleteket a SEQ ID NO: 9 alatt megadott peptiddel és a SEQ ID NO: 2 alatt megadott peptiddel. Az eredményeket a 4. ábra mutatja be. A SEQ ID NO: 8 alatti peptiddel vagy a SEQ ID NO: 9 alatti peptiddel vagy a SEQ ID NO: 2 alatti peptiddel serkentett CTL¹ek a B¹LCL-sejteken potensebb citotoxikus hatást fejtettek ki, mint a peptiddel nem ingerelt B¹LCL sejteken. Ezen eredmények demonstrálták, hogy HLA A26¹ra pozitív emberi PBMC¹k SEQ ID NO: 8, 9 és 2 alatti peptiddel végzett serkentésével indukált CTL¹ek specifikusan felismerik a SEQ ID NO: 8, 9 és 2 alatti, WT1-eredetû peptidet (megfelelõen). Ipari alkalmazhatóság A találmány tárgyát a WT1-bõl származó rákantigénpeptidek, az ezeket kódoló polinukleotidok, az ezeket tartalmazó CTL-indukálók, és hasonlók képezik. A találmány szerinti CTL-indukáló rákvakcinaként alkalmazható. A találmány szerinti rákvakcina alkalmazható sok, HLA A26¹ra vagy HLA A*01¹re pozitív rákos betegen. Szekvencialista kötetlen szövegrészeinek fordítása A SEQ ID NO: 2 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 3 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 4 alatt megadott aminosavszekvenciában a második aminosav leucin, metionin, valin, izoleucin vagy glutamin, míg a kilencedik aminosav valin vagy leucin. A SEQ ID NO: alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 6 alatt megadott ami- 12

13 nosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 7 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 8 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 9 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 11 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 12 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 13 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 14 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. A SEQ ID NO: 1 alatt megadott aminosavszekvencia szintetikus peptid. SZEKVENCIALISTA <1> Sugiyama, Haruo <1> Cancer antigen peptides derived from WT1 <1> 670 <> JP <11> <1> 1 <170> PatentIn version 3.2 <2> 1 <211> 449 <213> Homo sapiens <0> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 1 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 2 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 3 4 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 0 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 0 1 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser

14 HU T2 Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 24 2 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 3 34 Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 4 41 Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu <2> 2 <211> 9 <0> 2 Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg 1 <2> 3 <211> 9 14

15 HU T2 <0> 3 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 <2> 4 <211> 9 <221> misc_feature <222> (2).. (2) <223> Xaa jelentése Leu, Met, Val, Ile vagy Gln. <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa jelentése Val vagy Leu. <0> 4 Asp Xaa Asn Ala Leu Leu Pro Ala Xaa 1 <2> <211> 16 <0> Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 1 1 <2> 6 <211> 21 <0> 6 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 1 Ala Ser His Leu Glu <2> 7 <211> 16 <0> 7 Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 1 <2> 8 <211> 9 1

16 HU T2 <0> 8 Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 1 <2> 9 <2l11> 9 <0> 9 Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr 1 <2> <211> 9 <0> Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 1 <2> 11 <211> 9 <0> 11 Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg 1 <2> 12 <211> <0> 12 Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg 1 <2> 13 <211> 9 <0> 13 Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg 1 <2> 14 <211> 9 16

17 <0> 14 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 <2> 1 <211> 9 <0> 1 Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. A SEQ ID NO 2, 8 és 9 bármelyike szerinti aminosavszekvenciájú peptid alkalmazása HLA A26¹ra pozitív betegben rák kezelésére vagy megakadályozására szolgáló gyógyászati készítmény elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyászati készítmény rákvakcina. 3. A SEQ ID NO 2, 8 és 9 bármelyike szerinti aminosavszekvenciájú peptidet tartalmazó készítmény HLA A26¹ra pozitív betegben a rák kezelésére vagy megakadályozására szolgáló eljárásban való alkalmazásra. 4. A 3. igénypont szerint meghatározott alkalmazás, ahol a gyógyászati készítmény CTL-indukálóként kerül alkalmazásra. 2. A 3. igénypont szerint meghatározott alkalmazás, ahol a gyógyászati készítmény rákvakcinaként kerül alkalmazásra. 6. Antigénbemutató sejt, amelyen az 1. igénypont szerint meghatározott peptid és egy adott HLA A26 antigén közötti komplex bemutatásra kerül. 7. CTL, amely felismeri az 1. igénypont szerint meghatározott peptid és egy adott HLA A26 antigén komplexét. 8. HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer vagy ¹pentamer, amely HLA A26 antigénnel együtt tartalmaz 1. igénypont szerint meghatározott peptidet. 9. Reagens HLA A26¹ot kötõ, WT1-bõl származó rákantigénpeptidre specifikus CTL¹ek kimutatására, ahol a reagens egyik összetevõje a 8. igénypont szerint feltárt HLA-monomer, ¹dimer, ¹tetramer vagy ¹pentamer. 17

18 HU T2 Int. Cl.: C12N 1/09 18

19 HU T2 Int. Cl.: C12N 1/09 19

20 Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest