(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) Int. Cl.: A61K 39/12 ( ) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/US 07/ (30) Elsõbbségi adatok: P US (72) Feltalálók: ROY, Soumitra, Wayne, PA (US); WILSON, James, M., Gladwyne, PA (US) (73) Jogosult: The Trustees of the University of Pennsylvania, Philadelphia, PA (US) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Módosított adenovírushexon-fehérje és alkalmazásai HU T2 A leírás terjedelme 62 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 A találmány háttere A találmány tárgyát immunogenikus beadási rendekben hasznos módosított adenovírushexon-fehérjék képezik. Az adenovírus kétszálú DNS-vírus, amelynek a genomja körülbelül 36 kilobázis (kb) méretû, és amelyet széles körben alkalmaznak géntranszfer-alkalmazásokban azon képessége miatt, hogy nagy hatékonyságú géntranszferre képes különféle célszövetekben, és nagy transzgénkapacitása miatt. Hagyományosan az adenovírus E1 génjeit deletálják és helyettesítik a kiválasztott promoterbõl, a jelentõséggel bíró gén cdnsszekvenciájából és poli-a-szignálból álló transzgénkazettával, ami replikációdefektív rekombináns vírust eredményez. Az adenovírusoknak jellegzetes morfológiája van három fõ fehérjébõl álló ikozahedrális kapsziddal, amelyek a hexon (II), pentonalap (III) és egy kidudorodó rost (IV), együtt számos kisebb fehérjével, amelyek a VI, VIII, IX, IIIa és IVa2 [W. C. Russell, J. Gen Virol., 81: old. (2000. nov.)]. A vírus genomja lineáris kétszálú DNS, terminális kovalensen kapcsolódó fehérjével az 5 ¹végen, amelynek invertált terminális ismétlõdései (ITR) vannak. A vírus DNS közvetlenül kapcsolódik az erõsen bázikus VII¹es fehérjéhez és egy kicsi, mu nevû peptidhez. Egy másik fehérje, az V¹ös, bepakolódik ebbe a DNS-fehérje komplexbe, és szerkezeti kapcsolatot biztosít a kapsziddal a VI¹os fehérjén keresztül. A vírus tartalmaz továbbá víruskódolt proteázt is, amely szükséges a szerkezeti fehérjék némelyikének feldolgozásához az érett fertõzõ vírus kialakítására. Az adenovírusok alkalmazását génbejuttató és vakcinázási rendekben már ismertették. A rekombináns adenovírusokat leírták molekulák gazdasejtekbe történõ bejuttatására. Lásd az US 6,083,716 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot, amely két csimpánz adenovírus, a C1 és C68 (Pan9) genomját ismerteti. Lásd még a WO 02/33645 számú nemzetközi közzétételi iratot is, amely a SAd22/Pan5, Pan6, Pan 7 csimpánz adenovírusok, valamint az SV1, SV25 és SV39 majom adenovírusok genomjából létrehozott vektorokat ismertet; és a WO 04/16614 számú nemzetközi közzétételi iratot, amely hibrid adenovírusvektorokat és a SA18 majom adenovírusból létrehozott vektorokat ismertet. Korábban javasolták az adenovírus különféle módosításait. Az ilyen módosítások közé tartozik inszerció az adenovírus rostfehérjéjébe [Curiel, D. T., Ann. N. Y. Acad. Sci., 886: old. (1999)]; inszerciók a pentonfehérjébe célzás érdekében [Einfeld, D. A. és mtsai., J. Virol. 73: old. (1999)]; inszerciók az adenovírus IX¹es fehérjébe célzás érdekében [Dmitriev, I. P. és mtsai., (2002) J. Virol. 76: old. (2002)] és az adenovírushexon módosítása célzás érdekében [Vigne, E. és mtsai., J Virol. 73: old. (1999); US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (Latta, Martine, és mtsai.)], valamint antigenikus epitóp beinszertálására Közelebbrõl, Crompton és mtsai. ismertették idegen peptidek beinszertálását a 2¹es szerotípusú humán adenovírus (HAdV 2) hexonfehérjéjébe [(1994) J. Gen. Virol. 75: old. (1994)]. A HAdV 2 Roberts és mtsai. [Roberts és mtsai., (1986), Science. 232: old.] által ismertetett szerkezetéhez képest a szerzõk a HAdV 2 hexon 17 aminosavát ( ) helyettesítették egy poliovírusdeterminánst hordozó 17 aminosavas peptiddel. A hexon azon régióját, ahol ezt a helyettesítést elvégezték, most DE1 huroknak nevezik a 7 és 8 béta redõs elemek között [Rux J. J., és mtsai., (2003) J. Virol. 77: old.]. Crompton és mtsai. (1994) munkáját Vigne és mtsai. (fent idézve) reprodukálták 5¹ös humán adenovírus-szerotípusban (HAdV 5), amely ugyanabba a szerológiai alcsoportba tartozik, mint a HAdV 2, és közeli rokona annak. Közelebbrõl Vigne és mtsai. peptideket inszertáltak be a HAdV 5 hexonjába a Crompton és mtsai. által alkalmazottal megegyezõ helyen (a HAdV 2 hexon és a HAdV 5 hexon egymás alá rendezése alapján). Vigne és mtsai. 14 HAdV 5 hexon oldalláncot ( ) helyettesítettek poliovírus peptiddel, valamint integrint célzó ligandummal. Az adenovírushexon hipervariábilis régióit olyan régiókként írták le, amelyekben a szekvenciák jelentõsen eltérnek a szerotípusok között (Crawford-Miksza és Schnurr D. P., Analysis of 15 adenovírushexon proteins reveals the location and structure of seven hypervariable regions containing serotype-specific residues, J. Virol : old.; Rux és mtsai., 2003). A WO 2005/ számú nemzetközi közzétételi irat Car-sejtek iránti tropizmusú és géntranszferre alkalmazott adenovirális vektort ismertet. A vektor kapszidfehérje legalább egy enyhén feszült szerkezeti területét, és (W/R) X 1 X 2 D egységet tartalmazó heterológ peptidet tartalmaz. A vektort rákok, izombetegségek és mukoviszcidózis kezelésre alkalmazzák. Amire szükség van az alternatív eljárások molekulák gazdasejtekbe történõ bejuttatására. A találmány összefoglalása Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírus, amely módosított adenovírushexonfehérje az 1¹es hipervariábilis régió és/vagy a 4¹es hipervariábilis régió közül kiválasztott legalább egy hipervariábilis régióban deléciót, és a hipervariábilis régióba beinszertált immunogenikus aminosavszekvenciát tartalmazó exogén aminosavszekvenciát tartalmaz, azzal a kikötéssel, hogy az exogén aminosavszekvencia nem adenovírusszekvencia. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás adenovírusvektor specifitásának megváltoztatására, amely eljárás tartalmazza fent ismertetett adenovírus biztosításának lépését, és az adenovírus módosított adenovírushexon-fehérjéje a hipervariábilis régió deléciójába beinszertált célzószekvenciát tartalmaz. 2

3 1 HU T2 2 A találmány lehetõvé teszi az adenovirális vektor által bejuttatott immunogenikus molekulára adott immunválasz fokozását azáltal, hogy alanynak fent ismertetett módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírust biztosítunk, amely adenovírus továbbá a kapszidba bepakolt, immunogenikus molekulát kódoló nukleinsavmolekulát is tartalmaz. Egy még másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya önmagát beindító immunogenikus készítmény, amely tartalmazza a következõket: módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírus, amint fent ismertettük, ahol az exogén aminosavszekvencia egy elsõ aminosavszekvencia; ahol az adenovírus továbbá egy második immunogenikus aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciát is tartalmaz. A találmány más megvalósítási módjai és elõnyei nyilvánvalóak a találmány következõ részletes leírásából. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a pnebasc plazmid térképe, amely a hexon kódolórégiót hordozó 5¹ös típusú humán adenovírus (HAdV 5) genomjának a pneb1893¹ba (a New England Biolabs cégtõl vásároltuk) történõ szubklónozásának az eredménye. A 2A. ábra a (p) SRAd5eGFP plazmid térképe, amely egy E1¹ és E3¹deletált HAdV 5 vektor molekuláris klónja, amely natív adenovírushexont és zöld fluoreszcens fehérjemarkergént tartalmaz. A 2B. ábra a ph5scd4egfp térképe, amely a HAdV 5 gerincet és a SARS koronavírus tüskefehérjébõl származó CD4 epitópot tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 2C. ábra a ph5scd8egfp térképe, amely az E1,E3-deletált HAdV 5 genomot és a SARS koronavírus tüskefehérjébõl származó CD8 epitópot tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 2D. ábra a ph5 2F5eGFP térképe, amely az E1,E3-deletált HAdV 5 genomot és a HIV 2F5 epitóprégiót tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 2E. ábra a ph5-hexbspee1 térképe, amely az E1,E3-deletált HAdV 5 genomot és inszertet nem tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 3. ábra az adenovírushexon-fehérje 1., 2., 3., 4., 5., 6. és 7. hipervariábilis régióit (HVR) tartalmazó adenovírushexon-fehérje részletek egymás alá rendezése a majom SAdV 23 adenovírussal (a régi nómenklatúra szerint Pan6 vagy C6); SAdV 22-vel (a régi nómenklatúra szerint SAd22/Pan5 vagy C5); SAdV 24-gyel (a régi nómenklatúra szerint Pan7 vagy C7); és SAdV 25-tel (a régi nómenklatúra szerint C68). Bemutatjuk a HVR elhelyezkedését ezekben a szekvenciákban, a számozást az egyes bemutatott szekvenciákra vonatkoztatva. Az SAdV 23 esetében a fragmens a 3. azonosító számú szekvencia aminosavai; az SAdV 22 esetében a fragmens a 4. azonosító számú szekvencia aminosavai; az SAd24 esetében a fragmens az 5. azonosító számú szekvencia aminosavai; az SAd25 esetében a fragmens a 6. azonosító számú szekvencia aminosavai; a had5 esetében a fragmens a 2. azonosító számú szekvencia aminosavai. A találmány részletes leírása A találmány tárgya módosított adenovírushexon-fehérje. Az ilyen módosított adenovírushexon-fehérje részleges vagy teljes deléciót tartalmaz a HVR1 és HVR4 közül kiválasztott hipervariábilis régiók legalább egyikében. A módosított adenovírushexon-fehérjében egy vagy több függetlenül kiválasztott exogén molekula lehet. Egy megvalósítási mód szerint exogén molekulát inszertálunk be a legalább az 1¹es hipervariábilis régió vagy 4¹es hipervariábilis régió deléció helyére, azzal a kikötéssel, hogy az exogén molekula nem adenovírusból származik. Más megoldásképpen a módosított adenovírushexon-fehérje nem tartalmaz inszertet a specifikus deléció helyén. A módosított adenovírushexon-fehérje alkalmazható adenovíruskapszid és/vagy fertõzõ adenovírusrészecske elõállítására. Ily módon a módosított adenovirális kapszid alatt a leírás szerint olyan adenovíruskapszidot értünk, amely találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmaz. Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérje üres lehet, azaz nem tartalmaz virális genomot és/vagy nem tartalmaz expressziós kazettát. Az ilyen módosított adenovirális kapszidot fehérje formában történõ bejuttatásra szolgáló készítménynek szerelhetjük ki. Más megoldásképpen az ilyen módosított adenovirális kapszidot gazdasejtben alkalmas vektor expresszáltatására történõ bejuttatásra szolgáló készítménynek szerelhetjük ki. Egy másik megvalósítási mód szerint a módosított adenovirális kapszidot adenovirális részecske formájában állítjuk elõ, amelynek módosított adenovirális kapszidjába egy vagy több heterológ molekula van bepakolva sejtbe történõ bejuttatás céljából. Kivéve amikor máshogy határozzuk meg, a találmány szerint alkalmazott módosított adenovirális vektorok ilyen adenovirális részecskéket jelentenek. Az 1¹es hipervariábilis régiót (HVR1) és a 4¹es (HVR4) hipervariábilis régiót az adenovírusok humán C 3

4 1 HU T2 2 alcsoportjában azonosították. Ezen régiók szerkezete nem definiált, amint az adenovírus C alcsoport genomjában található más hipervariábilis régiók szerkezete sem, azaz HVR2, HVR3, HVR5, HVR6 és HVR7. A humán 2¹es szerotípusú adenovírushexon-fehérjéjét az 1. azonosító számú szekvencián mutatjuk be a kényelem kedvéért. A humán 5¹ös szerotípusú adenovírushexon-fehérjéjét a 2. azonosító számú szekvencián mutatjuk be a kényelem kedvéért. Anélkül hogy elméletileg korlátozni kívánnánk magunkat, a feltalálók úgy vélik, hogy a találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérjék azért elõnyösek, mert a hexon ezen HVR-régióinak hosszúsága és szekvenciája szignifikánsan változik a különbözõ adenovírusokban, ezáltal flexibilis konstrukciót biztosítanak, amely toleráns különbözõ hosszúságú molekulák széles körének beinszertálására. Ily módon a találmány tárgya rendkívül flexibilis konstrukció, amely megengedi különféle heterológ molekulák beinszertálását, amelyek hasznosak célzásra és immunválaszok fokozására. A funkcionális kifejezés olyan termékre (például fehérjére vagy peptidre) vonatkozik, amely a natív funkcióját végzi, habár nem szükségszerûen ugyanolyan szinten, mint a natív termék. A funkcionális kifejezés vonatkozhat olyan génre is, amely terméket kódol, és amelyrõl kívánt termék expresszáltatható. A funkcionális deléció kifejezés alatt olyan deléciót értünk, amely tönkreteszi a termék azon képességét, hogy a natív funkcióját végrehajtsa. A leírás szerinti értelemben a HVR találmány szerinti deléciói magukban foglalhatják a hexonfehérjében található HVR aminosavszekvenciájának részleges vagy teljes eltávolítását. Például egy 45 aminosavnyi HVR (például az Ad2 vagy Ad5 HVR1¹e) esetében, 1 45 aminosavat deletálhatunk, például 1 5¹öt, legalább 10¹et, legalább 25¹öt, legalább 30¹at, legalább 35¹öt, vagy több aminosavat. Egy megvalósítási mód szerint legalább egy aminosavat a natív hipervariábilis régió N¹terminálisáról és legalább egy aminosavat a C¹terminálisáról megtartunk. Amint a leírásban és az igénypontokban alkalmazzuk, a tartalmaz és magában foglal kifejezésekbe és variánsaikba, beleértve a tartalmazza, tartalmazó, magában foglalja és magában foglaló a többi variáns mellett beleértendõk más komponensek, elemek, számok, lépések és hasonlók. Az áll vmibõl vagy vmibõl álló kifejezések kizárnak más komponenseket, elemeket, számokat, lépéseket és hasonlókat. Egy megvalósítási a módosított adenovírusnak a HVR l¹ben és/vagy HVR4-ben deléciót tartalmazó a kapszidja. Egy másik megvalósítási mód szerint a módosított adenovírusnak ezen régiók egyikében vagy mindkettõjében módosítást tartalmazó a kapszidja, valamint egy másik HVR-ben is, például a HVR2, HVR3, HVR5, HVR6 vagy HVR7 közül választva. Az 1¹es hipervariábilis régió a hexonfehérje oldalláncai vagy oldalláncai között helyezkedik el a HAdV-5-ben (2. azonosító számú szekvencia) és a HAdV-2-ben (1. azonosító számú szekvencia), a HAdV 2 oldallánc-számozása alapján (1. azonosító számú szekvencia, R. J. Roberts és mtsai., A consensus sequence for the adeno vírus¹2 genome, old., szerk.: W. Doerfler, Adeno virus DNA., kiad.: Martinus Nijhoff Publishing, Boston). A 4¹es hipervariábilis régió a HAdV 2 hexonfehérjéjének oldalláncai között helyezkedik el ugyanazon számozási rend alapján. Lásd például a 3. ábrát a HVR helyek szemléltetõ egymás alá rendezéséért más adenovírusokkal azok saját számozásához viszonyítva. Az ilyen egymás alá rendezések elõállítása jól ismert a szakember számára. Ezen információ alapján a szakember könnyen meghatározhatja a megfelelõ hipervariábilis régiókat a különbözõ adenovírusszekvenciák beleértve a humán C alcsoportból származó különbözõ szekvenciákat vagy a C alcsoporttól eltérõeket hexonfehérjéinek egymás alá rendezésének alkalmazásával. Lásd például Crawford-Miksza és Schnurr, amint fent idéztük, és Rux J. J., és mtsai., (2003), amint fent idéztük, számos adenovírusszekvenciáinak szemléltetõ egymás alá rendezéséért és azok hipervariábilis régióinak elhelyezkedéséért. Más alkalmas adenovírusszekvenciák könnyen kiválaszthatók a többi humán és nem humán szekvenciák közül, amelyeket már leírtak. Amint ismertetjük, az egymás alá rendezéseket különféle nyilvános vagy kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ többszörös szekvencia egymás alá rendezõ programok bármelyikével végrehajthatjuk, mint amilyen például a Clustal W, amely hozzáférhetõ az Interneten található Web szervereken. Más megoldásképpen a Vector NTI alkalmazásokat is alkalmazhatjuk. Számos algoritmus ismert a szakterületen, amelyek alkalmazhatók a nukleotidszekvencia-azonosság mérésére, beleértve a fent ismertetett programokban találhatókat. Egy másik példaként polinukleotidszekvenciákat a Fasta alkalmazásával hasonlíthatunk össze, amely a GCG Version 6.1 csomagban található program. A Fasta megadja a lekérdezett és keresési szekvenciák között a legjobban átfedõ régiók egymás alá rendezését és a százalékos szekvenciaazonosságát. Például nukleotidszekvenciák közötti százalékos szekvenciaazonosságot meghatározhatjuk a Fasta alkalmazásával az alapértelmezett paraméterekkel (szóméret: 6 és a NOPAM faktor az értékelési mátrixhoz), amint a GCG Version 6.1 részét képezi. Hasonlóképpen elérhetõk programok aminosav egymás alá rendezések végrehajtására. Általában ezeket a programokat az alapértelmezett beállításokkal alkalmazzuk, habár a szakember szükség szerint megváltoztathatja ezeket a beállításokat. Más megoldásképpen a szakember más algoritmust vagy számítógépi programot alkalmazhat, amely megadja legalább az azonosság mértékét vagy az egymás alá rendezést, mint ahogyan a hivatkozott algoritmusok és programok. Alkalmas adenovírusok hozzáférhetõk az American Type Culture Collection intézettõl (Manassas, Virginia, US, ATCC), különféle akadémiai és kereskedelmi forrásokból, vagy a kívánt régiókat megszintetizálhatjuk ismert módszerek alkalmazásával a szakirodalomban 4

5 1 HU T publikált vagy az adatbázisokból (például GenBank stb.) hozzáférhetõ szekvenciák alapján. Az alkalmas adenovírusok nem korlátozó példái közé tartozik a humán adenovírus 2¹es szerotípus (a szekvenciáját publikálták R. J. Roberts és mtsai., A consensus sequence for the adenovírus¹2 genome, old., szerk.: W. Doerfler, Adenovirus DNA, kiad.: Martinus Nijhoff Publishing, Boston), 3¹as, 4¹es típus (a HAdV¹4 genom szekvenciájáról beszámoltak S. Jacobs és mtsai., J. Gen. Virol. 85 (2004), old., a Gen- Bank/EMBL/DDBJ AY hozzáférési száma alatt), az 5¹ös típus (a szekvenciát publikálták R. Kinlock és mtsai., Adenovirus hexon: sequence comparison of subgroup C serotypes 2 and 5, J. Biol. Chem. 259: old.), AV1 és AV6 (P. Pring-Akerblom és T. Adrian, 1993, Res. Virol, 144: old.), 7,12 [a szekvenciát publikálták J. Sprengel és mtsai., J. Virol., 68: old. (1994)], 40 [a szekvenciát publikálták C. I. Toogood és mtsai., J. Gen. Virol., 70: old. (1989)] és továbbá beleértve a jelenleg azonosított bármely humán típust [lásd például Horwitz, Adenoviridae and Their Replication, VIRO- LOGY, 2. kiadás, old. (1990)], amelyeket a kívánt sejtekben tenyészteni lehet. Hasonlóképpen a nem humán fõemlõsöket (például csimpánzokat, rhesusmakákókat és más majomfajokat) vagy más nem humán emlõsöket ismert módon megfertõzõ és a kívánt sejttípusban növekvõ adenovírusokat is alkalmazhatunk a találmány szerinti vektorkonstrukciókban. Az ilyen szerotípusok nem korlátozó példái közé tartoznak a következõ csimpánz adenovírusok: SAd22/Pan5 (VR 591), SAd23/Pan6 (VR 592), Sad24/Pan7 (VR 593) és SAd25/C68 (Pan9, GenBank hozzáférési szám: AF394196) és US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat); és majom adenovírusok, nem korlátozó példaként az SV1 (VR 195); SV25 (SV 201); SV35; SV15; SV 34; SV 36; SV 37, és pávián adenovírus (VR 275), többek között. Az SAd22/Pan5 (más néven C5), SAd23/Pan 6 (más néven C6), SAd24/Pan 7 (más néven C7), SV1, SV25, és SV39 szekvenciáit ismertették (WO 03/ számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve június 5¹én, szintén közzétéve mint US A1, március 31). Lásd még a WO 04/16614 számú nemzetközi közzétételi iratot, amely hibrid adenovírusvektorokat és az SA18 majom adenovírusból létrehozott vektorokat ismertet. Az SAd22/Pan5 (4. azonosító számú szekvencia), SAd23/Pan6 (3. azonosító számú szekvencia), SAd24/Pan7 (5. azonosító számú szekvencia), SV1 (10. azonosító számú szekvencia), (SV25 7. azonosító számú szekvencia), SV39 (8. azonosító számú szekvencia) és SA18 (9. azonosító számú szekvencia) hexon fehérjéinek szekvenciáit bemutatjuk a leírásban. Azonban a szakember számára nyilvánvaló, hogy a más adenovirális törzsekbõl származó összehasonlítható régiók könnyedén kiválaszthatók és alkalmazhatók a találmányban ezen szerotípusok helyett (vagy azokkal kombinációban). Ezen módszerek alkalmazásával a C alcsoportba tartozó, HVR1-gyel és/vagy HVR4-gyel analóg hipervariábilis régiók azonosíthatók más adenovírusszekvenciákból is. A találmány szerinti módosított adenovírushexonok ezen módosítások mellett a többi hipervariábilis régió (HVR) közül egy vagy több módosítását is tartalmazzák. Egy megvalósítási mód szerint funkcionális deléciót készítünk egy kiválasztott HVR-ben és nem inszertálunk bele molekulát. Ez több okból is kívánatos lehet, például hogy egy nagy inszertet építsünk be egy másik HVR¹be vagy a kapszid egy másik helyére. Az ilyen funkcionálisan deletált adenovírushexon-fehérje alkalmazható adenovirális részecske elõállítására, valamint más célokra. Egy másik megvalósítási mód szerint a módosított adenovírushexon-fehérje exogén molekulát tartalmaz a HVR-régióban található delécióba inszertálva. Az ilyen exogén molekula hasznos lehet a módosított adenovírushexon-fehérje (vagy az azt virális részecske formájában vagy üresen tartalmazó kapszid) célpontjának megváltoztatására, a módosított adenovíruskapszid immunogenitásának megváltoztatására és/vagy immunválasz indukálására az exogén aminosavszekvencia vagy immunológiailag keresztreagáló molekula ellen. Egy megvalósítási mód szerint az adenovírushexon-fehérjébe inszertált exogén molekula legalább két, legalább négy, legalább nyolc, legalább tíz, legalább tizenöt, legalább húsz, legalább huszonöt, vagy több aminosav-oldallánc hosszúságú vagy hosszabb exogén aminosavszekvencia, amelynek a teljes szekvenciája nem található meg funkcionálisan ekvivalens pozícióban a vad típusú adenovírus aminosavszekvenciájában, vagy elõnyösebben a létrehozandó vad típusú virális komponens fehérjében. Bizonyos megvalósítási módok szerint az exogén aminosavszekvencia lehet nem natív abban az értelemben is, hogy nem fordul elõ a természetben, azaz hogy szintetikusan vagy mesterségesen megtervezett és elõállított polipeptid. Nyilvánvaló, hogy a hexonfehérjét kódoló nukleotidszekvencia vonatkozásában az exogén molekula lehet kívánt aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvencia formájában. Egy megvalósítási mód szerint az exogén molekula célzásra hasznos aminosavszekvencia. A leírás szerint célzószekvencia alatt specifikus aminosavszekvenciát értünk, amely szignálként szolgál a módosított adenovírus irányítására. Ily módon egy megvalósítási mód szerint az adenovíruskapszid módosítva lehet, hogy kívánt célsejthez kötõdjön, amelyhez a natív (vad típusú) vírus amelybõl származik, nem kötõdik, vagy úgy lehet módosítva, hogy korlátozottabb a kötõspecifitása, mint a vad típusú vírusé, más szóval, csak a célsejtek egy adott szûkebb alkészletéhez kötõdik a célsejttípusok tágabb körébõl, amelyhez a vad típusú vírus kötõdik. Egy másik alternatíva szerint az adenovírus megtartja a képességét az eredeti célpontjához való kötõdésre, és az exogén aminosavszekvencia egy további célpontot biztosít. Ily módon megváltoztatjuk a vírus tropizmusát. Ily módon a megváltoztatott tropizmus kifejezés alatt azt értjük, hogy a módosított vírus 5

6 1 HU T2 2 olyan célsejtkötési specifitást mutat, amely megváltozott vagy különbözik attól, mint amilyen a vad típusú vírusé, amelybõl származik. A hasznos exogén molekulák példái közé tartoznak például pozitívan töltött aminosavak (például lizin oldalláncok vagy cisztein oldalláncok), citokinek, mint például interferonok és interleukinok; limfokinok; membránreceptorok, mint például kórokozó organizmusok (vírusok, baktériumok vagy paraziták), elõnyösen a HIV-vírus (humán immundeficiencia-vírus) által felismert receptorok; koagulációs faktorok, mint például VIII¹as faktor vagy IX¹es faktor; disztrofinok; inzulin; a celluláris ioncsatornákban közvetlenül vagy közvetetten részt vevõ fehérjék, mint például a CFTR (cisztás fibrózis transzmembrán-vezetõképesség regulátor) fehérje; antiszensz RNS¹ek, vagy kórokozó organizmus genomjában lévõ patogenikus gén által termelt fehérje aktivitásának gátlására képes fehérjék, vagy olyan celluláris gének aktivitását gátolni képes fehérjék (vagy az azokat kódoló gének), amelyek expressziója deregulált, például egy onkogén; enzim aktivitását gátló fehérje, mint például 1-antitripszin vagy például virális proteázinhibitor; patogenikus fehérjék variánsai, amelyek úgy lettek mutáltatva, hogy elromoljon a biológiai funkciójuk, mint például a HIV-vírus tat fehérjéjének transzdomináns variánsai, amelyek képesek versengeni a természetes fehérjével a célszekvencia kötéséért, ezáltal megakadályozzák a HIV aktiválódását; antigenikus epitópok, a gazdasejt immunitásának fokozása érdekében; fõ hisztokompatibilitási komplex I¹es és II¹es osztályába tartozó fehérjék, valamint az ezeket a géneket indukáló fehérjék; ellenanyagok; immunotoxinokat kódoló gének; toxinok; növekedési faktorok vagy növekedési hormonok; sejtreceptorok és ligandumjaik; tumorszuppresszorok; kardiovaszkuláris betegségben részt vevõ fehérjék, nem korlátozó példaként onkogének; növekedési faktorok, nem korlátozó példaként fibroblaszt növekedési faktor (FGF), vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) és idegi növekedési faktor (NGF); e¹nos, tumorszuppresszorgének, nem korlátozó példaként az Rb (retinoblasztóma) gén; lipoprotein-lipáz; szuperoxid-diszmutáz (SOD); kataláz; oxigén és szabad gyök scavenger ¹ek; apolipoproteinek; és pai¹1 (plazminogén aktivátor inhibitor¹1); celluláris enzimek vagy kórokozó organizmusok által termeltek; öngyilkos gének; hormonok, T¹sejt-receptorok (epitópok) ellenanyag-epitópok, affitestek és különféle fehérjekönyvtárakból azonosított ligandumok. Egy megvalósítási mód szerint az exogén fehérje sejtfelszíni receptor liganduma. Az alkalmas ligandumok közé tartoznak például ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek vagy ¹származékok, egyláncú ellenanyagok (ScFv), egydoménes ellenanyagok, és ellenanyagok minimális felismerési egységei, mint például Fv fragmensek komplementaritást meghatározó régiói (CDR). Ilyen aminosavszekvencia ellenanyag antigénkötõ helyébõl vagy kötõ- vagy felismerõrégióiból nyerhetõ vagy származhat, és az ilyen ellenanyag természetes vagy szintetikus lehet Egy másik megvalósítási mód szerint az exogén molekula virális fehérje. Például a HSV 1 TK enzimnek nagyobb az affinitása összehasonlítva a celluláris TK enzimmel bizonyos nukleozidanalógok (mint például aciklovir vagy ganciklovir) irányába. Egy még másik megvalósítási mód szerint az exogén molekula immunogén. Immunogenikus molekulák közé tartozhatnak olyanok, amelyek celluláris immunválaszt, ellenanyagválaszt, vagy mindkettõt indukálnak. Vakcinamolekulák közé olyanok tartoznak, amelyek olyan immunválaszt indukálnak, amely véd a kórokozóval történõ további fertõzés ellen, és/vagy véd a betegség vagy más állapotok tünetei ellen. Antigén alatt olyan molekulát értünk, amely humorális (ellenanyag) immunválasz indukálására képes. Tipikusan az immunogenikus molekulák specifikus immunválaszt indukálnak egy specifikus vírus, organizmus (például baktériumok, gombák, élesztõ), vagy más források (például daganat) vagy keresztreagáló organizmus vagy forrás ellen. Azonban bizonyos megvalósítási módok szerint kívánatos lehet olyan immunogenikus molekulák alkalmazása, amelyek nemspecifikus immunmoduláns választ indukálnak, például immunválasz megerõsítésével. Például ilyen molekulát alkalmazhatunk beindításra vakcinarendben vagy adjuvánsként, attól függõen, hogy azt azelõtt vagy együtt juttatjuk be azzal a molekulával, amely ellen immunválaszt kívánunk. Az alkalmas immunogének közé tartozik például T¹sejt-epitóp (például CD4 vagy CD8 epitóp), ellenanyag-epitóp, vagy baktériumokból, gombákból, élesztõbõl és/vagy vírusokból származó peptid, polipeptid, enzim vagy más fragmens. Az immunogének alkalmas forrásai közé tartoznak többek között az itt ismertetett immunogenikus transzgének. Még más immunogének nyilvánvalóak a szakember számára. Ily módon egy aspektusában a találmány tárgya módosított adenovírushexon-fehérje, amely úgy lett módosítva, hogy egy vagy több exogén molekulát tartalmaz. Ahol egynél több exogén molekulát alkalmazunk, a molekulák azonosak lehetnek. Egy másik megvalósítási mód szerint az exogén molekulák különbözõk lehetnek. Például egy módosított adenovírushexon-fehérje az egyik régióban olyan exogén molekulát tartalmazhat, amely a natív célzást módosítja, és egy másik régióban olyan exogén molekulát, amely natív semlegesítõ epitópokat módosít és/vagy immunválaszt indukál. Egy másik példában módosított adenovírushexon-fehérje egynél több típusú exogén immunogént tartalmazhat. Az alkalmas exogén molekulák sok kombinációja nyilvánvaló a szakember számára, amelyet egymástól függetlenül megválaszthatók. Amint az nyilvánvaló a szakember számára, bizonyos molekulák célzó molekulákként és immunogénekként egyaránt mûködnek. Ilyen exogén molekulák (például aminosavszekvenciák) elõállítására és azok vírusokba vagy virális komponensekbe történõ bejuttatására szolgáló módszerek jól ismertek a szakterületen és széles körben ismertetve vannak a szakirodalomban. Ily módon például mole- 6

7 1 HU T2 2 kuláris biológiai és génsebészeti módszerek könnyen hozzáférhetõek, olyan genetikai szekvenciák elõállítására vagy létrehozására, amelyek képesek módosított vírusként vagy virális komponensként való expresszáltatásra a találmány szerint. Például virális komponens fehérjét kódoló nukleinsavmolekulát vagy nukleotidszekvenciát úgy módosíthatunk, hogy bejuttatjuk az exogén aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát, például hogy egy adenovirális fehérje egészét vagy részét és az exogén aminosavszekvenciát tartalmazó fúziós fehérjét kódolja. Kényelmes vagy szükséges lehet bármilyen ilyen további vagy külsõ motívum vagy jellegzetesség beépítése a vírusba kapcsolómolekula szekvencia alkalmazásával. A DNS- vagy aminosavszekvenciák beépítésére szolgáló ilyen konstrukciós módszerek kapcsolómolekula szekvencia hozzákapcsolásával ismertek a szakterületen és a fehérje/génsebész szakember köteles tudásához tartozik. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány az exogén molekulát tartalmazó adenovíruskapszidot fertõzõ adenovirális részecske elõállítására alkalmazza, amely a kívánt molekulát hordozó expressziós kazettát tartalmazhat. Megfelelõ módon az expressziós kazettán hordozott molekula a termék vagy azzal keresztreagáló molekula elleni immunválasz indukálására hasznos terméket kódol. Egy példában ez a megvalósítási mód lehetõvé teszi a módosított adenovirális kapszid számára, hogy adjuvánsként mûködjön az expressziós kazetta által bejuttatott molekula számára. Egy másik példában ez a megvalósítási mód lehetõvé teszi a módosított adenovirális kapszid számára, hogy saját magát beindító konstrukcióként mûködjön az expressziós kazetta által bejuttatott molekula számára. Módosított adenovirális vektorok Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya módosított adenovirális kapszidot tartalmazó készítmény. A leírás szerint a módosított adenovirális kapszid alatt olyan adenovirális kapszidot értünk, amely a leírásban ismertetett módon módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmaz. Emellett a módosított adenovíruskapszid más módosításokat is tartalmazhat. Ilyen más módosítások közé tartozhatnak a hexonfehérje vagy más kapszidfehérjék, például a rostfehérje vagy a penton más módosításai. Például egy módosított adenovírushexon továbbá tartalmazhat az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetett megváltoztatott hexonfehérjéket is. Ebben az eljárásban az adenovírushexon legalább egy hurokrégióját lecserélik egy másik adenovírus-szerotípus legalább egy hurokrégiójára. Még más alkalmas módosításokat is ismertetnek (US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, közzétéve szeptember 