(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Méret: px
Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "(11) Lajstromszám: E 007 952 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA"

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1644 A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1644 B (1) Int. Cl.: C12N /7 (06.01) A61K 38/36 (06.01) C07K 14/74 (06.01) C12N 9/64 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/DK 04/ () Elsõbbségi adatok: P US DK (72) Feltalálók: HAANING, Jesper, Mortensen, DK-34 Birkerod (DK); ANDERSEN, Kim, Vilbour, DK-2700 Bronshoj (DK); BORNAES, Claus, DK-2900 Hellerup (DK) (73) Jogosult: Bayer HealthCare LLC, Berkeley CA 947 (US) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) VII vagy VIIA faktor Gla domén variánsok HU T2 A leírás terjedelme oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány területe A találmány tárgyát a VII faktor (FVII) vagy a VIIa faktor (FVIIa) polipeptidek új Gla domén variánsai képezik, valamint ilyen polipeptidvariánsok terápiában történõ alkalmazásra, különösen különféle koagulációval kapcsolatos rendellenességek kezelésére. A találmány háttere A véralvadás különféle vérkomponensek (vagy faktorok) komplex kölcsönhatásából álló folyamat, amely végsõ soron fibrinalvadékot eredményez. Általában az úgynevezett koagulációs kaszkádban részt vevõ vérkomponensek proenzimek vagy zimogének, azaz enzimatikusan inaktív fehérjék, amelyek aktív formává alakulnak egy aktivátor hatására. Ezen koagulációs faktorok egyike az FVII. Az FVII egy K¹vitamin-függõ plazmafehérje, amely a májban szintetizálódik, és a vérbe egyláncú glikoproteinként szekretálódik, amelynek a molekulatömege 3 kda (Broze & Majerus, J. Biol. Chem. 1980; 2: oldal). Az FVII zimogén aktivált formává (FVIIa) alakul át egyetlen helyen R2-I3 történõ proteolitikus hasítással, ami egyetlen diszulfidhíddal összekapcsolt két láncot eredményez. Az FVIIa szöveti faktorral komplexben (FVIIa komplex) képes átalakítani a IX¹es faktort (FIX) és X¹es faktort (FX) az aktivált formájukba, amelyet trombin és fibrin kialakulásához vezetõ gyors reakciók követnek (Østerud & Rapport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: oldal). Az FVII poszttranszlációs módosításokon megy keresztül, beleértve K¹vitamin-függõ karboxilációt, ami tíz ¹karboxi-glutaminsav-oldalláncot eredményez a molekula N¹terminális régiójában. Ily módon az 1. azonosító számú szekvencián bemutatott 6., 7., 14., 16., 19.,., 2., 26., 29. és 3. számú oldalláncok ¹karboxi-glutaminsav-oldalláncok a Gla doménben, amelyek fontosak az FVII aktivitásához. Más poszttranszlációs módosítások közé tartozik cukor-molekularész kapcsolása a két természetben elõforduló N¹glikozilációs helyhez a 14. és 322. pozícióban, és két természetben elõforduló O¹glikozilációs helyhez az 2. és. pozícióban. A humán FVII¹et (hfvii) kódoló gént a 13. kromoszómára térképezték a q34-qter 9 helyen (de Grouchy és munkatársai, Hum Genet 1984; 66: oldal). Az kilenc exont tartalmaz, és körülbelül 12,8 Kb méretû (O Hara és munkatársai, Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: oldal). Az FVII génszervezõdése és fehérjeszerkezete hasonlít a többi K¹vitamin-függõ prokoagulációs fehérjééhez, ahol az 1a és 1b exon kódolja a szignálszekvenciát; a 2. exon a propeptidet és a Gla domént; a 3. exon egy rövid hidrofób régiót; a 4. és. exon az epidermális növekedési hormonszerû doméneket; és a 6 8. exon a szerin proteáz katalitikus domént (Yoshitake és munkatársai, Biochemistry 198; 24: oldal). Vannak beszámolók a hfviia kísérletes háromdimenziós szerkezeteirõl (Pike és munkatársai, Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96: oldal és Kemball- Cook és munkatársai, J. Struct. Biol., 1999; 127: oldal); komplexben az oldható szöveti faktorral röntgenkrisztallográfiai eljárások alkalmazásával (Banner és munkatársai, Nature, 1996; 380:41. oldal és Zhang és munkatársai, J. Mol. Biol., 1999; 28: 89. oldal); és a hfvii kisebb fragmenseirõl (Muranyi és munkatársai, Biochemistry, 1998; 37:. oldal és Kao és munkatársai, Biochemistry, 1999; 38:7097. oldal). Az FVII viszonylag kevés génsebészetileg létrehozott variánsáról számoltak be (Dickinson & Ruf, J Biol Chem., 1997; 272: oldal; Kemball-Cook és munkatársai, J Biol Chem., 1998; 273: oldal; Bharadwaj és munkatársai, J Biol Chem., 1996; 271: oldal; Ruf és munkatársai; Biochemistry, 1999; 38: oldal). Vannak beszámolók FVII expresszáltatásáról BHK vagy más emlõssejtekben (WO 92/686, WO 91/114 és WO 88/29 számú nemzetközi közzétételi iratok) és FVII és kex2 endoproteáz együttes expresszáltatásáról eukarióta sejtekben (WO 00/2806 számú nemzetközi közzétételi irat). A rekombináns humán FVIIa (rhfviia) kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ készítményeit a Novo- Seven védjegy alatt árulják. A NovoSeven vérzéses epizódok kezelésére javallott A vagy B hemofíliás páciensekben. A NovoSeven az egyetlen, jelenleg a piacon hozzáférhetõ rhfviia, amely hatásos és megbízható vérzéses epizódok kezelésére. Beszámoltak az FVII inaktív formájáról a WO 91/114 számú nemzetközi közzétételi iratban, amelyben az arginin 2 és/vagy izoleucin 3 módosítva vannak. Ezek az aminosavak az aktiválási helyen vannak. A WO 96/12800 számú nemzetközi közzétételi irat az FVIIa szerin proteináz inhibitorral történõ inaktiválását ismerteti. Az FVIIa I3 ¹aminosavcsoportjánál történõ karbamoilációjával való inaktiválását leírták Petersen és munkatársai, Eur J Biochem, 1999; 261: oldal. Az inaktivált forma képes versengeni a vad típusú FVII-tel vagy FVIIa-val a szöveti faktor kötéséért, és az alvadási aktivitást gátolni. Az FVIIa inaktivált formáját javasolják hiperkoagulációs állapotoktól szenvedõ páciensek kezelésében történõ alkalmazásra, mint például szepszises páciensekben vagy akik szívinfarktus vagy trombotikus sztrók kockázatának vannak kitéve. A kontrollálatlan vérzések, mint például trauma kezelésével kapcsolatban úgy vélik, hogy az FVIIa képes aktiválni az FX¹et FXa¹vá a szöveti faktor kötése nélkül, és errõl az aktiválási reakcióról azt gondolják, hogy elsõsorban aktivált vérlemezkéken megy végbe (Hedner és munkatársai Blood Coagulation & Fibrinolysis, 00; 11; oldal). Azonban a hfviia-nak vagy rhfviia-nak alacsony az aktivitása az FX iránt szöveti faktor hiányában, és ennek következtében a kontrollálatlan vérzés kezelése, például traumás páciensekben hfviia vagy rhfviia viszonylag magas és többszöri dózisát igényli. Tehát a kontrollálatlan vérzés hatékonyabb kezelésére (a vérveszteség minimalizálására) szükség van javított FVIIa molekulákra, amelyeknek magas az aktivitása az FX iránt szöveti faktor hiányában. Ilyen javított FVIIa molekulák alacsonyabb alvadá- 2

3 si idõt (gyorsabb hatást/javított alvadási aktivitást) mutatnak, összehasonlítva az rhfviia-val, amikor kontrollálatlan vérzéssel kapcsolatosan beadják. FVII/FVIIa Gla domén variánsokat feltártak a WO 99/767 számú nemzetközi közzétételi iratban, az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban és WO 00/6673 számú nemzetközi közzétételi iratban, ahol a Gla doménben található bizonyos oldalláncokat fontosnak azonosítottak a foszfolipid membrán kötésében, és ily módon az FX aktiválásában. Közelebbrõl azt találták, hogy a. és 32. oldallánc kritikus volt, és megnövekedett foszfolipid membrán kötést, és ily módon megnövekedett FX¹aktiválást lehetett elérni a PQ és K32E mutációk végrehajtásával. Közelebbrõl azt találták, hogy az FX¹aktiválás fokozódott összehasonlítva az rhfviia-val marginális koagulációs körülmények között, mint például olyan körülmények között, amikor alacsony szintû szöveti faktor volt jelen. A WO01/893 számú nemzetközi közzétételi irat új stratégiát tár fel többek között megnövekedett féléletidejû FVII vagy FVIIa molekula kifejlesztésére, irányított glikoziláció vagy PEGiláció alkalmazásával. A WO03/09346 számú nemzetközi közzétételi irat a Gla doménben bizonyos módosításokat tartalmazó FVII vagy FVIIa variánsokat tár fel, amelyekbe egy vagy több N¹glikozilációs hely van beépítve a Gla doménen kívül. A WO 04/ számú nemzetközi közzétételi irat a szöveti faktor kötõhelyen bizonyos módosításokat tartalmazó FVII vagy FVIIa variánsokat tár fel. A feltalálók további oldalláncokat azonosítottak a Gla doménben, amelyek tovább növelik a foszfolipid membrán kötõ affinitást, és ily módon tovább növelik az FX¹aktiválást. A találmány szerinti FVII vagy FVIIa variánsok csökkent szöveti faktor kötõ affinitást is mutathatnak. A találmány célja javított FVII vagy FVIIa molekulák (FVII vagy FVIIa variánsok) biztosítása, amelyek hatékonyabban képesek az FX FXa¹vá történõ aktiválására, mint a hfviia, rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa. Közelebbrõl a találmány célja javított FVII vagy FVIIa molekulák (FVII vagy FVIIa variánsok) biztosítása, amelyek hatékonyabban képesek az FX FXa¹vá szöveti faktor hiányában történõ aktiválására, mint a hfviia, rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa. Ezeket a célokat oldják meg a találmány szerinti FVII vagy FVII variánsok. A találmány rövid összefoglalása Egy elsõ aspektusában a találmány tárgya VII¹es faktor (FVII) vagy VIIa faktor (FVIIa) polipeptid variáns, amelynek az aminosavszekvenciája 1 aminosav-oldalláncban eltér a humán VII¹es faktor (hfvii) vagy humán VIIa faktor (hfviia) 1. azonosító számú szekvencián bemutatott aminosavszekvenciájától, ahol negatívan töltött aminosav-oldallánc van beépítve szubsztitúcióval a 36. pozícióban. Egy második aspektusban a VII¹es faktor (FVII) vagy VIIa faktor (FVIIa) polipeptid variáns továbbá aminosavszubsztitúciót tartalmaz a 34. pozícióban Egy harmadik aspektusban a VII¹es faktor (FVII) vagy VIIa faktor (FVIIa) polipeptid variáns továbbá aminosavszubsztitúciót tartalmaz a. és/vagy 32. pozíciókban. A találmány további aspektusaiban a találmány tárgyát a találmány szerinti polipeptid variánsokat kódoló nukleotidszekvencia, a nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós vektor és a nukleotidszekvenciát vagy expressziós vektort tartalmazó gazdasejt képezik. A találmány tárgya további aspektusaiban a találmány tárgyát a találmány szerinti polipeptid variánsokat tartalmazó gyógyászati készítmény, a találmány szerinti polipeptid variánsok vagy a találmány szerinti gyógyászati készítmény gyógyszerként történõ alkalmazásra, valamint kezelési eljárásokban történõ alkalmazásra képezik. A találmány további aspektusai nyilvánvalóak az alábbi leírásból, valamint a csatolt igénypontokból. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra az alvadási idõt mutatja a találmány szerinti variánsok koncentrációfüggvényében, amikor a teljes vér vizsgálati eljárással mérjük. A 2. ábra a találmány szerinti variánsok maximális szövetifaktor-függõ trombin keletkezési sebességét mutatja be a trombogram vizsgálati eljárással meghatározva. A 3. ábra a találmány szerinti variánsok maximális foszfolipidfüggõ trombin keletkezési sebességét mutatja be a trombogram vizsgálati eljárással meghatározva. A találmány részletes leírása Definíciók A leírás és igénypontok összefüggésében a következõ definíciók érvényesek. Az FVII vagy FVII polipeptid kifejezés alatt FVII molekulát értünk egyláncú formában. FVII polipeptid egy példája a vad típusú humán (hfvii), amelynek az aminosavszekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. Nyilvánvaló azonban, hogy az FVH polipeptid kifejezés hfvii-szerû molekulákat is jelent, mint például az 1. azonosító számú szekvencia fragmenseit és variánsait, különösen olyan variánsokat, ahol a szekvencia legalább egy, mint például maximum, elõnyösen maximum aminosavmódosítást tartalmaz az 1. azonosító számú szekvenciával összehasonlítva. A FVIIa vagy FVIIa polipeptid kifejezés alatt FVIIa molekulát értünk az aktivált kétláncú formában. Amikor az 1. azonosító számú szekvencia szerinti aminosavszekvenciát alkalmazzuk az FVIIa aminosavszekvenciájának leírására, nyilvánvaló, hogy az egyláncú forma R2 és I3 oldalláncai között peptidkötés el lett hasítva, és az egyik lánc tartalmazza az 1 2. aminosav-oldalláncokat, és a másik lánc tartalmazza a 3 6. aminosav-oldalláncokat. 3

4 Az rfvii és rfviia kifejezések alatt rekombináns módszerekkel elõállított FVII és FVIIa polipeptideket értünk. A hfvii és hfviia kifejezések alatt rendre humán vad típusú FVII¹et és FVIIa¹t értünk, amelyek aminosavszekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. Az rhfvii és rhfviia kifejezés alatt humán vad típusú FVII¹et és FVIIa¹t értünk, amelyek aminosavszekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencián mutatjuk be, és rekombináns úton lettek elõállítva. Az rhfviia egy példája a NovoSeven. Amikor a leírás szerinti értelemben alkalmazzuk, a Gla domén kifejezés alatt az 1. azonosító számú szekvencia 1 4. aminosav-oldalláncai értendõk. Ennek megfelelõen a Gla doménen kívül elhelyezkedõ pozíció kifejezés az 1. azonosító számú szekvencia aminosav-oldalláncait jelenti. Az FX, TF és TFPI rövidítések jelentése rendre X¹es faktor, szöveti faktor és szöveti faktor útvonal inhibitor. A proteáz domén kifejezést az N¹terminálistól számított körülbelül 3 6. oldalláncokra alkalmazzuk. A katalitikus hely kifejezést a polipeptid variáns S344, D242 és H193 oldalláncaiból álló katalitikus triádra alkalmazzuk. A szülõi kifejezés alatt a találmány szerint módosítandó/javítandó molekula értendõ. Habár a találmány szerint módosítandó szülõi polipeptid bármilyen FVII vagy FVIIa polipeptid lehet, és ily módon bármilyen forrásból származhat, például nem humán emlõs forrásból, elõnyös, ha a szülõi polipeptid hfvii vagy hfviia. Variáns polipeptid olyan, amely egy vagy több aminosav-oldalláncban különbözik a szülõi polipeptidjétõl, normálisan 1 aminosav-oldalláncban (például 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14 vagy aminosav-oldalláncban), mint például 1 aminosav-oldalláncban, például 1 8, 1 6, 1 vagy 1 3 aminosavoldalláncban. Normálesetben a szülõi polipeptid hfvii vagy hfviia. A konjugátum (vagy felcserélhetõ módon konjugált polipeptid ) kifejezés alatt heterogén (kompozit vagy kiméra értelemben) molekulát értünk, amely egy vagy több polipeptidnek egy vagy több nem polipeptid molekularészhez, mint például polimer molekulákhoz, lipofil vegyületekhez, cukor-molekularészekhez vagy szerves derivatizáló ágensekhez való kovalens kapcsolásával alakul ki. Elõnyösen a konjugátum oldható releváns koncentrációkban és körülmények között, azaz oldható fiziológiás folyadékokban, mint például vérben. Konjugált találmány szerinti polipeptidek példái közé tartoznak glikozilált és/vagy PEGilált polipeptidek. A kovalens kapcsolás vagy kovalensen kapcsolt kifejezés alatt azt értjük, hogy a polipeptid variáns és a nem polipeptid molekularész vagy közvetlenül össze van kapcsolva egymással, vagy közvetve kovalensen össze van kötve egymással legalább egy közbensõ molekularészen, mint például híd, távtartó vagy kapcsoló molekularészen keresztül. A nem polipeptid molekularész kifejezés alatt aminosavmonomerekbõl álló és peptidkötésekkel összekapcsolt polipeptidpolimertõl eltérõ molekula értendõ, amely molekula képes a találmány szerint polipeptid variáns egy kapcsolócsoportjához történõ konjugálásra. Ilyen molekulák elõnyös példái közé tartoznak polimer molekulák, cukor-molekularészek, lipofil vegyületek vagy szerves derivatizáló ágensek. Amikor a találmány szerinti konjugált variánssal összefüggésben alkalmazzuk, nyilvánvaló, hogy a nem polipeptid molekularész a konjugált variáns polipeptid részéhez a polipeptid kapcsolócsoportján keresztül van hozzákötve. Amint fent elmagyaráztuk, a nem polipeptid molekularész közvetlenül vagy közvetve lehet hozzákötve a kapcsolócsoporthoz. Egy polimer molekula két vagy több monomer kovalens kötésével alakul ki, ahol a monomerek egyike sem aminosav-oldallánc, kivéve ahol a polimer humán albumin vagy más gyakori plazmafehérje. A polimer kifejezést felcserélhetõ módon alkalmazzuk a polimer molekula kifejezéssel. A kifejezés alatt értendõk in vitro glikozilációval kapcsolt szénhidrát-molekulák is, azaz in vitro végrehajtott szintetikus glikoziláció, amely normálesetben szénhidrát-molekula kovalens kapcsolását foglalja magában a polipeptid variáns egy kapcsolócsoportjához, adott esetben keresztkötõ ágens alkalmazásával. A cukor-molekularész kifejezés alatt egy vagy több monoszacharid-oldalláncot tartalmazó szénhidráttartalmú molekula értendõ, amely képes hozzákapcsolódni a polipeptid variánshoz (polipeptid variáns konjugátumot hozva létre glikozilált polipeptid variáns formájában), in vivo glikoziláció révén. Az in vivo glikoziláció kifejezés alatt bármilyen cukor-molekularész in vivo bekövetkezõ kapcsolódása értendõ, azaz poszttranszlációs processzálás folyamán a polipeptid variáns expresszáltatására alkalmazott glikozilálósejtben, például N¹kapcsolt vagy O¹kapcsolt glikozilálás révén. Az oligoszacharid pontos szerkezete nagymértékben függ a kérdéses glikoziláló organizmustól. Egy N¹glikozilációs hely szekvenciája N¹X¹S/T/C, ahol X jelentése bármilyen aminosav-oldallánc prolin kivételével, N jelentése aszparagin és S/T/C jelentése szerin, treonin vagy cisztein, elõnyösen szerin vagy treonin, és legelõnyösebben treonin. Elõnyösen az aszparagin-oldallánchoz képest +3 pozícióban lévõ aminosav-oldallánc nem prolinoldallánc. Egy O¹glikozilációs hely egy szerin vagy treonin oldallánc OH¹csoportja. A kapcsolócsoport kifejezés alatt a polipeptid variáns egy funkciós csoportja értendõ, elõnyösen annak aminosav-oldallánca vagy szénhidrát-molekularésze, amely képes nem polipeptid molekularész, mint például polimer molekula, lipofil molekula, cukor-molekularész vagy szerves derivatizáló ágens kapcsolására. Hasznos kapcsolócsoportok és az azoknak megfelelõ nem polipeptid molekularészek nyilvánvalóak az alábbi táblázatból. 4

5 Kapcsolócsoport Aminosav Nem polipeptid molekularész példái NH 2 N-terminális, Lys polimer, például PEG, amid- vagy imincsoporttal COOH C-terminális, Asp, Glu polimer, például PEG, észter- vagy amidcsoporttal szénhidrát-molekularész SH Cys polimer, például PEG, diszulfid¹, maleimidvagy vinil-szulfon-csoporttal szénhidrát-molekularész OH Ser, Thr, Lys, OH¹ cukor-molekularész PEG észter, éter, karbamát, karbonát CONH 2 Asn egy N¹glikozilációs cukor-molekularész hely részeként polimer, például PEG Aromás oldallánc Phe, Tyr, Trp szénhidrát-molekularész CONH 2 Gln szénhidrát-molekularész Aldehid Keton oxidált oligoszacharid polimer, például PEG, PEG-hidrazid Guanidino Arg szénhidrát-molekularész Imidazolgyûrû His szénhidrát-molekularész Konjugációs eljárás/aktivált PEG mpeg-spa trezilált mpeg mpeg¹hz in vitro kapcsolás PEG-vinil-szulfon PEG-maleimid in vitro kapcsolás in vivo O¹kapcsolt glikoziláció in vivo N¹glikoziláció in vitro kapcsolás in vitro kapcsolás PEGilálás in vitro kapcsolás in vitro kapcsolás Referencia Nektar Therapeutics Delgado és munkatársai, Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4): old. (1992) Nektar Therapeutics Nektar Therapeutics Delgado és munkatársai, Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4): old. (1992) Yan és Wold, Biochemistry, 1984, Jul 31; 23(16): old. Andresz és munkatársai, 1978, Macromol. Chem. 179:1. old., WO 92/16, WO 00/23114 számú nemzetközi közzétételi iratok Lundblad és Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc., Florida, USA mint a guanidin esetében 0 Az in vivo N¹glikoziláció esetében a kapcsolócsoport kifejezést nem hagyományos módon alkalmazzuk, hogy jelezzük az N¹glikozilációs helyet alkotó aminosav-oldalláncokat (a fent említett N¹X¹S/T/C szekvenciával). Habár az aszparagin-oldallánc az az N¹glikozilációs hely, amelyhez a cukor-molekularész kapcsolódik a glikoziláció folyamán, az ilyen kapcsolódás nem érhetõ el, csak ha az N¹glikozilációs hely többi oldallánca jelen van. Ennek megfelelõen, amikor a nem polipeptid molekularész cukor-molekularész, és a konjugálást in vivo N¹glikozilációval kívánjuk elérni, a nem polipeptid molekularész kapcsolására szolgáló kapcsolócsoportot tartalmazó aminosav-oldallánc kifejezés alatt a polipeptid aminosavszekvenciájának megváltoztatásával összefüggésben alkalmazva az értendõ, hogy egy in vivo N¹glikozilációs helyet alkotó egy vagy több aminosav-oldallánc megváltoztatandó oly módon, hogy mûködõképes in vivo N¹glikozilációs helyet építsünk be az aminosavszekvenciába. A bejelentésben az aminosavneveket és atomneveket (például CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C stb.) a Protein DataBank (PDB) ( definíciója szerint alkalmazzuk, ami a IUPAC-nómenklatúrán alapszik [ IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names, etc.), Eur. J. Biochem., 138, oldal (1984) azok korrekciójával együtt: Eur. J. Biochem., 2, 1. oldal (198)].

6 Az aminosav-oldallánc kifejezés alatt bármilyen természetes vagy szintetikus aminosav-oldallánc értendõ, és elsõsorban a természetben elõforduló aminosav által alkotott csoportba tartozó aminosav-oldallánc, azaz a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: alanin (Ala vagy A), cisztein (Cys vagy C), aszparaginsav (Asp vagy D), glutaminsav (Glu vagy E), fenil-alanin (Phe vagy F), glicin (Gly vagy G), hisztidin (His vagy H), izoleucin (Ile vagy I), lizin (Lys vagy K), leucin (Leu vagy L), metionin (Met vagy M), aszparagin (Asn vagy N), prolin (Pro vagy P), glutamin (Gln vagy Q), arginin (Arg vagy R), szerin (Ser vagy S), treonin (Thr vagy T), valin (Val vagy V), triptofán (Trp vagy W) vagy tirozin (Tyr vagy Y). Az aminosavpozíciók azonosítására alkalmazott terminológiát a következõképpen szemléltetjük: G124 azt jelzi, hogy a 124. pozíciót egy glicinoldallánc foglalja el az 1. azonosító számú szekvencián bemutatott aminosavszekvenciában. A G124R azt jelzi, hogy a 124. pozícióban található glicinoldallánc szubsztituálva lett argininoldallánccal. Az alternatív szubsztitúciókat / ¹lel jelöljük, például az N14S/T olyan aminosavszekvenciát jelent, amelyben a 14. pozícióban található aszparagin szubsztituálva van vagy szerinnel vagy treoninnal. Több szubsztitúciót + -szal jelölünk, például K143N+N14S/T olyan aminosavszekvenciát jelent, amely a 143. pozícióban található lizinoldallánc aszparagin-oldallánccal történõ szubsztitúcióját és a 14. pozícióban található aszparagin-oldallánc szerinvagy treoninoldallánccal történõ szubsztitúcióját tartalmazza. Egy további aminosav inszercióját, például alaninnak a G124 utáni inszercióját G124GA-nak jelöljük. Két további alaninoldallánc G124 utáni inszercióját G124GAA-val jelöljük stb. A leírás szerint az X pozícióba inszertált vagy az X pozíciónál inszertált kifejezés azt jelenti, hogy az aminosav-oldallánc(ok) az X. és X+1. aminosav-oldalláncok közé van beinszertálva. Egy aminosav-oldallánc delécióját *¹gal jelöljük. Például a 124. pozícióban található glicinoldallánc delécióját G124* jelöli. Hacsak másképpen nem jelezzük, az aminosav-oldalláncok számozása a hfvii/hfviia polipeptid (1. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciájához van viszonyítva. A különbözik vmitõl kifejezés alatt specifikus mutációkkal összefüggésben azt értjük, hogy további különbségek jelenléte is megengedett a meghatározott aminosavkülönbség mellett. Például a Gla doménben az FX¹aktiválás növelését célzó módosítások mellett a polipeptid tartalmazhat más módosításokat is, amelyek nem szükségszerûen kapcsolatosak ezzel a hatással. Ily módon a találmány szerinti aminosavmódosítások mellett nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polipeptid variáns aminosavszekvenciája kívánt esetben más változtatásokat is tartalmaz, azaz más szubsztitúciókat, inszerciókat vagy deléciókat. Ezek közé tartozhat például az N¹ vagy C¹terminális csonkolása egy vagy több aminosav-oldallánccal (például 1 aminosav-oldallánccal), vagy egy vagy több extra oldallánc hozzáadása az N¹ vagy C¹terminálishoz, például metionin-oldallánc hozzáadása az N¹terminálishoz vagy ciszteinoldallánc beépítése a C¹terminális közelében, valamint konzervatív aminosavszubsztitúciók, azaz hasonló tulajdonságú aminosavak, például kis aminosavak, poláris aminosavak, bázikus aminosavak, hidrofób aminosavak és aromás aminosavak csoportjain belül végrehajtott szubsztitúciók. Ilyen konzervatív szubsztitúciók példáit mutatjuk be az alábbi táblázatban. 1. Alanin (A) Glicin (G) Szerin (S) Treonin (T) 2. Aszparaginsav (D) 3. Aszparagin (N) Glutaminsav (E) Glutamin (Q) 4. Arginin (R) Hisztidin (H) Lizin (K). Izoleucin (I) Leucin (L) Metionin (M) 6. Fenil-alanin (F) Tirozin (Y) Triptofán (W) Valin (V) A további módosítások még más példáit a Gla doménen kívüli módosítások és Más módosítások a Gla doménen kívül címû szakaszokban tárjuk fel. A nukleotidszekvencia kifejezés alatt két vagy több nukleotidmolekula összefüggõ szakasza értendõ. A nukleotidszekvencia lehet genomiális, cdns, RNS, szemiszintetikus, szintetikus eredetû, vagy ezek bármilyen kombinációja. A vektor kifejezés alatt plazmidot vagy más nukleotidszekvenciát értünk, amely képes gazdasejtben való replikációra, vagy integrálódva van a gazdasejt genomjába, és önmagában hasznos különbözõ funkciók végrehajtására kompatibilis gazdasejtekkel együtt (vektor-gazda rendszer), hogy elõsegítse a nukleotidszekvencia klónozását, azaz a szekvencia hasznos mennyiségeinek elõállítását, hogy irányítsa a szekvencia által kódolt géntermék expresszióját, és hogy integrálja a nukleotidszekvenciát a gazdasejt genomjába. A vektor különbözõ komponenseket tartalmaz a végrehajtandó funkciótól függõen. A sejt, gazdasejt, sejtvonal és sejttenyészet kifejezéseket felcserélhetõ módon alkalmazzuk, és mindegyik kifejezés alatt értendõk az egy sejt növesztésébõl vagy tenyésztésébõl kapott utódok is. A transzformáció és transzfekció kifejezéseket felcserélhetõ módon alkalmazzuk, és DNS-nek sejtbe történõ bejuttatásának folyamatát jelenti. A mûködõképesen kapcsolt kifejezés alatt két vagy több nukleotidszekvencia kovalens kapcsolatát értjük, enzimatikus ligálással vagy másképpen, egymáshoz viszonyítva olyan konfigurációban, hogy a szekvenciák normális funkciója végrehajtódhasson. Általában a mûködõképesen kapcsolt kifejezés alatt azt értjük, hogy az összekapcsolt nukleotidszekvenciák összefüggõek, és szekréciós vezetõszekvencia esetében összefüggõek és azonos olvasási fázisban vannak. A kapcsolást kényelmes restrikciós helyeken történõ ligálással végezhetjük. Ha ilyen hely nem létezik, akkor szintetikus adaptereket és kapcsolómolekulákat 6

7 alkalmazunk, szokásos rekombináns DNS-eljárásokkal együtt. A találmány szerinti értelemben a módosítás vagy aminosavmódosítás kifejezés alatt aminosav-oldallánc helyettesítése, aminosav-oldallánc szubsztitúciója, aminosav-oldallánc deléciója vagy aminosav-oldallánc inszerciója értendõ. A beépít kifejezés alatt elsõsorban aminosav-oldallánc beépítését értjük, különösen meglévõ aminosav-oldallánc szubsztitúciójával, vagy más megoldásképpen további aminosav-oldallánc inszerciójával. Az eltávolít kifejezés alatt elsõsorban aminosavoldallánc eltávolítását értjük, különösen az eltávolítandó aminosav-oldallánc egy másik aminosav-oldallánccal történõ szubsztitúciójával, vagy más megoldásképpen az eltávolítandó aminosav-oldallánc deléciójával (szubsztitúció nélkül). A leírás szerinti értelemben az aktivitás kifejezés alatt a releváns aktivitás értendõ abban a vizsgálati eljárásban, amelyben az aktivitást aktuálisan mérjük. Ily módon az amidolitikus aktivitás kifejezés alatt az itt ismertetett amidolitikus vizsgálati eljárásban mért aktivitást értjük. Annak érdekében, hogy egy találmány szerinti variáns amidolitikus aktivitást mutasson az aktivált formájában, annak legalább az rhfviia amidolitikus aktivitásának %-ával kell rendelkeznie, amikor az itt ismertetett amidolitikus vizsgálati eljárásban mérjük. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az aktivált formájában a variáns amidolitikus aktivitása legalább %¹a az rhfviia-énak, mint például legalább %¹a, például legalább %¹a, elõnyösebben legalább 0%¹a, mint például legalább %¹a, például legalább 70%¹a, még elõnyösebben legalább 80%¹a, mint például legalább 90%¹a az rhfviia amidolitikus aktivitásának, amikor az itt ismertetett amidolitikus vizsgálati eljárásban mérjük. A variáns egy érdekes megvalósítási módja szerint az aktivált formájában az amidolitikus aktivitása lényegében azonos, mint az rhfviia¹é, mint például 7 12%¹a az rhfviia amidolitikus aktivitásának. Alvadási aktivitás kifejezés alatt az itt ismertetett teljes vér vizsgálati eljárásban mért aktivitást értjük, azaz az alvadék kialakulásához szükséges idõt. Ily módon az alacsonyabb alvadási idõ magasabb alvadási aktivitásnak felel meg. A megnövekedett alvadási aktivitás kifejezés alatt azt értjük, hogy a polipeptid variáns alvadási ideje statisztikailag szignifikánsan csökkent az rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa által létrehozottnál, összehasonlítható körülmények között meghatározva és az itt ismertetett teljes vér vizsgálati eljárásban mérve. A leírás szerinti értelemben az aktivitás kifejezést alkalmazzuk a variánsok FX FXa¹vá történõ aktiválási képességével kapcsolatban is. Ezt az aktivitást nevezzük FX aktiválási aktivitásnak vagy FXa generálási aktivitásnak is, és az itt ismertetett TF-független X¹es faktor aktiválási vizsgálati eljárással határozhatjuk meg. A megnövekedett FX aktiválási aktivitás vagy megnövekedett FXa generálási aktivitás kifejezést arra alkalmazzuk, hogy a találmány szerinti variánsnak az aktivált formájában statisztikailag szignifikáns módon emelkedett a képessége FX FXa¹vá történõ aktiválására, összehasonlítva referenciamolekulával, mint például rhfviia-val vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-val. Azt, hogy egy találmány szerinti variánsnak (az aktivált formájában) milyen mértékben megnövekedett Fx aktiválási aktivitása van, azt kényelmesen meghatározhatjuk az itt ismertetett TF-független X¹es faxtor aktiválási vizsgálati eljárásban. Az immunogenitás kifejezés alatt egy adott anyaggal összefüggésben az értendõ, hogy az anyag képes választ kiváltani az immunrendszerbõl. Az immunválasz lehet sejt- vagy ellenanyag-közvetített válasz [lásd például Roitt: Essential Immunology (. kiadás, kiad.: Blackwell) az immunogenitás további definíciójáért]. Normálesetben a csökkent ellenanyag-reaktivitás a csökkent immunogenitást jelezheti. Az immunogenitást bármilyen szakterületen ismert alkalmas eljárás alkalmazásával meghatározhatjuk, például in vivo vagy in vitro. A funkcionális in vivo féléletidõ kifejezést a normális jelentésében alkalmazzuk, azaz az az idõ, amelynél a polipeptid biológiai aktivitásának 0%¹a még jelen van a szervezetben/célszervben, vagy az az idõ, amelynél a polipeptid aktivitása a kiindulási érték 0%¹a. A funkcionális in vivo féléletidõ meghatározásának az alternatívájaként, meghatározhatjuk a szérum-féléletidõt, azaz azt az idõt, amelynél a polipeptid 0%¹a kering a plazmában vagy a véráramban, mielõtt kiürül. A szérum-féléletidõ meghatározása gyakran egyszerûbb, mint a funkcionális in vivo féléletidõ meghatározása, és a szérum-féléletidõ nagyságrendje gyakran jó jelzõje a funkcionális in vivo féléletidõ nagyságrendjének. A szérum-féléletidõ alternatív kifejezési közé tartozik a plazma-féléletidõ, keringési féléletidõ, szérumkiürülés, plazmakiürülés és kiürülési féléletidõ. A polipeptid a retikuloendoteliális rendszer (RES), vese, lép vagy máj közül egy vagy több mûködésének a következtében ürül ki, vagy szöveti faktor, SEC receptor vagy más receptor által közvetített eliminálással, vagy specifikus vagy nem specifikus proteolízis következtében. Normálesetben a kiürülés a polipeptid méretétõl (a glomeruláris szûrés vágási értékhez viszonyítva), töltésétõl, a kapcsolódó szénhidrátláncoktól és a fehérje celluláris receptorainak a jelenlététõl függ. A megtartandó funkcionalitás normálisan a prokoaguláns, proteolitikus vagy receptorkötõ aktivitás által alkotott csoportból van kiválasztva. A funkcionális in vivo féléletidõt és szérum-féléletidõt bármilyen, a szakterületen ismert alkalmas eljárás alkalmazásával meghatározhatjuk. A megnövekedett kifejezés alatt funkcionális in vivo féléletidõ vagy szérum-féléletidõ vonatkozásában az értendõ, hogy a polipeptid variáns releváns féléletideje szignifikánsan megnövekedett egy referenciamolekulához, mint például rhfviia-hoz vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-hoz viszonyítva, összehasonlítható körülmények között meghatározva (tipikusan kí- 7

8 sérleti állatban, mint például patkányokban, nyulakban, sertésekben vagy majmokban meghatározva). Az AUC iv vagy a görbe alatti terület intravénás beadás esetén kifejezést a normál jelentésében alkalmazzuk, azaz a szérum-idõ görbe aktivitás alatti terület, ahol a polipeptid variáns intravénásan volt beadva, különösen amikor patkányokban intravénásan van beadva. Tipikusan a mért aktivitás a fent definiált alvadási aktivitás. Ha egyszer a kísérletes aktivitás-idõ pontokat meghatároztuk, az AUC iv értéket kényelmesen kiszámíthatjuk számítógépi program, mint például GraphPad Prism 3.01 alkalmazásával. Nyilvánvaló, hogy különbözõ molekulák (például a találmány szerinti variánsok és referenciamolekula, mint például rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa) AUC iv értékei közötti közvetlen összehasonlítás megtétele érdekében ugyanakkora mértékû aktivitást kell beadni. Ennek következtében az AUC iv értékeket tipikusan normalizáljuk (azaz korrigáljuk az injektált dózis különbségeire) és AUC iv /beadott dózis értékként fejezzük ki. A proteolitikus degradációra való csökkent érzékenység kifejezés alatt elsõsorban az értendõ, hogy polipeptid variánsnak csökkent az érzékenysége a proteolitikus degradációra, összehasonlítva hfviia-val, rhfviia-val vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-val, összehasonlítható körülmények között meghatározva. Elõnyösen a proteolitikus degradáció legalább %-kal csökkent (például 2%-kal vagy 0%-kal), mint például legalább 2%-kal (például 2 0%-kal, 2 7%- kal vagy 2 0%-kal), elõnyösebben legalább 3%- kal, mint például legalább 0%-kal (például 0 7%- kal vagy 0 0%-kal), még elõnyösebben legalább %-kal, mint például legalább 7%-kal (például 7 0%-kal) vagy akár legalább 90%-kal. A renális kiürülés kifejezést a normál jelentésében alkalmazzuk, vesék általi bármilyen kiürítés jelölésére, például glomeruláris szûréssel, tubuláris kiválasztással vagy a tubuláris sejtekben történõ degradációval. A renális kiürülés a polipeptid fizikai tulajdonságaitól függ, beleértve a méretét (átmérõjét), hidrodinamikai térfogatát, szimmetriáját, alakját/merevségét és töltését. Normálesetben a körülbelül 67 kda molekulatömeget tekintik a renális kiürülés vágási értékének. A renális kiürülést bármilyen alkalmas vizsgálati eljárás alkalmazásával megállapíthatjuk, például egy elfogadott in vivo vizsgálati eljárással. Tipikusan a renális kiürülést jelzett (például radioaktívan vagy fluoreszcensen jelzett) polipeptid páciensnek történõ beadásával és a jel aktivitásának a pácienstõl gyûjtött vizeletben való mérésével állapítjuk meg. A csökkent renális kiürülést a megfelelõ referenciapolipeptidhez, például rhfviia-hoz vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-hoz viszonyítva határozzuk meg, összehasonlítható körülmények között. Elõnyösen a polipeptid variáns renális kiürülésének sebessége legalább 0%-kal, elõnyösen legalább 7%-kal, és legelõnyösebben legalább 90%-kal csökkent az rhfviia-hoz vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-hoz hasonlítva. A szöveti faktor kötõhely, aktív hely régió és az aktív hely kötõárok pereme kifejezéseket az 1. példában definiáljuk A hidrofób aminosav-oldallánc kifejezésbe tartoznak a következõ aminosav-oldalláncok: izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V), fenil-alanin (F), tirozin (Y) és triptofán (W). A negatívan töltött aminosav-oldallánc kifejezésbe tartoznak a következõ aminosav-oldalláncok: aszparaginsav (D) és glutaminsav (E). A pozitívan töltött aminosav-oldallánc kifejezésbe tartoznak a következõ aminosav-oldalláncok: lizin (K), arginin (R) és hisztidin (H). A találmány szerinti variánsok A szülõi polipeptid Gla doménjében végrehajtott módosítások elõnyösen a kapott molekulának megnövekedett foszfolipid membrán kötõ affinitást, FX FXa¹vá történõ aktiválásra való javított képességet és/vagy megnövekedett alvadási aktivitást biztosítanak. A találmány szerinti variánsoknak továbbá csökkent a szöveti faktor kötõ affinitása, és csökkent az aktivitása, amikor szöveti faktorhoz kötõdnek. Anélkül hogy egy bizonyos elméletre korlátoznánk magunkat, jelenleg úgy véljük, hogy a fokozott foszfolipid membrán kötõ affinitás az aktivált polipeptid variánsok magasabb lokális koncentrációját eredményezi a többi koagulációs faktor, különösen az FX közvetlen közelében. Ily módon az FX FXa¹vá történõ aktiválásnak a sebessége magasabb lesz, egyszerûen az aktivált FVII variáns FX¹hez viszonyított magasabb moláris aránya miatt. Az FX megnövekedett aktiválási sebessége azután nagyobb mennyiségû aktív trombint eredményez, és ily módon a fibrin keresztkötésének nagyobb sebességét. Ennek következtében a találmány tárgykörébe tartozik az, hogy a találmány szerinti polipeptid variánssal végzett orvosi kezelés elõnyös lehet a jelenleg elérhetõ rhfviia vegyülethez (NovoSeven ) képest, mint például alacsonyabb dózis, megnövekedett hatékonyság és/vagy gyorsabb hatás. Ezenkívül úgy véljük, hogy a szöveti faktortól független variánsok, azaz a csökkentett aktivitású variánsok, amikor kötve vannak szöveti faktorhoz, összehasonlítva vad típusú humán VIIa faktorral, bizonyos biztonságossági elõnyökkel is járhatnak a nemkívánatos vérrög-kialakulás (például trombózis vagy tromboembolizmus) kockázatának csökkenésével, különösen amikor akut kontrollálatlan vérzéses események, mint például trauma kezelésére vannak alkalmazva. Ily módon a találmány egy nagyon elõnyös megvalósítási módja szerint a polipeptid variánsnak az aktivált formájában és összehasonlítva referenciamolekulával, mint például rhfviia-val vagy [PQ+K32E]rhFVIIa, megnövekedett az FX aktiválási aktivitása, különösen amikor szöveti faktortól független vizsgálati eljárásban, mint például az itt feltárt TF-független X¹es faktor aktiválási vizsgálati eljárásban van mérve. Közelebbrõl elõnyös, ha a polipeptid variáns aktivált formában mért FX aktiválási aktivitásának és a referenciamolekula FX aktiválási aktivitásnak aránya legalább 1,2, amikor az itt feltárt TF-független X¹es faktor aktiválási vizsgálati eljárásban van mérve. Elõnyösebben ez az arány leg- 8

9 alább 1,, mint például legalább 1,7, például legalább 2, még elõnyösebben legalább 3, mint például legalább 4, legelõnyösebben legalább. Amikor a referenciamolekula rhfviia, a polipeptid variáns aktivált formában mért FX aktiválási aktivitásának és a referenciamolekula FX aktiválási aktivitásának aránya legalább, tipikusan legalább, amikor az itt feltárt TF-független X¹es faktor aktiválási vizsgálati eljárásban van mérve, mint például legalább vagy. A találmány egy másik nagyon elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti variánsoknak megnövekedett az alvadási aktivitása (azaz csökkent az alvadási idõ), összehasonlítva rhfviia-val vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-val. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a variáns alvadék kialakulási idejének (t variáns ) és az rhfviia (t wt ) vagy [PQ+K32E]rhFVIIa (t PQ+K32E ) alvadék kialakulási idejének aránya legfeljebb 0,9 amikor az itt ismertetett teljes vér vizsgálati eljárásban mérjük. Elõnyösebben ez az arány legfeljebb 0,7, mint például 0,7, még elõnyösebben legfeljebb 0,6, és legelõnyösebben legfeljebb 0,. Egy vagy több fent említett tulajdonságot a leírásban ismertetett módosításokkal érhetünk el. A 34. pozícióban hidrofób aminosav-oldalláncot tartalmazó találmány szerinti variánsok Amint fent jeleztük, egyik aspektusában a találmány tárgya FVII vagy FVIIa polipeptid variáns, amelynek az aminosavszekvenciája eltér az 1 aminosavoldalláncokban a hfvii vagy hfviia aminosavszekvenciájától (1. azonosító számú szekvencia), ahol egy hidrofób aminosav-oldallánc lett beépítve szubsztitúcióval a 34. pozícióban. A beépítendõ hidrofób aminosav-oldallánc az I, L, M, V, F, Y és W, elõnyösen az I, L és V által alkotott csoportból lehet kiválasztva, különösen elõnyösen L. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a variáns továbbá aminosavszubsztitúciót tartalmaz a. pozícióban, elõnyösen PQ¹t, és/vagy aminosavszubsztitúciót a 32. pozícióban, elõnyösen K32E¹t. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a variáns egyaránt tartalmazza a. és 32. pozíciók szubsztitúcióját, mint például PQ+K32E. Ennek megfelelõen a találmány egy érdekes megvalósítási módja szerint a variáns a PQ+K32E+A34L szubsztitúciókat tartalmazza. A találmány egy elõnyös érdekes megvalósítási módja szerint a variáns továbbá legalább egy (tipikusan egy) aminosav-oldallánc inszercióját tartalmazza a 3. és 4. pozíciók között. Elõnyös, ha a beinszertált aminosav-oldallánc hidrofób aminosav-oldallánc. Legelõnyösebben az inszerció A3AY. Ennek megfelelõen a találmány egy elõnyös érdekes megvalósítási módja szerint a variáns az A3AY+PQ+K32E+A34L módosításokat tartalmazza. A fent említett módosítások bármelyike mellett a variáns egy további szubsztitúciót tartalmazhat a 33. pozícióban. Elõnyösen egy hidrofób aminosav-oldalláncot inszertálunk be szubsztitúcióval a 33. pozícióban, elõnyösen D33F¹et. A Gla domén tartalmazhat módosításokat más pozíciókban is, elõnyösen a 8., 11. és 28. pozíciókban, mint például R28F vagy R28E. Másrészrõl nyilvánvaló, hogy a Gla domént nem szabad oly mértékben módosítani, hogy a membránkötõ tulajdonságai megzavaródjanak. Ennek megfelelõen elõnyös, ha nincsenek módosítások azokban az oldalláncokban, amelyek ¹karboxilálódnak, azaz elõnyös, ha nem végzünk módosításokat a 6., 7., 14., 16., 19.,., 2., 26., 29. és 3. oldalláncokban. Hasonló módon általában nem elõnyös, ha nem polipeptid molekularészeket, mint például cukor-molekularészeket és/vagy PEG csoportokat építünk be a Gla doménbe. Ennek következtében elõnyös, ha nincsenek olyan módosítások végezve a Gla doménben, amelyek in vivo N¹glikozilációs helyet hoznak létre. Végezetül nyilvánvaló, hogy az ebben a szakaszban tárgyalt módosítások a Gla doménben elõnyösen kombinálhatók egy vagy több pozíció módosításával, amelyek a Gla doménen kívül helyezkednek el (lásd az alábbi Módosítások a Gla doménen kívül és a Más módosítások a Gla doménen kívül címû szakaszokat). A 36. pozícióban aminosavszubsztitúciót tartalmazó találmány szerinti variánsok Amint fent jeleztük, a találmány tárgya FVII vagy FVIIa polipeptid variáns, amelynek az aminosavszekvenciája 1 aminosav-oldalláncban eltér a hfvii vagy hfviia aminosavszekvenciájától (1. azonosító számú szekvencia), ahol egy negatívan töltött aminosav-oldallánc lett beépítve szubsztitúcióval a 36. pozícióban. Elõnyösen a 36. pozícióban szubsztitúcióval beépítendõ aminosav-oldallánc negatívan töltött aminosav-oldallánc, például R36E vagy R36D, elõnyösen R36E. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a variáns továbbá aminosavszubsztitúciót tartalmaz a. pozícióban, elõnyösen PQ¹t, és/vagy aminosavszubsztitúciót a 32. pozícióban, elõnyösen K32E¹t. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a variáns egyaránt tartalmazza a. és 32. pozíciók szubsztitúcióját, mint például PQ+K32E. A találmány szerinti variáns továbbá szubsztitúciót tartalmazhat a 38. pozícióban. Elõnyös, ha a 38. pozícióba negatívan töltött aminosav-oldalláncot építünk be szubsztitúcióval, például K38E vagy K38D, elõnyösen K38E. Ennek megfelelõen azok az érdekes variánsok, amelyek a következõ szubsztitúciókat tartalmazzák: PQ+K32E+R36E vagy PQ+K32E+R36E+K38E. Egy különösen érdekes megvalósítási mód szerint a variáns továbbá aminosavszubsztitúciót tartalmaz a 34. pozícióban (azaz a kapott variáns a következõ oldalláncok szubsztitúcióját tartalmazza: vagy ). Elõnyösen negatívan töltött aminosav-oldalláncot építünk be szubsztitúcióval a 34. pozícióba, például A34E vagy A34D. 9

10 Az elõnyös variánsok specifikus példái azok, amelyek a következõ szubsztitúciókat tartalmazzák: PQ+K32E+A34E+R36E vagy PQ+K32E+A34D+R36E+K38E. A találmány egy érdekes megvalósítási módja szerint a variáns továbbá legalább egy (tipikusan egy) aminosav-oldallánc inszercióját tartalmazza a 3. és 4. pozíciók között. Elõnyös, ha a beinszertált aminosav-oldallánc hidrofób aminosav-oldallánc. Legelõnyösebben az inszerció A3AY. A fent említett módosítások bármelyike mellett a variáns egy további szubsztitúciót tartalmazhat a 33. pozícióban. Elõnyösen egy hidrofób aminosav-oldalláncot inszertálunk be szubsztitúcióval a 33. pozícióban, elõnyösen D33F¹et. A Gla domén tartalmazhat módosításokat más pozíciókban is, elõnyösen a 8., 11. és 28. pozíciókban, mint például R28F vagy R28E. Másrészrõl nyilvánvaló, hogy a Gla domént nem szabad oly mértékben módosítani, hogy a membránkötõ tulajdonságai megzavaródjanak. Ennek megfelelõen elõnyös, ha nincsenek módosítások azokban az oldalláncokban, amelyek ¹karboxilálódnak, azaz elõnyös, ha nem végzünk módosításokat a 6., 7., 14., 16., 19.,., 2., 26., 29. és 3. oldalláncokban. Hasonló módon általában nem elõnyös, ha nem polipeptid molekularészeket, mint például cukor-molekularészeket és/vagy PEG csoportokat építünk be a Gla doménbe. Ennek következtében elõnyös, ha nincsenek olyan módosítások végezve a Gla doménben, amelyek in vivo N¹glikozilációs helyet hoznak létre. Végezetül nyilvánvaló, hogy az ebben a szakaszban tárgyalt módosítások a Gla doménben elõnyösen kombinálhatók egy vagy több pozíció módosításával, amelyek a Gla doménen kívül helyezkednek el (lásd az alábbi Módosítások a Gla doménen kívül és a Más módosítások a Gla doménen kívül címû szakaszokat) A 74., 77. vagy 116. pozícióban aminosavszubsztitúciót tartalmazó találmány szerinti variánsok Amint fent jeleztük, egy harmadik aspektusában a találmány tárgya FVII vagy FVIIa polipeptid variáns, amelynek az aminosavszekvenciája 3 aminosavmódosításban eltér a hfvii vagy hfviia aminosavszekvenciájától (1. azonosító számú szekvencia), ahol az aminosavszekvencia aminosavszubsztitúciót tartalmaz a., 32. pozícióban, és legalább egy további aminosavszubsztitúciót a 74., 77. és 116. pozíciók által alkotott csoportból kiválasztott pozícióban. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az aminosavszubsztitúció a. pozícióban PQ és az aminosavszubsztitúció a 32. pozícióban K32E. Elõnyös továbbá, ha a szubsztitúció a 74., 77. vagy 116. pozícióban a P74S, E77A és E116D által alkotott csoportból van kiválasztva. Egy érdekes megvalósítási mód szerint a variáns továbbá aminosavszubsztitúciót tartalmaz a 34. pozícióban. Elõnyösen egy negatívan töltött aminosav-oldalláncot építünk be szubsztitúcióval a 34. pozícióba, például A34E vagy A34D, elõnyösen A34E. A találmány egy másik érdekes megvalósítási módja szerint a variáns továbbá legalább egy (tipikusan egy) aminosav-oldallánc inszercióját tartalmazza a 3. és 4. pozíciók között. Elõnyös, ha a beinszertált aminosav-oldallánc hidrofób aminosav-oldallánc. Legelõnyösebben az inszerció A3AY. Ily módon az érdekes variánsok specifikus példái közé tartoznak a következõ módosításokat tartalmazó variánsok: A3AY+PQ+K32E±E116D, A3AY+PQ+K32E+E77A és PQ+K32E+A34E+P74S. A fent említett módosítások bármelyike mellett a variáns egy további szubsztitúciót tartalmazhat a 33. pozícióban. Elõnyösen egy hidrofób aminosav-oldalláncot inszertálunk be szubsztitúcióval a 33. pozícióban, elõnyösen D33F¹et. A Gla domén tartalmazhat módosításokat más pozíciókban is, elõnyösen a 8., 11. és 28. pozíciókban, mint például R28F vagy R28E. Amint fent elmagyaráztuk, a Gla domént nem szabad oly mértékben módosítani, hogy a membránkötõ tulajdonságai megzavaródjanak, azaz elõnyösen nem végzünk módosításokat a 6., 7., 14., 16., 19.,., 2., 26., 29. és 3. oldalláncokban, és elõnyös, ha nem jön létre in vivo N¹glikozilációs hely a Gla doménben. Végezetül nyilvánvaló, hogy az ebben a szakaszban tárgyalt módosítások a Gla doménben elõnyösen kombinálhatók egy vagy több pozíció módosításával, amelyek a Gla doménen kívül helyezkednek el (lásd az alábbi Módosítások a Gla doménen kívül és a Más módosítások a Gla doménen kívül címû szakaszokat). Módosítások a Gla doménen kívül Az rhfvila 2,3 órás keringési féléletidejérõl számoltak be a Summary Basis for Approval for NovoSeven iratban, amelynek FDA referenciaszáma Viszonylag magas dózisokra és gyakori beadásra van szükség a kívánt terápiás és profilaktikus hatás eléréséhez és fenntartásához. Ennek következtében a megfelelõ dózisszabályozást nehéz elérni, és a gyakori intravénás beadás szükségessége korlátozza a páciens életmódját. Egy hosszabb keringési féléletidõvel és/vagy megnövekedett bioelérhetõséggel rendelkezõ (mint például nagyobb görbe alatti területtel rendelkezõ, összehasonlítva rhfviia-val, amikor intravénásan van beadva) molekula csökkentené a szükséges beadások számát. Figyelembe véve a jelenlegi, gyakori beadások szükségességét és a lehetõséget optimálisabb terápiás FVIIaszintek elérésére az ezzel járó fokozott terápiás hatással, nyilvánvalóan szükség van javított FVII vagy FVIIaszerû molekulákra. Ennek megfelelõen a találmány egy további célja javított FVII vagy FVIIa molekulák (FVII vagy FVIIa variánsok) biztosítása, amelyeknek megnövekedett a bioelérhetõsége (mint például megnövekedett görbe alatti terület összehasonlítva referenciamolekulával, mint például rhfviia-val vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-val,

11 amikor intravénásan van beadva), és amelyek hatékonyabban képesek a X¹es faktor Xa faktorrá történõ aktiválására (szöveti faktor kötése nélkül), mint egy referenciamolekula, mint például rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa (ezáltal képesek kontrollálatlan vérzés, mint például trauma, vagy krónikus állapotok, mint például hemofília hatékonyabb kezelésére). Ily módon a találmány szerinti érdekes variánsok azok, amelyek az aktivált formájukban és referenciamolekulával, mint például rhfviia-val vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-val összehasonlítva megnövekedett görbe alatti területet eredményeznek, amikor intravénásan vannak beadva (AUC iv ). Ezt kényelmesen meghatározhatjuk intravénás beadással patkányokban. Közelebbrõl érdekes találmány szerinti variánsok azok, amelyek esetében az aktivált formában lévõ variáns AUC iv értéke és referenciamolekula, mint például rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa AUC iv értékének aránya legalább 1,2, mint például legalább 1,, például legalább 1,7, elõnyösebben legalább 2, mint például legalább 3, még elõnyösebben legalább 4, mint például legalább, különösen amikor patkányoknak van (intravénásan) beadva. Ez a hatás gyakran korrelál megnövekedett funkcionális in vivo féléletidõvel és/vagy megnövekedett szérum-féléletidõvel referenciamolekulával, mint például rhfviia-val vagy [PQ+K32E]rhFVIIa-val összehasonlítva. Ennek megfelelõen a találmány egy másik érdekes megvalósítási módja szerint az aktivált formában lévõ variáns funkcionális in vivo féléletidejének vagy szérum-féléletidejének és egy referenciamolekula, mint például rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa funkcionális in vivo féléletidejének vagy szérum-féléletidejének az aránya legalább 1,2. Elõnyösebben az aktivált formában lévõ variáns releváns féléletidejének és a referenciamolekula, mint például rhfviia vagy [PQ+K32E]rhFVIIa releváns féléletidejének az aránya legalább 1,, mint például legalább 1,7, például legalább 2, még elõnyösebben legalább 3, mint például legalább 4, például legalább. Egy mód egy fehérje keringési féléletidejének növelésére annak biztosítása, hogy a fehérje renális kiürülése csökkentett. Ezt elérhetjük a fehérje olyan kémiai molekularészhez történõ konjugálásával, amely képes csökkentett renális kiürülés biztosítására, például polietilénglikol (PEG). Ezenfelül kémiai molekularész kapcsolása a fehérjéhez vagy proteolízisnek kitett aminosav-oldalláncok szubsztitúciója hatékonyan blokkolhatja egy proteolitikus enzim érintkezését, amely másképpen a fehérje proteolitikus degradációjához vezet. Amint fent jeleztük, a proteolitikus degradáció miatti instabilitás ismert probléma a jelenlegi rhfviia-kezelésben. A proteolitikus degradáció ily módon egy fõ akadály oldatban elõállított preparátum nyerésére, ellentétben a liofilizált termékével. A stabil oldat termék elõállításának az elõnye a könnyebb kezelhetõségben rejlik a páciens számára, és vészhelyzetben a gyorsabb cselekvésben, ami potenciálisan életmentõ lehet. A proteolitikus degradáció megakadályozására a fõ proteolitikus helyek helyspecifikus mutagenezisével végzett próbálkozásokat tár fel a WO 88/29 számú nemzetközi közzétételi irat. A WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi irat számos alkalmas módosítást tár fel, amelyek megnövekedett AUC iv -hez, funkcionális in vivo féléletidõhöz és/vagy szérum-féléletidõhöz vezetnek. A WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratban feltárt variánsok javított FVII vagy FVIIa molekulák egy általában új stratégiájának az eredményei, amely alkalmazható a találmány szerinti szülõi FVII vagy FVIIa polipeptidek esetében is. Közelebbrõl, egy nem polipeptid molekularész számára a szülõi FVII vagy FVIIa polipeptidben kapcsolócsoportot hordozó aminosav-oldallánc eltávolításával és/vagy beépítésével lehetséges specifikusan adaptálni a polipeptidet oly módon, hogy a molekula érzékenyebb legyen a választott nem polipeptid molekularész konjugálására, a konjugációs mintázat optimalizálására (például a nem polipeptid molekularészek optimális eloszlatására az FVII vagy FVIIa polipeptid variáns felszínén és annak biztosítására, hogy csak a szándékolt kapcsolócsoportok vannak jelen a molekulán), és ezáltal olyan új konjugált molekula elõállítására, amelynek amidolitikus aktivitása van, és emellett egy vagy több javított tulajdonsága az rhfviia-hoz képest. A találmány egy érdekes megvalósítási módja szerint egynél több, a Gla doménen kívül elhelyezkedõ aminosav-oldalláncot változtatunk meg, például a megváltoztatás magában foglalja kiválasztott nem polipeptid molekularész kapcsolócsoportját tartalmazó aminosav-oldalláncok eltávolítását, valamint beépítését. Az aminosav-oldalláncok eltávolítása és/vagy beépítése mellett a polipeptid variáns tartalmazhat más szubsztitúciókat, amelyek nem kapcsolatosak nem polipeptid molekularész számára kapcsolócsoportot jelentõ aminosav-oldalláncok beépítésével és/vagy eltávolításával. A polipeptid variáns szerin proteináz inhibitorhoz lehet kapcsolva, hogy gátolja polipeptid variáns katalitikus helyét. Más megoldásképpen a katalitikus helyen lévõ egy vagy több aminosav-oldallánc (S344, D242 és H193) mutáltatva lehet, hogy a kapott variánst inaktívvá tegyük. Ilyen mutáció egy példája az S344A. A nem polipeptid molekularész számára kapcsolócsoportot tartalmazó aminosav-oldalláncot akár eltávolítjuk, akár beépítjük a nem polipeptid molekularész természete alapján választjuk ki, és a legtöbb esetben azon eljárás alapján, amellyel a polipeptid variáns és a nem polipeptid molekularész közötti konjugációt elérjük. Például amikor a nem polipeptid molekularész polimer molekula, mint például polietilénglikol vagy polialkilén-oxid-eredetû molekula, a kapcsolócsoportot tartalmazó aminosav-oldalláncokat a lizin, cisztein, aszparaginsav, glutaminsav, hisztidin és tirozin, elõnyösen a lizin, cisztein, aszparaginsav és glutaminsav és elõnyösebben a lizin és cisztein alkotta csoportból választhatjuk ki, elõnyösen cisztein. Amikor a nem polipeptid molekularész számára kapcsolócsoport beépítendõ vagy eltávolítandó a szü- 11

12 lõi polipeptidbõl, a módosítandó aminosav-oldallánc pozíciója elõnyösen a szülõi FVII vagy FVIIa polipeptid felszínén található, és elõnyösebben olyan aminosavoldallánc foglalja el, amelynek az oldallánca legalább 2%-ban a felszínen található (amint az 1. példában definiáljuk), elõnyösen az oldalláncának legalább 0%¹a felszínen található (amint az 1. példában definiáljuk). Ilyen pozíciókat a hfvii vagy hfviia molekula WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett háromdimenziós szerkezetének az elemzése alapján azonosítottunk. Ezenfelül a módosítandó pozíciót elõnyösen az FVII vagy FVIIa molekula olyan részérõl választjuk ki, amely a szöveti faktor kötõhelyen kívül és/vagy az aktív hely régión kívül és/vagy az aktív hely kötõárkának peremén kívül található. Ezek a helyek/régiók a leírásbeli 1. példában és a WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratban vannak azonosítva. Kapcsolócsoport eltávolítása esetében az ilyen csoportot tartalmazó, és fent meghatározott pozíciót elfoglaló releváns aminosav-oldalláncot elõnyösen olyan eltérõ aminosav-oldallánccal szubsztituálunk, amely nem tartalmaz a kérdéses nem polipeptid molekularész számára kapcsolócsoportot. Normálesetben az eltávolítandó aminosav-oldallánc olyan, amelynek a konjugációja nem elõnyös, például a polipeptid egy funkcionális helyének közelében található aminosav-oldallánc (mivel a konjugáció az ilyen helyeken a keletkezett konjugátum inaktiválását vagy csökkent aktivitását eredményezheti, például a zavart receptorfelismerés miatt). A leírás szerinti értelemben a funkcionális hely kifejezés alatt egy vagy több olyan aminosav-oldallánc értendõ, amely esszenciális vagy másképpen részt vesz az FVII vagy FVIIa funkciójában vagy mûködésében. Ilyen aminosav-oldalláncok a funkcionális hely részei. A funkcionális helyet a szakterületen ismert eljárásokkal határozhatjuk meg, és elõnyösen az FVIIaszöveti faktor komplex szerkezetének elemzésével azonosítjuk (lásd Banner és munkatársai, Nature 1996; 380: oldal). Kapcsolócsoport beépítése esetében ilyen kapcsolócsoportot tartalmazó aminosav-oldalláncot építünk be a releváns pozícióba, elõnyösen az ilyen pozíciót elfoglaló aminosav-oldallánc szubsztitúciójával. A konjugáció számára hozzáférhetõ és az FVII vagy FVIIa polipeptiden jelen lévõ kapcsolócsoportok pontos száma az elérendõ konjugáció kívánt hatásától függ. Az elért hatás például függ a konjugáció természetétõl és mértékétõl (például a nem polipeptid molekularész típusától, a polipeptid variánshoz konjugálható nem polipeptid molekularészek kívánt vagy lehetséges számától, ahol azokat konjugálni kell, vagy el kell kerülni a konjugációjukat stb.) A szülõi FVII vagy FVIIa polipeptidben a Gla doménen kívül módosítandó aminosav-oldalláncok összes száma (az 1. azonosító számú szekvencián bemutatott aminosavszekvenciával összehasonlítva) tipikusan nem haladja meg a ¹et. Elõnyösen az FVII vagy FVIIa variáns olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely 1 aminosav-oldalláncban különbözik az azonosító számú szekvencia aminosav-oldalláncaitól, tipikusan 1 8 vagy 2 8 aminosav-oldalláncban, például 1 vagy 2 aminosav-oldalláncban, mint például 1 4 vagy 1 3 aminosav-oldalláncban, például 1 vagy 2 aminosav-oldalláncban különbözik az 1. azonosító számú szekvencia aminosavoldalláncaitól. Analóg módon a találmány szerinti polipeptid variáns 1 (további) nem polipeptid molekularészt tartalmazhat, tipikusan 1 8 vagy 2 8 (további) polipeptidmolekularészt, elõnyösen 1 vagy 2 (további) nem polipeptid molekularészt, mint például 1 4 vagy 1 3 (további) nem polipeptid molekularészt, például 1, 2 vagy 3 (további) nem polipeptid molekularészt. Nyilvánvaló, hogy az ilyen további nem polipeptid molekularészek kovalensen vannak hozzákapcsolva Gla doménen kívül elhelyezkedõ kapcsolócsoporthoz. Találmány szerinti polipeptid variánsok, ahol a nem polipeptid molekularész cukor-molekularész A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint cukor-molekularész számára való kapcsolócsoport, elõnyösen in vivo glikozilációs hely, mint például in vivo N¹glikozilációs hely lett beépítve és/vagy eltávolítva, elõnyösen beépítve a Gla doménen kívül elhelyezkedõ pozícióba. Amikor a leírás szerinti értelemben alkalmazzuk, a természetben elõforduló glikozilációs hely kifejezés alatt az N14, N322, S2 és S pozíciókat értjük. A természetben elõforduló in vivo O¹glikozilációs hely kifejezés az S2 és S pozíciókat foglalja magában, míg a természetben elõforduló in vivo N¹glikozilációs hely az N14 és N322 pozíciókat foglalja magában. Ily módon a találmány egy nagyon érdekes megvalósítási módja szerint a nem polipeptid molekularész cukor-molekularész, és a beépített kapcsolócsoport glikozilációs hely, elõnyösen in vivo glikozilációs hely, mint például in vivo O¹glikozilációs hely vagy in vivo N¹glikozilációs hely, elõnyösen in vivo N¹glikozilációs hely. Tipikusan 1 glikozilációs helyet, elõnyösen in vivo N¹glikozilációs helyet építettünk be, elõnyösen 1 8, 1 6, 1 4 vagy 1 3 glikozilációs helyet, elõnyösen in vivo N¹glikozilációs helyet építettünk be a Gla doménen kívül elhelyezkedõ egy vagy több pozícióba. Például 1, 2 vagy 3 glikozilációs helyet, elõnyösen in vivo N¹glikozilációs helyet építhetünk be a Gla doménen kívül, elõnyösen szubsztitúcióval. Nyilvánvaló, hogy az olyan polipeptid variáns elõállítása érdekében, ahol a polipeptid variáns egy vagy több glikozilációs helyet tartalmaz, a polipeptid variánst olyan gazdasejtben kell expresszáltatni, amely képes cukor- (oligoszacharid) molekularészek hozzákapcsolására a glikozilációs hely(ek)en vagy más megoldásképpen in vitro glikoziláció tárgya. Glikoziláló gazdasejtek példáit az alábbi Cukor-molekularész kapcsolása címû fejezetben adjuk meg. Olyan pozíciók példái közé, ahol a glikozilációs hely, elõnyösen in vivo N¹glikozilációs hely beépíthetõ, tartoznak olyan aminosav-oldalláncok, amelyek oldallánca legalább 2%-ban a felszínen található (amint az 12