2¹án). Más megoldásképpen vagy emellett a módosított kapszidhoz egy másik molekula kapcsolódhat, például lipid, fúziós fehérje Egy aspektusában a találmány szerinti készítmények közé módosított adenovírusvektorok tartoznak. Kivéve amikor másképpen határozzuk meg, a találmány szerinti módosított adenovirális vektor alatt olyan adenovírusrészecskét értünk, amelynek módosított adenovírus kapszidja van, és amely esetében a kapszidba a sejtbe egy vagy több heterológ molekulát bejuttató expressziós kazetta van becsomagolva. Az adenovirális vektorban alkalmazott adenovíruskomponenseket különbözõ adenovírusokból nyerhetjük, mint például amelyeket a leírásban ismertetünk és amelyek hozzáférhetõk a szakember számára. Mivel az adenovírusgenom mindkét szálon tartalmaz nyílt leolvasási fázisokat, sok esetben hivatkozunk a leírásban a különféle régiók 5 ¹ és 3 ¹végeire, hogy elkerüljük a specifikus nyílt leolvasási fázisok és génrégiók összetévesztését. Ily módon amikor az adenovirális genom bal és jobb végére hivatkozunk, ez a megközelítõleg 36 kb méretû adenovirális genom végeire vonatkozik, amikor azt sematikusan ábrázoljuk amint az hagyományosan ismert a szakterületen [lásd például Horwitz, Adenoviridae and Their Replication, VIROLOGY, 2. kiadás., old. (1990)]. Ily módon leírás szerinti értelemben az adenovirális genom bal terminális vége kifejezés alatt az adenovirális genom azon részletét értjük, amely amikor a genom sematikusan lineáris formában van ábrázolva, az ábra legtávolabbi bal oldali végén található. Tipikusan a bal vég a genomnak a 0 térképezési egységnél kezdõdõ és jobbra terjedõ részletére utal, amely magában foglalja legalább az 5 ¹invertált terminális ismétlõdéseket (ITR), és nem tartalmazza a genomnak a szerkezeti géneket kódoló belsõ régióit. A leírás szerinti értelemben az adenovirális genom jobb terminális vége kifejezés alatt az adenovirális genom azon részletét értjük, amely amikor a genom sematikusan lineáris formában van ábrázolva, az ábra legtávolabbi jobb oldali végén található. Tipikusan az adenovirális genom jobb vége a genomnak a 36 térképezési egységnél kezdõdõ és balra terjedõ részletére utal, amely magában foglalja legalább a 3 ¹ITR-eket, és nem tartalmazza a genomnak a szerkezeti géneket kódoló belsõ régióit. A minigén kifejezés alatt egy kiválasztott heterológ gén és a génterméknek gazdasejtben való transzlációjának, transzkripciójának és/vagy expressziójának irányításához szükséges szabályozóelemek kombinációját értjük. Tipikusan egy adenovirális vektor úgy van megtervezve, meg, hogy a minigén olyan nukleinsavmolekulában legyen található, amely más natív adenovirális szekvenciákat tartalmaz a kiválasztott adenovirális gén régiójában. A minigént egy létezõ génrégióba inszertálhatjuk be, hogy kívánt esetben megzavarjuk annak a régiónak a mûködését. Más megoldásképpen a minigént egy részlegesen vagy teljesen deletált adenovirális gén helyébe inszertálhatjuk be. Például a minigén egy funkcionális E1 deléció vagy funkcionális E3 deléció helyében helyezkedhet el, többek között. A funkcionálisan deletált vagy funkcionális deléció kifejezés alatt azt értjük, hogy a génrégiónak elegendõ részét el- 7

8 1 HU T2 2 távolítjuk vagy másképpen károsítjuk, például mutációval vagy módosítással, hogy a génrégió ne legyen többé képes génexpresszió funkcionális termékeinek elõállítására. Kívánt esetben a teljes génrégiót eltávolíthatjuk. A génzavarásra és delécióra alkalmas más helyeket máshol is tárgyalunk a leírásban. Például rekombináns vírus létrehozására alkalmas termelõvektor a minigént az adenovirális genomnak az 5 ¹végén vagy az adenovirális genomnak a 3 ¹végén tartalmazhatja, vagy az adenovirális genomnak az 5 ¹ és 3 ¹végein egyaránt. Az adenovirális genom 5 ¹vége tartalmazza a pakolódáshoz és replikációhoz szükséges cisz-elemeket; azaz az 5 ¹invertált terminális ismétlõdõ (ITR) szekvenciákat (amelyek replikációs origóként mûködnek) és a natív 5 pakolási enhanszer doméneket (amelyek a lineáris Ad genomok pakolásához szükséges szekvenciákat és az E1 promoter enhanszerelemeit tartalmazza). Az adenovirális genom 3 ¹vége tartalmazza a pakolódáshoz és enkapszidációhoz szükséges cisz-elemeket (beleértve a 3 ¹ITR-eket). Megfelelõ módon a rekombináns adenovírus tartalmazza mind az 5, mind a 3 adenovirális cisz-elemeket és a minigén az 5 és 3 adenovirális szekvenciák között helyezkedik el. A találmány szerinti bármilyen adenovirális vektor tartalmazhat további adenovirális szekvenciákat is. A találmány szerinti vektorok létrehozásában alkalmazott virális szekvenciákat, szükség esetén segítõ vírusokat, és rekombináns virális részecskéket és más vektorkomponenseket és ¹szekvenciákat a fent ismertetett módon nyerhetjük. Az adenovírusszekvenciák DNSszekvenciáit alkalmazzuk az ilyen vektorok elõállítására hasznos vektorok és sejtvonalak létrehozására. A találmány szerinti vektorokat alkotó nukleinsavszekvenciák módosításait, beleértve a szekvenciadeléciókat, ¹inszerciókat és más mutációkat szokásos molekuláris biológiai módszerekkel hozhatjuk létre, amelyek a találmány oltalmi körébe tartoznak. A transzgén kiválasztására, a minigén létrehozására és a virális vektorba történõ beinszertálására alkalmazott eljárások a szakember köteles tudásához tartoznak a leírásban megadott kitanítás alapján I. A transzgén A transzgén olyan nukleinsavszekvencia, amely heterológ a transzgént szegélyezõ vektorszekvenciákhoz képest, és amely jelentõséggel bíró polipeptidet, fehérjét, vagy más terméket kódol. A nukleinsavkódoló szekvencia mûködõképesen kapcsolva van szabályozókomponensekhez oly módon, ami lehetõvé teszi a transzgén transzkripcióját, transzlációját és/vagy expresszióját a gazdasejtben. A transzgénszekvenciák összetétele függhet attól az alkalmazástól, amelyben a kapott vektort alkalmazzuk. Például egyfajta transzgénszekvencia jelzõszekvenciát tartalmaz, amely az expressziója után detektálható jelet produkál. Ilyen jelzõszekvenciák nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbiakat kódoló DNS-szekvenciák: ¹laktamáz, ¹galaktozidáz (LacZ), alkalikus foszfatáz, timidin-kináz, zöld fluoreszcens fehérje (GFP), klór-amfenikol-acetiltranszferáz (CAT), luciferáz, membránkötött fehérjék, mint például CD2, CD4, CD8, az influenza hemagglutinin fehérje, és a