13 1. példában definiáljuk), mint például az oldalláncának legalább 0%¹a felszínen található. Ezt a pozíciót elõnyösen a molekula olyan részérõl választjuk ki, amely a szöveti faktor kötõhelyen kívül és/vagy az aktív hely régión kívül és/vagy az aktív hely kötõárkának peremén kívül található, amint az 1. példában definiáljuk. Nyilvánvaló, hogy amikor a legalább 2%-ban (vagy legalább 0%-ban) a felszínen található kifejezést in vivo N¹glikozilációs hely beépítésével kapcsolatban alkalmazzuk, a kifejezés alatt az abban a pozícióban található aminosav-oldallánc felszíni hozzáférhetõségét értjük, ahová a cukor-molekularész ténylegesen kapcsolódik. Sok esetben szükséges lesz egy szerin- vagy egy treoninoldallánc beépítése ahhoz az aszparaginoldallánchoz +2 pozícióban, amelyhez a cukor-molekularész ténylegesen kapcsolódik, és ezek a pozíciók, ahol a szerin- vagy treoninoldalláncot beépítjük, el lehetnek temetve, azaz az oldalláncuk kevesebb mint 2%¹a lehet a felszínen található. Az in vivo N¹glikozilációs helyet létrehozó ilyen szubsztitúciók specifikus és elõnyös példái közé tartozik a következõk által alkotott csoportból kiválasztott szubsztitúció: A1N, G8N, T6N, K9N, G124N, K143N+N14T, A17T, IS, IT, V23N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R3N+V317S, R3N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N és ezek kombinációi. Elõnyösebben az in vivo N¹glikozilációs helyet a következõk által alkotott csoportból kiválasztott szubsztitúcióval építjük be: A1N, G8N, T6N, K9N, G124N, K143N+N14T, A17T, IT, V23N, T267N+S269T, S314N+K316T, R3N+V317T, K316N+G318T, G318N, D334N és ezek kombinációi. Még elõnyösebben az in vivo N¹glikozilációs helyet a következõk által alkotott csoportból kiválasztott szubsztitúcióval építjük be: T6N, A17T, IT, V23N, T267N+S269T és ezek kombinációi, elõnyösen a T6N, IT és V23N közül egy, kettõ vagy három. Egy megvalósítási mód szerint csak egy in vivo N¹glikozilációs helyet építettünk be szubsztitúcióval. Egy másik megvalósítási mód szerint két vagy több (mint például kettõ) in vivo N¹glikozilációs helyet építettünk be szubsztitúcióval. Két in vivo N¹glikozilációs helyet létrehozó elõnyös szubsztitúciók példái közé tartoznak a következõk által alkotott csoportból kiválasztottak: A1N+G8N, A1N+T6N, A1N+K9N, A1N+G124N, A1N+K143N+N14T, A1N+A17T; A1N+IT, A1N+V23N, A1N+T267N+S269T, A1N+S314N+K316T, A1N+R3N+V317T, A1N+K316N+G318T, A1N+G318N, A1N+D334N, G8N+T6N, G8N+K9N, G8N+G124N, G8N+K143N+N14T, G8N+A17T; G8N+IT, G8N+V23N, G8N+T267N+S269T, G8N+S314N+K316T, G8N+R3N+V317T, G8N+K316N+G318T, G8N+G318N, G8N+D334N, T6N+K9N, T6N+G124N, T6N+K143N+N14T, T6N+A17T, T6N+IT, T6N+V23N, T6N+T267N+S269T, T6N+S314N+K316T, T6N+R3N+V317T, T6N+K316N+G318T, T6N+G318N, T6N+D334N, K9N+G124N, K9N+K143N+N14T, K9N+A17T, K9N+IT, K9N+V23N, K9N+T267N+S269T, K9N+S314N+K316T, K9N+R3N+V317T, K9N+K316N+G318T, K9N+G318N, K9N+D334N, G124N+K143N+N14T, G124N+A17T, G124N+IT, G124N+V23N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R3N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N14T+A17T, K143N+N14T+IT, K143N+N14T+V23N, K143N+N14T+T267N+S269T, K143N+N14T+S314N+K316T, K143N+N14T+R3N+V317T, K143N+N14T+K316N+G318T, K143N+N14T+G318N, K143N+N14T+D334N, A17T+IT, A17T+V23N, A17T+T267N+S269T, A17T+S314N+K316T, A17T+R3N+V317T, A17T+K316N+G318T, A17T+G318N, A17T+D334N, IT+V23N, IT+T267N+S269T, IT+S314N+K316T, IT+R3N+V317T, IT+K316N+G318T, IT+G318N, IT+D334N, V23N+T267N+S269T, V23N+S314N+K316T, V23N+R3N+V317T, V23N+K316N+G318T, V23N+G318N, V23N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R3N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R3N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R3N+V317T+K316N+G318T, R3N+V317T+G318N, R3N+V317T+D334N és G318N+D334N. Elõnyösebben a szubsztitúciók a következõk által alkotott csoportból vannak kiválasztva: T6N+A17T, T6N+IT, T6N+V23N, T6N+T267N+S269T, A17T+IT, AI7T+V23N, A17T+T267N+S269T, IT+V23N, IT+T267N+S269T és V23N+T267N+S269T, még elõnyösebben a T6N+IT, T6N+V23N és IT+V23N által alkotott csoportból. Egy további megvalósítási mód szerint három vagy több (mint például három) in vivo N¹glikozilációs helyet építettünk be szubsztitúcióval. Három in vivo N¹glikozilációs helyet létrehozó elõnyös szubsztitúciók példái az IT+V23N+T267N+S269T és T6N+IT+V23N által alkotott csoportból vannak kiválasztva. Amint fent tárgyaltuk, elõnyös, ha az in vivo N¹glikozilációs hely olyan pozícióba van beépítve, amely nem képezi a szöveti faktor kötõhely és/vagy az aktív hely régió és/vagy az aktív hely kötõárkának peremének a részét, amint azt a leírásban definiáljuk. Nyilvánvaló, hogy a fenti szakaszokban említett bármely módosítások kombinálhatók egymással, amellett hogy kombinálva vannak a fent említett szubsztitúciókkal a 34. és/vagy 36. pozíciókban, elõnyösen az A34E/L és/vagy R36E szubsztitúciókkal, és elõnyösen 13

14 kombinálva a fent említett szubsztitúciókkal a. és/vagy 32. pozíciókban, elõnyösen a PQ és/vagy K32E szubsztitúciókkal. Egy in vivo N¹glikozilációs hely beépítésére szolgáló fent említett módosítások mellett elõnyös módosítások közé tartozik a T6N, IT és V23N közül egy, kettõ vagy három, elõnyösen kettõ ezen módosítások közül, azaz T6N+IT, T6N+V23N vagy IT+V23N. Ily módon a találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34E+R36E+T6N+IT módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34E+ R36E+T6N+V23N módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34E+R36E+ IT+V23N módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34L+T6N+ IT módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34L+T6N+ V23N módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34L+IT+ V23N módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34L+R36E+ T6N+IT módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34L+R36E+ T6N+V23N módosításokat tartalmazza. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint az FVII vagy FVIIa variáns a PQ+K32E+A34L+R36E+ IT+V23N módosításokat tartalmazza. Amint fent elmagyarázzuk, ezen módosítások közül egy vagy több emellett kombinálható legalább egy aminosav-oldallánc inszerciójával is, tipikusan egyetlen aminosav-oldalláncéval a 3. és 4. pozíció között, ahol a beinszertált oldallánc elõnyösen hidrofób oldallánc. Legelõnyösebben az inszerció A3AY. Ily módon a találmány további elõnyös megvalósítási módjai szerint az FVII vagy FVIIa variáns a következõ módosítások által alkotott csoportból kiválasztott módosítást tartalmaz: A3AY+PQ+K32E+A34E+R36E+T6N+IT A3AY+PQ+K32E+A34E+R36E+T6N+V23N A3AY+PQ+K32E+A34E+R36E+IT+V23N A3AY+PQ+K32E+A34L+T6N+IT A3AY+PQ+K32E+A34L+T6N+V23N A3AY+PQ+K32E+A34L+IT+V23N A3AY+PQ+K32E+A34L+R36E+T6N+IT A3AY+PQ+K32E+A34L+R36E+T6N+V23N A3AY+PQ+K32E+A34L+R36E+IT+V23N Más módosítások a Gla doménen kívül A találmány egy további megvalósítási módja szerint az FVII vagy FVIIa variáns a fent ismertetett módosítások mellett tartalmazhat olyan mutációkat is, amelyek más ismert módon növelik a polipeptid saját belsõ aktivitását, például a WO 02/22776 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtakat. Például a variáns legalább egy módosítást tartalmazhat a 7., 8., 296., 298.,., 334., 336., 337. és 374. pozíciók által alkotott csoportból kiválasztott pozíciókban. Az elõnyös szubsztitúciók példái közé tartoznak a V8D, E296D, M298Q, LV és K337A által alkotott csoportból kiválasztott szubsztitúciók. Elõnyösebben a szubsztitúciók a V8D+E296D+M298Q+LV+K337A, V8D+E296D+M298Q+K337A, V8D+E296D+M298Q+LV, V8D+E296D+M298Q, M298Q, LV+K337A, LV és K337A által alkotott csoportból vannak kiválasztva. A találmány egy további megvalósítási módja szerint az FVII vagy FVIIa variáns a fenti szakaszokban ismertetett módosítások mellett tartalmazhat más mutációkat is, mint például a K341Q szubsztitúciót, amelyet a Neuenschwander és munkatársai, Biochemistry, 199; 34: oldal irodalmi helyen tárnak fel. Más lehetséges további szubsztitúciók közé tartozik a D196K, D196N, G237L, G237GAA és ezek kombinációi. Az FVII vagy FVIIa variáns konjugációjáról további információ megtalálható a WO 01/893 és WO 03/09346 számú nemzetközi közzétételi iratokban, amelyek hivatkozás útján a kitanítás részét képezik. Eljárások a találmány szerinti konjugált variánsok elõállítására Általában a találmány szerinti konjugált variáns megfelelõ gazdasejt olyan körülmények között történõ tenyésztésével állítható elõ, amelyek lehetõvé teszik a variáns polipeptid expresszióját, és a variáns polipeptid visszanyerését, ahol a) a variáns polipeptid legalább egy N¹ vagy O¹glikozilációs helyet tartalmaz, és a gazdasejt eukarióta gazdasejt, amely képes in vivo glikozilációt, és/vagy b) a variáns polipeptidet nem polipeptid molekularészhez konjugáljuk in vitro. Konjugálás polimer molekulához A variáns polipeptidhez kapcsolandó polimer molekula bármilyen megfelelõ polimer molekula lehet, mint például természetben elõforduló vagy szintetikus homopolimer vagy heteropolimer, tipikusan Da molekulatömeg-tartományban, mint például Da, elõnyösebben Da, még elõnyösebben a körülbelül 2 12 kda tartományban, mint például a 3 kda tartományban. Amikor a körülbelül kifejezést egy bizonyos molekulatömeggel kapcsolatosan alkalmazzuk, a körülbelül szó egy megközelítõleges molekulatömeget jelez, és tükrözi azt a tényt, hogy normálesetben egy bizonyos molekulatömeg-eloszlás lesz egy adott polimer preparátumban. A homopolimerek példái közé tartozik a poliol (azaz poli¹oh), poliamin (azaz poli-nh 2 ) és polikarboxilsav (azaz poli-cooh). Egy heteropolimer olyan polimer, amely egy vagy több különbözõ kapcsolócsoportot tar- 14

15 talmaz, mint például hidroxilcsoportot és amincsoportot. Alkalmas polimer molekulák példái közé tartoznak a következõk által alkotott csoportból kiválasztott polimer molekulák: polialkilén-oxid (PAO), beleértve polalkilénglikol (PAG), mint például polietilénglikol (PEG) és polipropilénglikol (PPG), elágazó láncú PEG¹ek, poli(vinil-alkohol) (PVA), polikarboxilát, poli(vinil-pirrolidon), polietilén-komaleinsavanhidrid, polisztirol-komaleinsavanhidrid, dextrán, beleértve karboxi-metil-dextrán, vagy bármilyen más biopolimer, amely alkalmas az immunogenitás csökkentésére és/vagy a funkcionális in vivo féléletidõ és/vagy szérum-féléletidõ növelésére. Polimer molekula egy másik példája a humán albumin vagy más gyakori plazmafehérje. Általában a polialkilénglikol-eredetû polimerek biokompatibilisek, nem toxikusak, nem antigenikusak, nem immunogének, vízoldhatók, és könnyen kiválasztódnak élõ szervezetekbõl. A PEG az elõnyös polimer molekula, mivel csak néhány keresztkötésre alkalmas reaktív csoportot tartalmaz, összehasonlítva például a poliszacharidokkal, mint például dextránnal. Elõnyösen a monofunkciós PEG, például a monometoxi-polietilénglikol (mpeg) bír jelentõséggel, mivel a kapcsolási kémiája viszonylag egyszerû (csak egy reaktív csoport férhetõ hozzá a polipeptiden található kapcsolócsoportokkal történõ konjugálásra). Ennek megfelelõen a keresztkötés kockázata megszûnik, és a kapott polipeptidkonjugátumok homogénebbek, és a polimer molekulák reakcióját a variáns polipeptiddel könnyebb szabályozni. A polimer molekulá(k) variáns polipeptidhez történõ kovalens kapcsolásának elõidézéséhez a polimer molekula hidroxilcsoportjait aktivált formára kell hozni, azaz annak reaktív funkciós csoportokat kell tartalmaznia [amelyek példái közé tartoznak a primer aminocsoportok, hidrazid (HZ), tiol, szukcinát (SUC), szukcinimidil-szukcinát (SS), szukcinimidil-szukcinamid (SSA), szukcinimidil-proprionát (SPA), szukcinimidil-butirát (SBA), szukcinimidil-karboxi-metilát (SCM), benzotriazol-karbonát (BTC), N¹hidroxi-szukcinimid (NHS), aldehid, nitro-fenil-karbonát (NPC) és trezilát (TRES)]. Megfelelõ aktivált polimer molekulák kereskedelmi forgalomban kaphatók például a Nektar Therapeutics, Huntsville, AL, USA vagy a PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK cégtõl. A találmány szerinti alkalmazható aktivált lineáris vagy elágazó polimer molekulák specifikus példái megtalálhatók a Nektar Molecule Engineering Catalog 03 (Nektar Therapeutics) helyen, amely hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. Az aktivált PEG polimerek specifikus példái közé tartoznak a következõ lineáris PEG¹ek: NHS-PEG (például SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS¹PEG, SSA-PEG, SC¹PEG, SG¹PEG és SCM-PEG) és NOR- PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS¹PEG, DO- PEG és MAL-PEG, és elágazó láncú PEG¹ek, mint például PEG2-NHS és az US és US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban feltártak, amely mindkettõ hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. További publikációk, amelyek hasznos polimer molekulákat, PEG-ilációs reakciókat és konjugációs eljárásokat tárnak fel, a WO 01/893 és WO 03/09346 számú nemzetközi közzétételi iratokban vannak felsorolva. Ciszteinoldalláncok kapcsolására különösen elõnyös aktivált PEG polimerek specifikus példái közé tartoznak az alábbi lineáris PEG¹ek: vinil-szulfon-peg (VS-PEG), elõnyösen vinil-szulfon-mpeg (VS-mPEG); maleimid-peg (MAL-PEG), elõnyösen maleimidmpeg (MAL-mPEG) és ortopiridil-diszulfid-peg (OPSS-PEG), elõnyösen ortopiridil-diszulfid-mpeg (OPSS-mPEG). Tipikusan az ilyen PEG vagy mpeg polimerek mérete körülbelül kda, körülbelül kda, körülbelül 12 kda vagy körülbelül kda. A szakember számára nyilvánvaló, hogy az alkalmazandó aktivációs eljárás és/vagy konjugációs kémia a variáns polipeptid kapcsolócsoportja(i)tól (amelyek példáit fentebb mutatjuk be), valamint a polimer funkciós csoportjaitól (például amin, hidroxil, karboxil, aldehid vagy szulfhidril, szulfhidril, szukcinimidil, maleimid, vinil-szulfon vagy haloacetát) függ. A PEG-iláció a variáns polipeptiden található összes kapcsolócsoportra irányulhat (azaz azokra a kapcsolócsoportokra, amelyek hozzáférhetõk a polipeptid felszínén), vagy egy vagy több specifikus kapcsolócsoportra irányulhat, például az N¹terminális aminocsoportokra, amint az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetik, vagy a ciszteinoldalláncokra. Ezenfelül a konjugálást végezhetjük egy lépésben vagy lépésenként (például amint a WO 99/377 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetik). Ciszteinoldallánc PEG-ilációja esetében (lásd fent) az FVII vagy FVIIa variánst a PEG-ilációt megelõzõen általában redukálószerrel kezeljük, mint például ditiotreitollal (DDT). A redukálószert azután eltávolítjuk bármilyen hagyományos eljárással, mint például sótlanítással. A PEG ciszteinoldallánchoz történõ konjugációja tipikusan alkalmas pufferben megy végbe ph=6 9 értéken 4 C és 2 C közötti hõmérsékleten maximum 16 órán keresztül. Nyilvánvaló, hogy a PEG-ilálást úgy tervezzük meg, hogy optimális molekulát állítson elõ a kapcsolt PEG molekulák számának tekintetében, és az ilyen molekulák méretének és alakjának tekintetében (például hogy azok lineárisak¹e, vagy elágazóak), és hogy az ilyen molekulák hol kapcsolódnak a variáns polipeptidhez. Például az alkalmazandó polimer molekulatömegét az elérni kívánt hatás alapján választhatjuk meg. A fehérjén lévõ egyetlen kapcsolócsoporthoz (például az N¹terminális aminocsoporthoz) történõ konjugálás esetében elõnyös lehet, ha a polimer molekulának amely lehet lineáris vagy elágazó magas a molekulatömege, elõnyösen körülbelül 2 kda, mint például körülbelül 2 kda, például körülbelül kda. Normálesetben a polimer konjugálását olyan körülmények között végezzük, amelyek az összes elérhetõ polimer kapcsolócsoport reagáltatását célozzák a poli-

16 mer molekulákkal. Ezt a polimernek a polipeptidhez viszonyított alkalmas moláris feleslegének alkalmazásával érjük el. Tipikusan az aktivált polimer molekulák és a polipeptid mólaránya legfeljebb 00:1, mint például 0:1, vagy legfeljebb 0:1. Azonban bizonyos esetekben az arány valamivel alacsonyabb lehet, mint például körülbelül 0:1, :1, :1, 2:1 vagy 1:1, annak érdekében, hogy optimális reakciót érjünk el. A találmány tárgykörébe tartozik a polimer molekula kapcsolómolekulán keresztül történõ kapcsolása a polipeptidhez. Alkalmas kapcsolómolekulák ismertek a szakember számára. Lásd még a WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratot. A konjugálást követõen a fennmaradó aktivált polimer molekulákat blokkoljuk szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, például primer aminnak a reakcióelegyhez történõ hozzáadásával, és a kapott inaktivált polimer molekulákat eltávolítjuk megfelelõ eljárás alkalmazásával. Nyilvánvaló, hogy a körülményektõl például a variáns polipeptid aminosavszekvenciájától, az alkalmazott aktivált PEG vegyület természetétõl és a specifikus PEG-ilációs körülményektõl, beleértve a PEG és polipeptid moláris arányát függõen változó mértékû PEG-ilációt érhetünk el, ahol a nagyobb mértékû PEGilációt általában nagyobb PEG:variáns polipeptid aránnyal érjük el. A bármilyen PEG-ilációs eljárással kapott PEG-ilált variáns polipeptidek azonban normálesetben a konjugált polipeptid variánsok sztochasztikus eloszlását tartalmazzák kissé eltérõ mértékû PEGilációval. Kapcsolás cukor-molekularészhez Az egy vagy több glikozilációs helyet tartalmazó FVII vagy FVIIa molekula in vivo glikozilációjának elérése érdekében a variáns polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát be kell inszertálni glikoziláló eukarióta expressziós gazdába. Az expressziós gazdasejt lehet gombából (fonalas gombából vagy élesztõbõl), rovarból vagy állati sejtbõl vagy transzgenikus növényi sejtbõl származó. Egy megvalósítási mód szerint a gazdasejt emlõssejt, mint például CHO sejt, BHK vagy HEK, például HEK 293 sejt, vagy rovarsejt, mint például SF9 sejt, vagy élesztõsejt, például Saccharomyces cerevisiae vagy Pichia pastoris, vagy a leírásban ezután említett gazdasejtek bármelyike. Szintén alkalmazhatjuk cukor-molekularészeknek (mint például dextrán) a variáns polipeptid aminosavoldalláncaihoz történõ kovalens in vitro kapcsolását, például amint a WO 87/03 számú nemzetközi közzétételi iratban és az Aplin és munkatársai, CRC Crit Rev. Biochem, oldal, 1981 irodalmi helyen ismertetik. Lásd még a WO 03/09346 számú nemzetközi közzétételi iratot további információért az FVII vagy FVIIa variánsok in vitro glikozilációjáért. Szerin proteáz inhibitor kapcsolása Szerin proteáz inhibitor kapcsolását a WO 96/12800 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett eljárás szerint hajthatjuk végre Eljárások találmány szerinti polipeptid variáns elõállítására A találmány szerinti polipeptid variánst adott esetben glikozilált formában a szakember számára ismert bármilyen alkalmas eljárással elõállíthatjuk. Ilyen eljárások közé tartozik a polipeptid variánst kódoló nukleotidszekvencia létrehozása és a szekvencia expresszáltatása alkalmas transzformált vagy transzfektált gazdában. Elõnyösen a gazdasejt gamma-karboxiláló gazdasejt, mint például emlõssejt. Azonban a találmány szerinti polipeptid variánsokat elõállíthatjuk noha kevésbé hatékonyan kémiai szintézissel vagy kémiai szintézis kombinációjával vagy kémiai szintézis és rekombináns DNS módszerek kombinációjával. A találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát a szülõi FVII¹et, mint például az 1. azonosító számú szekvencia szerinti aminosavszekvenciájú hfvii¹et kódoló nukleotidszekvencia izolálásával vagy megszintetizálásával állíthatjuk elõ, és azután a nukleotidszekvencia megváltoztatásával oly módon, hogy a releváns aminosav-oldallánc(ok) beépítését (azaz inszercióját vagy szubsztitúcióját) vagy delécióját (azaz eltávolítását vagy szubsztitúcióját) hozhatjuk létre. A nukleotidszekvenciát kényelmesen módosíthatjuk helyspecifikus mutagenezissel hagyományos eljárások alkalmazásával. Más megoldásképpen a nukleotidszekvenciát kémiai szintézissel állítjuk elõ, például oligonukleotidszintetizátor alkalmazásával, ahol az oligonukleotidokat a kívánt polipeptid aminosavszekvenciája alapján tervezzük meg, és elõnyösen azokat a kodonokat választjuk ki, amelyek elõnyösek abban a gazdasejtben, amelyben a rekombináns polipeptidet termelni fogjuk. Például számos, a kívánt polipeptid részleteit kódoló kis oligonukleotidot szintetizálhatunk meg, és állíthatunk össze polimeráz-láncreakcióval (PCR), ligálással vagy ligációs láncreakcióval (LCR) (Barany, Proc Natl Acad Sci USA 88: old., 1991). Az egyedi oligonukleotidok tipikusan vagy 3 túlnyúló részeket tartalmaznak a komplementer összeállítás céljából. Ha egyszer összeállítottuk (szintézissel, helyspecifikus mutagenezissel vagy más eljárással), a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát rekombináns vektorba inszertáljuk, és mûködõképesen kapcsoljuk szabályozószekvenciákhoz, amelyek szükségesek az FVII expresszáltatásához a kívánt transzformált gazdasejtben. A szakember képes kiválasztani az alkalmas vektorokat, expressziós szabályozószekvenciákat és gazdákat a polipeptid expresszáltatásához. A rekombináns vektor lehet autonóm módon replikálódó vektor, azaz olyan vektor, amely extrakromoszomális entitásként létezik, amelynek a replikációja független a kromoszomális replikációtól, például egy plazmid lehet. Más megoldásképpen a vektor olyan, amely amikor bejuttatjuk gazdasejtbe, integrálódik a gazdasejt genomjába, és együtt replikálódik a kromoszómá(k)kal, amelybe integrálódott. A vektor elõnyösen expressziós vektor, amelyben a találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia mûködõképesen kapcsolva van további szeg- 16

17 mensekhez, amelyek szükségesek a nukleotidszekvencia transzkripciójához. A vektor tipikusan plazmidból vagy virális DNS-bõl származik. Számos alkalmas expressziós vektor kereskedelmi forgalomban kapható vagy ismert a szakirodalomból a leírásban említett gazdasejtekben történõ expresszáltatás céljából. Az FVII expresszáltatására alkalmas vektorokról részletes információ található a WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratban, amely a kitanítás részét képezi. A szabályozószekvenciák kifejezésbe a leírás szerinti értelemben beleértendõ minden olyan komponens, amely szükséges vagy elõnyös a találmány szerinti polipeptid variáns expressziójához. Bármelyik szabályozószekvencia lehet natív vagy idegen a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához viszonyítva. Az ilyen szabályozószekvenciák nem korlátozó példái közé tartozik a vezetõszekvencia, poliadenilációs szekvencia, propeptidszekvencia, promoter, enhanszer vagy leolvasással ellentétes irányban lévõ aktiválószekvencia, szignálpeptid-szekvencia és transzkripciós terminátor. Minimumként a szabályozószekvencia legalább promotert tartalmaz. Nagyszámú különféle expressziós szabályozószekvenciát alkalmazhatunk a találmány szerint, például a WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratban feltárt szabályozószekvenciák bármelyike, amely hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. A polipeptid variánst kódoló találmány szerinti nukleotidszekvenciák, akár helyspecifikus mutagenezissel, akár szintézissel vagy más eljárásokkal vannak elõállítva, tartalmazhatnak olyan nukleotidszekvenciát, amely szignálpeptidet kódol. A szignálpeptid akkor van jelen, amikor a polipeptidet szekretálni kell abból a sejtbõl, amelyben expresszálódik. Az ilyen szignálpeptidet, amennyiben jelen van, fel kell ismernie a polipeptid variáns expresszáltatásához kiválasztott sejtnek. A szignálpeptid lehet homológ (például amely normális esetben kapcsolódik a hfvii-hez) vagy heterológ (azaz a hfvii-tõl különbözõ forrásból származó) a polipeptidhez viszonyítva, vagy lehet homológ vagy heterológ a gazdasejthez viszonyítva, azaz lehet olyan szignálpeptid, amely normális esetben expresszálódik a gazdasejtbõl, vagy normális esetben nem expresszálódik a gazdasejtbõl. További információért az alkalmas szignálpeptidekrõl lásd a WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratot. Bármilyen alkalmas gazdát alkalmazhatunk a polipeptid variáns elõállítására, beleértve baktériumokat, gombákat (beleértve élesztõket), növényi, rovar¹, emlõs- vagy más megfelelõ állati sejteket vagy sejtvonalakat, valamint transzgenikus állatokat vagy növényeket. Az emlõssejtek elõnyösek. Bakteriális gazdasejtek példái közé tartoznak Gram-pozitív baktériumok, mint például Bacillus törzsei, például B. brevis vagy B. subtilis, Pseudomonas vagy Streptomyces, vagy Gram-negatív baktériumok, mint például E. coli-törzsei. Alkalmas fonalas gomba gazdasejtek példái közé tartoznak az Aspergillus törzsei, például A. oryzae, A. niger vagy A. nidulans, Fusarium vagy Trichoderma. Alkalmas élesztõ gazdasejtek példái közé tartoznak a Saccharomyces törzsei, például S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, mint például P. pastoris vagy P. methanolica, Hansenula, mint például H. Polymorpha vagy Yarrowia. Alkalmas rovar gazdasejtek példái közé tartozik a Lepidoptora sejtvonal, mint például Spodoptera frugiperda (Sf9 vagy Sf21) vagy Trichoplusioa ni sejtek (High Five) (US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Alkalmas emlõs gazdasejtek közé tartoznak kínai aranyhörcsög petefészek (CHO) sejtvonalak (például CHO¹K1; ATCC CCL¹61), zöldmajom sejtvonalak (COS) [például COS 1 (ATCC CRL-1), COS 7 (ATCC CRL-161)]; egérsejtek (például NS/O), bébihörcsög vese (BHK) sejtvonalak (például ATCC CRL-1632 vagy ATCC CCL¹) és humán sejtek [például HEK 293 (ATCC CRL-73)]. További alkalmas sejtvonalak ismertek a szakterületen, és hozzáférhetõk nyilvános letéti intézményektõl, mint amilyen például az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland). Ezenkívül az emlõssejtek, mint például egy CHO sejt, módosíthatók, hogy szialil-transzferázt, például 1,6-szialil-transzferázt expresszáljanak, például amint az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírják, annak érdekében, hogy javítsuk a polipeptid variáns glikozilációját. A szekréció növelése érdekében különösen érdekes lehet a találmány szerinti polipeptid variánsnak endopeptidázzal együtt történõ elõállítása, különösen egy PACE-vel ( paired basic amino acid converting enzyme ) együtt (például mint az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetik), mint például egy Kex2 endoproteázzal (például amint a WO 00/2806 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetik). Exogén DNS-nek a fenti sejttípusokba történõ bejuttatására szolgáló eljárások, valamint más információ FVII variánsok expressziója, elõállítása és tisztítása tekintetében megtalálható a WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi iratban, amely hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. A találmány szerinti gyógyászati készítmény és alkalmazása Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya készítmény, elõnyösen gyógyászati készítmény, amely találmány szerinti polipeptid variánst tartalmaz gyógyászatilag elfogadható hordozóban vagy excipiensben. A találmány szerinti polipeptid variáns vagy gyógyászati készítmény gyógyszerként alkalmazható. A fent említett javított tulajdonságok miatt a találmány szerinti polipeptid variánsok vagy a találmány szerinti gyógyászati készítmény különösen hasznosak traumás páciensek kontrollálatlan vérzéses eseményei, trombocitopéniás páciensek, antikoagulációs kezelésben részesülõ páciensek és variceális vérzéses cirrózisos páciensek, vagy más felsõ gasztrointesztinális vérzéses páciensek, ortotopikus májtranszplantáción vagy májkimetszésen (ami transzfúziómentes mûtétet tesz lehetõvé) átesõ páciensek vagy hemofíliás páciensek kezelésére. 17

18 A traumát olyan sérülésként definiáljuk, amelyet külsõ ágens okoz. Ez a 4. vezetõ halálok az Amerikai Egyesült Államokban, és nagy terhet ró a gazdaságra. A traumát tompának vagy áthatolónak osztályozzuk. A tompa trauma belsõ összenyomódást, szervkárosodást és belsõ vérzéseket eredményez, míg az áthatoló trauma (ami egy, a szervezeten áthatoló ágens következménye, és szöveteket, ereket és szerveket károsít) külsõ vérzést eredményez. Traumát számos esemény okozhat, például közlekedési balesetek, lõtt sebek, esések, gépbalesetek és szúrt sebek. A máj cirrózisát közvetlenül a máj sérülése okozhatja, beleértve a krónikus alkoholizmust, krónikus virális hepatitiszt (B, C és D típusú), és autoimmun hepatitiszt, valamint közvetett sérülést az epevezeték sérülése miatt, beleértve az elsõdleges epecirrózist, elsõdleges szklerotizáló kolangitiszt és epeatréziát. A cirrózis kevésbé gyakori okai közé tartozik a közvetlen májsérülés öröklött betegség miatt, mint például cisztás fibrózis, alfa-1-antitripszin deficiencia, hemokromatózis, Wilson-kór, galaktozémia és glikogéntárolási betegség. A transzplantáció a kulcsfontosságú beavatkozás késõi stádiumban lévõ cirrózisos páciensek esetében. Ily módon egy további aspektusában a találmány tárgya találmány szerinti polipeptid variáns alkalmazása gyógyszer gyártására olyan betegségek vagy rendellenességek kezelésére, amelyekben kívánatos vérrög kialakulása. A találmány tárgyát képezik találmány szerinti variánsok is emlõs kezelésére szolgáló eljárásban történõ alkalmazásra, amely emlõsnek olyan rendellenessége van, ahol kívánatos vérrög kialakulása, amely eljárás magában foglalja az azt igénylõ emlõsnek a találmány szerinti polipeptid variáns vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének beadását. Olyan betegségek/rendellenességek, ahol megnövekedett vérrög-kialakulás kívánatos, nem korlátozó példái közé tartoznak a hemorrágiák, beleértve agyi hemorrágiák, valamint páciensek súlyos kontrollálatlan vérzéssel, mint például traumával. További példák közé tartoznak májtranszplantáción átesõ páciensek, kimetszésen átesõ páciensek és variceális vérzéses páciensek. Egy másik elterjedt betegség/rendellenesség, amelyben elképzelhetõ, hogy a találmány szerinti polipeptidek hasznosak lehetnek megnövekedett vérrögképzésre, a hemofília, például von Willebrand-betegség, hemofília¹a, hemofília¹b vagy hemofília¹c. A találmány szerinti polipeptid variánsokat terápiásan hatásos dózisokban adjuk be pácienseknek, normálesetben megközelítõleg olyanban, amely párhuzamba állítható az rfvii-tel, mint például a NovoSeven -nel végzett terápiával, vagy annál alacsonyabb dózisokkal. A terápiásan hatásos dózis kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben olyan dózist értünk, amely elegendõ a kívánt hatás kiváltására azzal az állapottal kapcsolatosan, amelyre beadjuk. A pontos dózis függ a körülményektõl, és megállapítható a szakember számára ismert módszerek alkalmazásával. Normálesetben a dózisnak képesnek kell lennie megelõzni vagy csökkenteni a kezelt állapot vagy indikáció súlyosságát vagy elterjedését. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polipeptid variáns vagy készítmény hatásos mennyisége többek között függ a betegségtõl, a dózistól, a beadási rendtõl, attól, hogy a polipeptid variánst vagy készítményt egymagában adjuk¹e be, vagy más terápiás ágenssel együtt, a készítmények szérum-féléletidejétõl és a páciens általános egészségi állapotától. A találmány szerinti polipeptid variánst elõnyösen olyan készítményben adjuk be, amely továbbá gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy excipienst is tartalmaz. A gyógyászatilag elfogadható kifejezés alatt olyan hordozót vagy excipienst értünk, amely nem okoz semmilyen kellemetlen hatást azokban a páciensekben, amelyeknek azt beadjuk. Ilyen gyógyászatilag elfogadható hordozók és excipiensek, valamint alkalmas gyógyászati kiszerelési eljárások jól ismertek a szakterületen (lásd például Remington s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, szerk.: A. R. Gennaro, kiad.: Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, szerk.: S. Frokjaer és L. Hovgaard, kiad.: Taylor & Francis [00]; és Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. kiadás, szerk.: A. Kibbe, kiad.: Pharmaceutical Press [00]). A találmány szerinti polipeptid variánst alkalmazhatjuk, ahogyan van ( as is ), és/vagy só formájában. Alkalmas sók nem korlátozó példái közé tartoznak sók alkálifémekkel vagy alkáliföldfémekkel, mint például nátriummal, káliummal, kalciummal és magnéziummal, valamint például cinksók. Ezek a sók vagy komplexek kristályos és/vagy amorf szerkezetben lehetnek jelen. A találmány szerinti gyógyászati készítményt önmagában adhatjuk be, vagy más terápiás ágensekkel együtt. Ezeket az ágenseket ugyanazon gyógyászati készítmény részeként alkalmazhatjuk, vagy külön adhatjuk be azokat a találmány szerinti polipeptid variánstól, akár egyidejûleg, akár bármilyen elfogadható kezelési rend szerint. Ezenfelül a találmány szerinti polipeptid variánst vagy gyógyászati készítményt adjuvánsként alkalmazhatjuk más terápiákban. A leírás céljaira a páciens kifejezésbe beleértendõk emberek és más emlõsök is. Ily módon a találmány szerinti variánsok alkalmazhatók humán terápiára és állatorvosi alkalmazásokra egyaránt, különösen humán terápiára. A találmány szerinti polipeptid variánst tartalmazó gyógyászati készítményt különféle formákra szerelhetjük ki, például folyadékként, gélként, liofilizálva vagy kompresszált szilárd anyagként. Az elõnyös forma függhet az adott esetben kezelt indikációtól, és nyilvánvaló a szakember számára. Elõnyösen a találmány szerinti polipeptid variánst tartalmazó gyógyászati készítményt liofilizált vagy stabil folyadék formára szerelhetjük ki. A polipeptid variánst számos, szakterületen ismert eljárással liofilizálhatjuk. A polipeptid variáns lehet stabil oldható formá- 18

19 ban a proteolitikus helyek eltávolításával vagy árnyékolásával, amint ismertetjük a leírásban. A stabil oldat termék elõállításának az elõnye a könnyebb kezelhetõségben rejlik a páciens számára, és vészhelyzetben a gyorsabb cselekvésben, ami potenciálisan életmentõ lehet. Az elõnyös forma függhet az adott esetben kezelt indikációtól, és nyilvánvaló a szakember számára. A találmány szerinti kiszerelések beadását számos módon végrehajthatjuk, nem korlátozó példaként orálisan, szubkután, intravénásan, intracerebrálisan, intranazálisan, transzdermálisan, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, intrapulmonárisan, vaginálisan, rektálisan, intraokulárisan vagy bármilyen más elfogadható módon. A kiszereléseket folyamatosan adhatjuk be infúzióval, habár bolusz injekció is elfogadható, a szakterületen jól ismert módszerek alkalmazásával, mint például pumpákkal vagy implantátumokkal. Bizonyos esetekben a kiszereléseket közvetlenül alkalmazhatjuk oldatként vagy permetként. Parenterális kiszerelések A gyógyászati készítmény egy elõnyös példája oldat, elõnyösen vizes oldat, amely parenterális beadásra van tervezve. Habár sok esetben a gyógyászati oldatkészítményeket folyékony, azonnali beadásra megfelelõ formában biztosítjuk, az ilyen parenterális kiszerelések lehetnek fagyasztott vagy liofilizált formában is. Az elõbbi esetben a készítményt fel kell olvasztani az alkalmazást megelõzõen. Az utóbbi formát gyakran alkalmazzuk a készítményben található hatóanyag különbözõ tárolási körülmények közötti stabilitásának fokozására, minthogy ismert a szakember számára, hogy a liofilizált készítmények általában stabilabbak a folyékony társaiknál. Az ilyen liofilizált készítményeket újra feloldjuk az alkalmazást megelõzõen egy vagy több alkalmas gyógyászatilag elfogadható oldószer alkalmazásával, mint például injektálásra szolgáló steril vízzel vagy steril fiziológiás sóoldattal. A parenterális készítmények esetében azokat tárolásra liofilizált kiszerelések vagy vizes oldatok formájában állítjuk elõ, a kívánt tisztasági fokú polipeptid megfelelõ módon történõ összekeverésével egy vagy több, a szakterületen alkalmazott, gyógyászatilag elfogadható hordozóval, excipienssel vagy stabilizálószerrel (amelyeket összefoglalóan excipiensnek nevezünk), például pufferelõ ágensekkel, stabilizálószerekkel, tartósítószerekkel, izotonizálókkal, nemionos felületaktív anyagokkal vagy detergensekkel, antioxidánsokkal és/vagy más kiegészítõ adalék anyagokkal, mint például duzzasztó- vagy töltõanyagokkal, komplexképzõ szerekkel, antioxidánsokkal és társoldószerekkel. Az FVII variánsok beadására alkalmas parenterális kiszerelésekrõl részletes információ található a WO 01/893 és WO 03/09346 számú nemzetközi közzétételi iratokban, amelyek hivatkozás útján a kitanítás részét képezik. A találmányt részletesebben is ismertetjük az alábbi nem korlátozó példák segítségével Anyagok és eljárások Aktív hely régió Az aktív hely régiót bármilyen olyan oldalláncként definiáljuk, amelynek legalább egy atomja van a katalitikus triádhoz (H193, D242, S344 oldalláncok) képest 1 nm¹en belül. A proteolitikus degradációra való csökkentett érzékenység mérése A proteolitikus degradációt az US 80 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat. példájában ismertetett vizsgálati eljárás alkalmazásával mérhetjük, ahol a proteolízis autoproteolízis. Ezenfelül a csökkent proteolízist in vivo modellben tesztelhetjük, amely radioaktívan jelzett mintákat alkalmaz, és összehasonlítja az rhfviia és a találmány szerinti polipeptid variáns proteolízisét vérminták vételével és ezek SDS-PAGE autoradiográfiás vizsgálatával. A proteolitikus degradáció meghatározására alkalmazott vizsgálati eljárástól függetlenül a csökkent proteolitikus degradáció kifejezés alatt a hasítás mérhetõ csökkenése értendõ, összehasonlítva az rhfviia-val, amikor Coomassie-festett SDS-PAGE gélek szkennelésével, HPLC-vel vagy a vad típussal összehasonlított, a leírásban ismertetett szöveti faktortól független aktivitási vizsgálati eljárás alkalmazásával a konzervatív katalitikus aktivitás mérésével mérjük. A polipeptid variánsok molekulatömegének meghatározása A polipeptid variánsok molekulatömegét vagy SDS- PAGE-val, gélszûréssel, Western-blottal, mátrixsegített lézerdeszorpciós tömegspektrometriával vagy egyensúlyi centrifugálással határozzuk meg, például SDS- PAGE-val a Laemmli, U.K., Nature Vol 227 (1970), oldal irodalmi hely szerint. A foszfolipid membrán kötési aktivitás meghatározása A foszfolipid membrán kötési aktivitást a Nelsestuen és munkatársai, Biochemistry, 1977; ; oldal irodalmi helyen ismertetett módon határozhatjuk meg, vagy amint az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat 1. példájában ismertetik. TF-független X¹es faktor aktiválási vizsgálati eljárás Ezt a vizsgálati eljárást részletesen ismertetik a oldalon a Nelsestuen és munkatársai, J Biol Chem., 01; 276: oldal irodalmi helyen. Röviden, a vizsgálandó molekulát (vagy hfviia; rhfviia, vagy a találmány szerinti polipeptid variáns az aktivált formájában) összekeverjük foszfolipidforrással (elõnyösen foszfatidilkolin és foszfatidilszerin 8:2 arányú keveréke) és újralipidált X¹es faktorral BSA¹t tartalmazó Tris pufferben. A meghatározott inkubálási idõ letelte után a reakciót leállítjuk feleslegben lévõ EDTA hozzáadásával. Azután megmérjük a Xa faktor koncentrációját a nm¹en mért abszorbanciaváltozásból kromo- 19

20 gén szubsztrát (S¹2222, Chromogenix) hozzáadása után. A háttérre való korrekció után meghatározzuk az rhfviia szöveti faktortól független aktivitását (a wt ), mint az abszorbanciaváltozás perc elteltével, és meghatározzuk a találmány szerinti polipeptid variáns szöveti faktortól független aktivitását (a variáns ) is az abszorbanciaváltozásból perc elteltével. Az aktivált formában lévõ variáns aktivitásának és az rhfviia aktivitásának az arányát a variáns /a wt értéknek definiáljuk. Alvadási vizsgálati eljárás Az FVIIa-nak és a variánsának az alvadási aktivitását egylépéses vizsgálati eljárásban határoztuk meg, és az alvadási idõket Thrombotrack IV koagulométerrel (Medinor) rögzítettük. VII¹es faktorra depletált humán plazmát (American Diagnostica) újra feloldottunk és egyensúlyba hoztunk szobahõmérsékleten alatt. Azután 0 mikroliter plazmát átvittünk a koagulométer edényeibe. Az FVIIa¹t és variánsait meghígítottuk Glioxalin pufferben (,7 mm barbiturát, 4,3 mm nátrium-citrát, 117 mm NaCl, 1 mg/ml BSA, ph=7,3). A mintákat 0 l-ben adtuk az edényekbe, és 37 C¹on inkubáltuk 2 percen keresztül. Tromboplasztint (Medinor) oldottunk fel vízzel, és CaCl 2 ¹ot adtunk hozzá 4, mm végkoncentrációban. A reakciót 0 l tromboplasztin hozzáadásával indítottuk be. A TF hiányában való alvadási aktivitás méréséhez ugyanezt a vizsgálati eljárást alkalmaztuk a tromboplasztin hozzáadása nélkül. Az adatokat PRISM szoftver alkalmazásával elemeztük. Teljes vér vizsgálati eljárás Az FVIIa-nak és a variánsának az alvadási aktivitását egylépéses vizsgálati eljárásban határoztuk meg, és az alvadási idõket Thrombotrack IV koagulométerrel (Medinor) rögzítettük. 0 l FVIIa¹t vagy variánsát meghígítottuk mm glicilglicint, 0 mm NaCl¹ot, 37, mm CaCl 2 ¹ot tartalmazó ph=7,3 pufferben, és átvittük a reakcióedénybe. Az alvadási reakciót 0 l, antikoagulánsként % 0,13 M trinátrium-citrátot tartalmazó vérrel indítottuk be. Az adatokat Excel vagy PRISM szoftver alkalmazásával elemeztük. Amidolitikus vizsgálati eljárás A variánsok kis peptidszubsztrátok elhasítására való képességét mérhetjük az S¹2288 kromogenikus szubsztrát (D¹Ile-Pro-Arg-p-nitro-anilid) alkalmazásával. Az FVIIa¹t meghígítjuk körülbelül 90 nm koncentrációra vizsgálati pufferben (0 mm Na¹Hepes ph=7,, 0 mm NaCl, mm CaCl 2, 0,1% BSA, lu/ml Heparin). Ezenkívül oldható TF¹et (stf) meghígítunk 0 nm koncentrációra vizsgálati pufferben. 1 l vizsgálati puffert összekeverünk l FVIIa mintával és l stf-fel. Óvatos rázás melletti perces szobahõmérsékletû inkubálás, majd perc 37 C¹os inkubálás után a reakciót 1 mm végkoncentrációjú S¹2288 szubsztrát hozzáadásával indítjuk be, és az abszorpciót több idõpontban meghatározzuk nm¹en ELISA vizsgálati eljárás Az FVII/FVIIa (vagy variáns) koncentrációját ELI- SA-val határozzuk meg. Mikrotiterlemez mérõhelyeit bevonjuk a proteáz domén elleni ellenanyaggal 2 g/ml koncentrációjú PBS-ben készített oldat alkalmazásával (0 l per mérõhely). Éjszakán keresztüli R. T. (szoba-hõmérsékletû) bevonás után a mérõhelyeket megmossuk 4¹szer THT pufferrel (0 mm NaCl, 0 mm Tris-HCl ph=7,2, 0,0% Tween¹). Azt követõen 0 l 1% kazeint (2,% törzsoldatból meghígítva 0 mm NaCl, 0 mm Tris-HCl ph=7,2 puffer alkalmazásával) adunk mérõhelyenként blokkolás céljából. 1 órás R. T. inkubálás után a mérõhelyeket kiürítjük, és 0 l mintát [adott esetben meghígítva hígítási pufferben (THT+0,1% kazein)] adunk hozzá. Egy másik 1 órás szoba-hõmérsékletû inkubálás után a mérõhelyeket megmossuk 4¹szer THT pufferrel, és 0 l biotinnal jelzett, az EGF-szerû domén elleni ellenanyagot (1 g/ml) adunk hozzá. Egy másik 1 órás R. T. inkubálás, majd 4¹szeri THT pufferes mosás után 0 l sztreptavidin-tormaperoxidázt (DAKO A/S, Glostrup, Denmark, 1/ 000 hígítva) adunk hozzá. Egy másik 1 órás R. T. inkubálás, majd 4¹szeri THT pufferes mosás után 0 l TMB¹t (3,3,, -tetrametil-benzidin, Kem-en-Tech.A/S, Denmark) adunk hozzá. Sötétben perc R. T. inkubálás után 0 l 1 M H 2 SO 4 ¹ot adunk hozzá, és meghatározzuk az OD nm értéket. Standard görbét veszünk fel rhfviia (NovoSeven )alkalmazásával. Más megoldásképpen FVIl/FVIIa vagy variáns mennyiségét meghatározhatjuk a Gla doménen keresztül is, és nem a proteáz doménen keresztül. Ebben az ELISA összeállításban a mérõhelyeket éjszakán keresztül bevonjuk EGF-szerû domén elleni ellenanyaggal, és a detektáláshoz kalciumfüggõ biotinnal jelzett monoklonális anti-gla-domén ellenanyagot alkalmazunk (2 g/ml, 0 l per mérõhely). Ebben a felállásban mm CaCl 2 ¹ot adunk a THT és hígítási pufferhez. Trombogram vizsgálati eljárás A hfviia, rhfviia vagy FVIIa variánsok trombin humán plazmában való keletkezésére gyakorolt hatását a Hemker és munkatársai (00) Thromb Haemosi 83: oldal irodalmi hely 89. oldalán ismertetett vizsgálati eljárás módosításával teszteltük. Röviden, a vizsgálandó molekulát (vagy hfviia, rhfviia, vagy egy variáns) összekeverjük FVII-depletált vérlemezkeszegény plazmával (PPP), amely vagy relipidált rekombináns szöveti faktort (mint például Innovin a Dade Behring cégtõl) vagy foszfolipidet (foszfatidilkolin és foszfatidilszerin 8:2 arányú keveréke, vagy foszfatidilkolin, foszfatidilszerin és foszfatidiletanol 4:2:4 arányú keveréke) tartalmaz. A reakciót fluorogén trombinszubsztrát és kalciumklorid hozzáadásával indítjuk be. A fluoreszcenciát folyamatosan mérjük, és a trombin amidolitikus aktivitását a fluoreszcens görbe meredekségének (a fluoreszcencia idõbeli növekedése) kiszámításával határozzuk meg. Ezen a módon megkapjuk a maximális trombin amidolitikus aktivitás eléréséhez szükséges idõt

A sejtek élete. 5. Robotoló törpék és óriások Az aminosavak és fehérjék R C NH 2. C COOH 5.1. A fehérjeépítőaminosavak általános

A sejtek élete. 5. Robotoló törpék és óriások Az aminosavak és fehérjék R C NH 2. C COOH 5.1. A fehérjeépítőaminosavak általános A sejtek élete 5. Robotoló törpék és óriások Az aminosavak és fehérjék e csak nézd! Milyen protonátmenetes reakcióra képes egy aminosav? R 2 5.1. A fehérjeépítőaminosavak általános képlete 5.2. A legegyszerűbb

Részletesebben

INFORMATIKA EMELT SZINT%

INFORMATIKA EMELT SZINT% Szövegszerkesztés, prezentáció, grafika, weblapkészítés 1. A fényképezés története Táblázatkezelés 2. Maradékos összeadás Adatbázis-kezelés 3. Érettségi Algoritmizálás, adatmodellezés 4. Fehérje Maximális

Részletesebben

4. FEHÉRJÉK. 2. Vázanyagok. Az izmok alkotórésze (pl.: a miozin). Inak, izületek, csontok szerves komponensei, az ún. vázfehérjék (szkleroproteinek).

4. FEHÉRJÉK. 2. Vázanyagok. Az izmok alkotórésze (pl.: a miozin). Inak, izületek, csontok szerves komponensei, az ún. vázfehérjék (szkleroproteinek). 4. FEÉRJÉK 4.0. Bevezetés A fehérjék elsısorban α-l-aminosavakból felépülı biopolimerek. A csak α-laminosavakat tartalmazó fehérjék a proteinek. evüket a görög proteios szóból kapták, ami elsırangút jelent.

Részletesebben

MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK AZ ÉLŐ SZERVEZETEK KÉMIAI ÉPÍTŐKÖVEI AZ AMINOSAVAK ÉS FEHÉRJÉK 1. kulcsszó cím: Aminosavak

MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK AZ ÉLŐ SZERVEZETEK KÉMIAI ÉPÍTŐKÖVEI AZ AMINOSAVAK ÉS FEHÉRJÉK 1. kulcsszó cím: Aminosavak Modul cím: MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK AZ ÉLŐ SZERVEZETEK KÉMIAI ÉPÍTŐKÖVEI AZ AMINOSAVAK ÉS FEHÉRJÉK 1. kulcsszó cím: Aminosavak Egy átlagos emberben 10-12 kg fehérje van, mely elsősorban a vázizomban található.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 419 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 419 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000008419T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 419 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 799042 (22) A bejelentés

Részletesebben

3. Sejtalkotó molekulák III.

3. Sejtalkotó molekulák III. 3. Sejtalkotó molekulák III. Fehérjék, fehérjeszintézis (transzkripció, transzláció, posztszintetikus módosítások). Enzimműködés 3.1 Fehérjék A genetikai információ egyik fő manifesztálódása Számos funkció

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 257 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 257 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000827T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 27 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 727848 (22) A bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 989 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 989 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007989T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 989 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 72699 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

A tejfehérje és a fehérjeellátás

A tejfehérje és a fehérjeellátás A tejfehérje A tejfehérje és a fehérjeellátás Fejlődő országok: a lakosság 20 30%-a hiányosan ellátott fehérjével. Fejlett ipari országok: fehérje túlfogyasztás. Az emberiség éves fehérjeszükséglete: 60

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 510 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 510 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU0000010T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 10 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 769233 (22) A bejelentés napja: 2004.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 929 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 929 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007929T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 929 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 80846 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 868 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 003 868 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000003868T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 868 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 73619 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 263 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 263 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004263T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 263 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 70014 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

TAKARMÁNYOZÁSTAN. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0010

TAKARMÁNYOZÁSTAN. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0010 TAKARMÁNYOZÁSTAN Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0010 Takarmányok fehérjetartalma Az állati szervezet létfontosságú vegyületei fehérje természetűek Az állati termékek

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 234 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 234 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000006234T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 234 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 700417 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 012 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 012 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000012T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 012 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 0124 (22) A bejelentés napja: 03.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 949 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 949 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007949T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 949 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 835738 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 747 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 747 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007747T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 747 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 803296 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 328 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 328 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007328T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 328 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 797669 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 674 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 674 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000006674T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 674 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 7326 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 563 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 563 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000463T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 63 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 749820 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 819 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 819 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000006819T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 819 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 7669 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

A fehérjék hierarchikus szerkezete

A fehérjék hierarchikus szerkezete Fehérjék felosztása A fehérjék hierarchikus szerkezete Smeller László Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Biológiai funkció alapján Enzimek (pl.: tripszin, citokróm-c ) Transzportfehérjék

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 115 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 115 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU0000011T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 11 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 21 (22) A bejelentés napja: 0. 06.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 710 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 710 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU0000067T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 7 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 731277 (22) A bejelentés napja: 04.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 313 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 313 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004313T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 313 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 771807 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 248 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 2b. ábra

(11) Lajstromszám: E 005 248 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 2b. ábra !HU00000248T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 248 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 774803 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 256 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 256 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000726T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 26 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 830 (22) A bejelentés napja: 200.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 546 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 546 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000846T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 46 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 780262 (22) A bejelentés

Részletesebben

3. Aminosavak gyártása

3. Aminosavak gyártása 3. Aminosavak gyártása Előállításuk Fehérje-hidrolizátumokból: cisztein, leucin, aszparaginsav, tirozin, glutaminsav Kémiai szintézissel: metionin, glicin, alanin, triptofán (reszolválás szükséges) Biotechnológiai

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 096 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 096 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000096T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 096 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 7737 (22) A bejelentés napja: 04.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 901 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 901 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004901T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 901 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 763266 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 324 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 324 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007324T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 324 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 748539 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 158 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 158 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000008158T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 158 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 746205 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 013 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 013 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007013T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 013 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 74139 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

Az aminosav anyagcsere orvosi vonatkozásai Csősz Éva

Az aminosav anyagcsere orvosi vonatkozásai Csősz Éva Az aminosav anyagcsere orvosi vonatkozásai Csősz Éva E-mail: cseva@med.unideb.hu Általános reakciók az aminosav anyagcserében 1. Nitrogén eltávolítás: transzaminálás dezaminálás: oxidatív nem oxidatív

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 147 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Gaboxadol depresszió és más emocionális rendellenességek kezelésére

(11) Lajstromszám: E 008 147 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Gaboxadol depresszió és más emocionális rendellenességek kezelésére !HU000008147T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 147 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 73896 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 246 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: C07C 253/30 (2006.01) (VI)

(11) Lajstromszám: E 003 246 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: C07C 253/30 (2006.01) (VI) !HU000003246T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 246 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 290309 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 195 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 195 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000819T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 19 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 727742 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 281 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 281 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000006281T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 281 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 722791 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

Több oxigéntartalmú funkciós csoportot tartalmazó vegyületek

Több oxigéntartalmú funkciós csoportot tartalmazó vegyületek Több oxigéntartalmú funkciós csoportot tartalmazó vegyületek Hidroxikarbonsavak α-hidroxi karbonsavak -Glikolsav (kézkrémek) - Tejsav (tejtermékek, izomláz, fogszuvasodás) - Citromsav (citrusfélékben,

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 003 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 003 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007003T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 003 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 7882 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 597 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 597 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004597T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 597 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 716248 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 409 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 409 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000009T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 9 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 791698 (22) A bejelentés napja: 03.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 966 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 966 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000006966T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 966 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 717644 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 557 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 557 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 7 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 026690 (22) A bejelentés napja: 03.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 800 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 800 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007800T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 800 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 787403 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

9. Előadás Fehérjék Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia Protein kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1923 F. Pregl : Mikroanalitika 1952 Stein and Moore : Aminosav analizis 1932 Bergman és Zervas : Benziloxikarbonil

Részletesebben

Aminosavak általános képlete NH 2. Csoportosítás: R oldallánc szerkezete alapján: Semleges. Esszenciális aminosavak

Aminosavak általános képlete NH 2. Csoportosítás: R oldallánc szerkezete alapján: Semleges. Esszenciális aminosavak Aminosavak 1 Aminosavak általános képlete N 2 soportosítás: oldallánc szerkezete alapján: Apoláris Poláris Bázikus Savas Semleges Esszenciális aminosavak 2 (apoláris) Glicin Név Gly 3 Alanin Ala 3 3 Valin

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 506 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 506 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000806T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 06 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 82 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 744 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 744 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000005744T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 005 744 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 775757 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 099 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 003 099 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU0000099T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 099 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 76424 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

Szerkesztette: Vizkievicz András

Szerkesztette: Vizkievicz András Fehérjék A fehérjék - proteinek - az élő szervezetek számára a legfontosabb vegyületek. Az élet bármilyen megnyilvánulási formája fehérjékkel kapcsolatos. A sejtek szárazanyagának minimum 50 %-át adják.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 026 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 026 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004026T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 026 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 112946 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 488 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 488 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004488T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 488 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 798717 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 091 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Modulrendszerû alapozás légvezetékoszlopok és tartóoszlopok számára

(11) Lajstromszám: E 004 091 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Modulrendszerû alapozás légvezetékoszlopok és tartóoszlopok számára !HU000004091T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 091 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 813208 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 254 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 254 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000824T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 24 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 791108 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 361 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 361 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004361T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 361 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 717030 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 114 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 114 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000008114T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 114 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 764249 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 397 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 397 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000397T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 397 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 81106 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 582 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 582 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004582T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 582 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 803194 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 583 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 583 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007583T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 583 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 743056 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 292 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 292 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000006292T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 292 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 771124 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 121 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: H01B 1/00 (2006.01)

(11) Lajstromszám: E 007 121 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: H01B 1/00 (2006.01) !HU000007121T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 121 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 2 (22) A bejelentés napja: 06.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 405 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 405 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000008T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 77970 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 276 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 1. ábra

(11) Lajstromszám: E 007 276 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 1. ábra !HU000007276T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 276 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 023139 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 370 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 370 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000008370T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 370 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 750224 (22) A bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 141 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 141 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004141T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 141 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal (21) Magyar ügyszám: E 05 801577 (22) A bejelentés napja: 2005. 10. 20. (96) Az európai bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 418 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 418 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000005418T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 005 418 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 743779 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 779 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 779 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004779T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 779 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 299 (22) A bejelentés napja: 0.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 385 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 385 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000638T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 38 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 7498 (22) A bejelentés napja: 06.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 561 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 561 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000861T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 61 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 718443 (22) A bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 375 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 375 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000837T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 37 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 824187 (22) A bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 705 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 705 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000470T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 70 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 81479 (22) A bejelentés napja: 0.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 829 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 003 829 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000003829T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 829 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 82032 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 985 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 1. ábra

(11) Lajstromszám: E 003 985 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 1. ábra !HU00000398T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 98 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 764184 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 697 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 003 697 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000003697T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 697 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 7987 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 532 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 532 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000832T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 32 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 783231 (22) A bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 564 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 564 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU0000064T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 64 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 704342 (22) A bejelentés napja: 0.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 618 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 618 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000008618T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 618 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 792205 (22) A bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 080 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 080 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000080T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 080 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 790932 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 334 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 1. ábra

(11) Lajstromszám: E 005 334 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. 1. ábra !HU000005334T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 005 334 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 829382 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

Bioinformatika 2 5.. előad

Bioinformatika 2 5.. előad 5.. előad adás Prof. Poppe László BME Szerves Kémia és Technológia Tsz. Bioinformatika proteomika Előadás és gyakorlat 2009. 03. 21. Fehérje térszerkezet t megjelenítése A fehérjék meglehetősen összetett

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 081 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 003 081 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU0000081T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 081 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 816664 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 154 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 154 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000814T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 14 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 81727 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 008 651 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 008 651 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000008651T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 651 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 765355 (22) A bejelentés

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 777 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 777 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007777T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 777 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 772961 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 866 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 866 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007866T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 866 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 73966 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 006 537 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 006 537 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000637T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 37 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 708911 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 017 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 017 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007017T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 017 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 7232 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 787 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 005 787 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU00000787T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 787 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 7421 (22) A bejelentés napja: 03.

Részletesebben

Aminosavak, peptidek, fehérjék. Szerkezet, előállítás, kémiai tulajdonság

Aminosavak, peptidek, fehérjék. Szerkezet, előállítás, kémiai tulajdonság Aminosavak, peptidek, fehérjék Szerkezet, előállítás, kémiai tulajdonság Aminosavak Aminosavaknak nevezzük azokat a karbonsavakat, amelyekben a szénlánc egy vagy több hidrogénjét amino (NH 2 ) csoportra

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 005 463 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: B65D 1/16 (2006.01)

(11) Lajstromszám: E 005 463 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: B65D 1/16 (2006.01) !HU00000463T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 463 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 7064 (22) A bejelentés napja: 0.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 003 621 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 003 621 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000003621T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 621 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 717071 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 331 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 331 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007331T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 331 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 002063 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 004 809 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 004 809 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000004809T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 809 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 742918 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 404 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 404 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU0000074T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 4 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 7796 (22) A bejelentés napja: 03.

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 881 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: A61H 35/02 (2006.01)

(11) Lajstromszám: E 007 881 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: A61H 35/02 (2006.01) !HU000007881T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 881 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 11848 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 517 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: A62B 18/04 (2006.01)

(11) Lajstromszám: E 007 517 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (51) Int. Cl.: A62B 18/04 (2006.01) !HU000007517T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 517 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 022648 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben

(11) Lajstromszám: E 007 545 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

(11) Lajstromszám: E 007 545 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA !HU000007545T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 545 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 08 021581 (22) A bejelentés napja:

Részletesebben