szakterületen jól ismert más fehérjék, amelyekhez léteznek vagy hagyományos úton elõállíthatók magas affinitású ellenanyagok, és fúziós fehérjék, amelyek membránkötött fehérjét tartalmaznak megfelelõen fuzionáltatva antigén-címke doménhez, többek között hemagglutininbõl vagy Myc-bõl. Ezek a kódolószekvenciák amikor kapcsolódnak az expressziójukat irányító szabályozóelemekhez olyan hagyományos eszközökkel detektálható jelt biztosítanak, amelyek közé tartoznak enzimatikus, radioaktív, kolorimetriás, fluoreszcens vagy másféle spektrográfiás vizsgálati eljárások, fluoreszcens aktivált sejtválogatási vizsgálati eljárások és immunológiai vizsgálati eljárások, köztük enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálati eljárás (ELISA), radioaktív immunológiai vizsgálati eljárás (RIA) és immunhisztokémia. Például amikor a markerszekvencia a LacZ gén, a szignált hordozó vektor jelenlétét a ¹galaktozidázaktivitás mérésére szolgáló vizsgálati eljárással detektáljuk. Ahol a transzgén a GFP vagy luciferáz, a szignált hordozó vektort szín alapján vizuálisan, vagy luminométerben fénytermelés alapján mérjük. Azonban elõnyösen a transzgén egy nem marker szekvencia, amely olyan terméket kódol, amely hasznos biológiában vagy gyógyászatban, mint például fehérjék, peptidek, RNS, enzimek vagy katalitikus RNS¹ek. Kívánt RNS-molekulák közé tartozik a trns, dsrns, riboszómális RNS, katalitikus RBS és antiszensz RNS. Hasznos RNS-szekvencia egy példája olyan szekvencia, amely kioltja a célzott nukleinsavszekvencia expresszióját a kezelt állatban. A transzgént kezelésre alkalmazhatjuk, például rákterápiaként vagy vakcinaként, immunválasz indukálására és/vagy profilaktikus vakcina céljára. A leírás szerinti értelemben immunválasz alatt molekula (például géntermék) azon képességét értjük, hogy képes a molekula elleni T¹sejtes és/vagy humorális immunválasz indukálására. A találmány tárgyát képezi továbbá több transzgén alkalmazása. Bizonyos helyzetekben különbözõ transzgéneket alkalmazhatunk a fehérje egyes alegységeinek kódolására, vagy különbözõ peptidek vagy fehérjék kódolására. Ez akkor elõnyös, amikor a fehérjealegységet kódoló DNS mérete nagy, például immunglobulin, vérlemezke-eredetû növekedési faktor vagy disztrofinfehérje esetében. Annak érdekében, hogy a sejt termelje a többalegységes fehérjét, a sejtet megfertõzzük a különbözõ alegységek mindegyikét kódoló rekombináns vírussal. Más megoldásképpen fehérje különbözõ alegységeit ugyanazon a transzgénen kódolhatjuk. Ebben az esetben egyetlen transzgén tartalmazza az egyes alegységeket kódoló DNS¹t, és az egyes alegységek DNS¹ét belsõ riboszómabelépési hely (IRES) választja el. Ez akkor elõnyös, amikor az egyes alegységeket kódoló DNS mérete kicsi, például amikor az alegységeket és az IRES¹t kódoló DNS teljes mérete kisebb, mint 5 kb. Az IRES alternatívájaként a DNS¹t 2A¹peptidet kódoló szekvenciák választhatják el, amelyek poszttranszlációsan elhasítják saját magu- 8

9 1 HU T2 2 kat. [Lásd például M. L. Donnelly, és mtsai., J. Gen. Virol., 78(Pt 1): old. (1997. jan.); Furler, S. és mtsai., Gene Ther. 8, old. (2001); Klump, H. és mtsai., Gene Ther. 8, old. (2001).] Ez a 2A¹peptid szignifikánsan kisebb az IRES-nél, ami jól alkalmazhatóvá teszi akkor, amikor a hely korlátozó tényezõ. Azonban a kiválasztott transzgén bármilyen biológiailag aktív terméket vagy más terméket is kódolhat, például tanulmányozni kívánt terméket. Megfelelõ transzgéneket a szakember könnyen kiválaszthat. A transzgén kiválasztását nem tekintjük a találmányt korlátozónak Szabályozóelemek A minigén fent ismertetett fõ elemei mellett a vektor tartalmazza a szükséges hagyományos szabályozóelemeket is, amelyek mûködõképesen kapcsoltak a transzgénhez oly módon, hogy lehetõvé teszik a transzkripcióját, transzlációját és/vagy expresszióját a plazmidvektorral transzfektált vagy a találmány szerint elõállított vírussal megfertõzött sejtben. A leírás szerinti értelemben mûködõképesen kapcsolt szekvenciák közé tartoznak expressziós szabályozószekvenciák, amelyek egybefüggõek a jelentõséggel bíró nukleinsavszekvenciákkal, és olyan expressziós szabályozószekvenciák, amelyek transz- vagy távoli helyzetben hatnak a jelentõséggel bíró nukleinsavszekvencia szabályozására. Az expressziós szabályozószekvenciák közé tartoznak azok, amelyek megfelelõ transzkripciós iniciációs, terminációs, promoter- és enhanszerszekvenciák; hatékony RNS-feldolgozó szignálok, mint például splicing és poliadenilációs (poli¹a) szignálok; citoplazmás RNS¹t stabilizáló szekvenciák; a transzláció hatékonyságát fokozó szekvenciák (azaz Kozak konszenzusszekvencia); a fehérje stabilitását fokozó szekvenciák; és kívánt esetben a kódolt fehérje szekrécióját fokozó szekvenciák. Nagyszámú expressziós szabályozószekvencia, beleértve natív, konstitutív, szabályozható és/vagy szövetspecifikus ismert a szakterületen, és alkalmazható. A konstitutív promoterek nem korlátozó példái közé tartozik a retrovirális Rous-szarkóma-vírus (RSV) LTR promoter (adott esetben az RSV-enhanszerrel), a citomegalovírus (CMV) promoter (adott esetben a CMVenhanszerrel) [lásd például Boshart és mtsai., Cell, 41: old. (1985)], az SV40 promoter, a dihidrofolát-reduktáz promoter, a ¹aktin promoter, a foszfoglicerol-kináz (PGK) promoter és az EF1 promoter (Invitrogen). A szabályozható promoterek lehetõvé teszik a génexpresszió szabályozását és indukálhatók, aktiválhatók, represszálhatók vagy kikapcsolhatók exogén úton adott vegyületekkel, környezeti faktorokkal, mint például hõmérséklettel vagy egy specifikus fiziológiai állapot jelenlétével például akut fázis, a sejt egy adott differenciációs stádiumával, vagy csak replikálódó sejtekben. Szabályozható promoterek és szabályozható rendszerek különféle kereskedelmi forrásokból beszerezhetõk, nem korlátozó példaként az Invitrogen, Clontech és Ariad cégektõl. Sok más rendszert leírtak és könnyedén kiválaszthatók a szakember által. Például az indukálható promoterek közé tartozik a cink-indukálható juh metallotionin (MT) promoter, a dexametazon- (Dex) indukált egér emlõdaganat-vírus (MMTV) promoter. Más szabályozható rendszer a T7 polimeráz-promoter rendszer (WO 98/10088 számú nemzetközi közzétételi irat); az ekdizon rovar promoter [No és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: old. (1996)], a tetraciklin-represszálható rendszer [Gossen és mtsai., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: old. (1992)], a tetraciklin-indukálható rendszer [Gossen és mtsai., Science, 268: old. (1995), lásd még Harvey és mtsai., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: old. (1998)]. Más rendszerek közé tartozik az FK506 dimer, VP16 vagy p65 kasztradiol, difenolmuriszleron alkalmazásával, az RU486-indukálható rendszer [Wang és mtsai., Nat. Biotech., 15: old. (1997) és Wang és mtsai., Gene Ther., 4: old. (1997)] és a rapamicin-indukálható rendszer [Magari és mtsai., J. Clin. Invest., 100: old. (1997)]. Némely szabályozható promoter hatékonysága idõvel növekszik. Bizonyos esetekben fokozhatjuk az ilyen rendszerek hatékonyságát több represszor tandem történõ beinszertálásával, például TetR összekapcsolva TetR-rel egy IRES¹en keresztül. Más megoldásképpen várhatunk legalább 3 napig a kívánt funkció szkrínelése elõtt. A kívánt fehérje expresszióját fokozhatjuk a rendszer hatékonyságának fokozására ismert módszerekkel. Például a Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE) alkalmazásával. Egy másik megvalósítási mód szerint a transzgén natív promoterét alkalmazhatjuk. A natív promoter elõnyös lehet, amikor az kívánatos, hogy a transzgén expressziója utánozza a natív expressziót. A natív promotert akkor alkalmazhatjuk, amikor a transzgén expresszióját idõlegesen vagy fejlõdésileg kell szabályozni, vagy szövetspecifikus módon, vagy specifikus transzkripciós stimulusokra válaszul. Egy további megvalósítási mód szerint más natív expressziós szabályozóelemeket, mint például enhanszerelemeket, poliadenilációs helyeket vagy Kozak-féle konszenzusszekvenciákat is alkalmazhatunk a natív expresszió utánzására. A transzgén egy másik megvalósítási módja szerint a transzgén mûködõképesen van kapcsolva szövetspecifikus promoterhez. Például ha vázizomban való expresszió kívánatos, az izomban aktív promotert kell alkalmazni. Ezek közé tartoznak azon gének promoterei, amelyek az alábbiakat kódolják: vázizom ¹aktin, miozin 2A¹könnyû lánc, disztrophin, izom kreatin-kináz, valamint szintetikus izom promoterek, amelyeknek magasabb az aktivitása, mint a természetben elõforduló promotereknek [lásd Li és mtsai., Nat. Biotech., 17: old. (1999)]. Szövetspecifikus promoterek példái ismertek a májban [albumin, Miyatake és mtsai., J. Virol., 71: old. (1997); hepatitis B vírus mag promoter, Sandig és mtsai., Gene Ther., 3: old. (1996); alfa-fetoprotein (AFP), Arbuthnot és mtsai., Hum. Gene Ther., 7: old. 9

10 1 HU T2 2 (1996)], csont oszteokalcin [Stein és mtsai., Mol. Biol. Rep., 24: old. (1997)]; csont szialoprotein [Chen és mtsai., J. Bone Miner. Res., 11: old. (1996)], limfociták [CD2, Hansal és mtsai., J. Immunol., 161: old. (1998); immunglobulin nehéz lánc; T¹sejt-receptor lánc], idegi, mint például neuronspecifikus enoláz (NSE) promoter [Andersen és mtsai., Cell. Mol. Neurobiol., 13: old. (1993)], neurofilamentum könnyû lánc gén [Piccioli és mtsai., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88: old. (1991)] és a neuronspecifikus vgf gén [Piccioli és mtsai., Neuron, 15: old. (1995)], többek között. Adott esetben terápiásan hasznos vagy immunogenikus termékeket kódoló transzgéneket hordozó vektorok szelektálható markert vagy riportergéneket tartalmazhatnak, mint például geneticin¹, higromicin- vagy purimicinrezisztenciát kódoló szekvenciákat, többek között. Az ilyen szelektálható riporterek vagy markergének (elõnyösen a virális részecskébe pakolandó virális genomon kívül elhelyezve) alkalmazhatók a plazmid jelenlétének jelzésére bakteriális sejtekben, mint például az ampicillinrezisztencia. A vektor más komponensei közé tartozik a replikációs origó. Ezek és más általános vektorelemek kiválasztása hagyományos, és sok ilyen szekvencia áll rendelkezésre (lásd például Sambrook és mtsai., és az abban idézett referenciák). Ezeket a vektorokat a leírásban megadott módszerek és szekvenciák alkalmazásával hozzuk létre, a szakember számára ismert módszerek alapján. Ilyen módszerek közé tartoznak cdns hagyományos klónozási módszerei, mint például a kézikönyvekben ismertetettek (Sambrook és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), az adenovírusgenomok átfedõ oligonukleotidszekvenciáinak az alkalmazása, polimeráz-láncreakció, és bármilyen alkalmas eljárás, amellyel a kívánt nukleotidszekvenciát elõállíthatjuk. A módosított adenovirális részecske elõállítása Minimális követelményként expressziós kazettát hordozó módosított adenovirális vektor tartalmazza a replikációhoz és a virion enkapszidációjához szükséges adenovírus cisz-elemeket, amely cisz-elemek szegélyezik a heterológ gént. Azaz a vektor tartalmazza az adenovírusok 5 invertált terminális ismétlõdõ (ITR) szekvenciáit (amelyek a replikáció origójaként funkcionálnak), a natív 5 csomagoló/enhanszer doméneket (amelyek a lineáris Ad genomok csomagolásához szükséges szekvenciákat és az E1 promoter enhanszerelemeit tartalmazzák), a heterológ molekulát, és az 5 ¹ITR szekvenciákat. Lásd például a minimális humán Ad vektor elõállítására feltárt módszereket az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban, amelyek könnyedén adaptálhatók a rekombináns majom adenovírus esetére. Adott esetben a módosított adenovírusok a fent definiált minimális majom adenovírusszekvenciáknál többet tartalmaznak. Egy megvalósítási mód szerint az adenovírusok funkcionálisan deletáltak az E1a vagy E1b génekben, és adott esetben más mutációkat is hordoznak, például hõmérséklet-érzékeny mutációkat vagy deléciókat más génekben. Más megvalósítási módok szerint kívánatos megtartani az intakt E1a és/vagy E1b régiókat a rekombináns adenovírusokban. Az ilyen intakt E1 régió a natív helyén helyezkedhet el az adenovirális genomban, vagy a natív adenovirális genom egy deléciója helyére helyezhetõ (például az E3 régióba). Gén humán (vagy más emlõs) sejtbe történõ bejuttatására hasznos adenovírusvektorok létrehozásához számos adenovírus nukleinsavszekvenciát alkalmazhatunk a vektorokban. Például eliminálhatjuk az adenovírus késleltetett korai E3 génjének egészét vagy részletét a rekombináns vírus részét képezõ adenovírusszekvenciából. Az E3 funkciójáról úgy vélik, hogy nem szükséges a rekombináns vírusrészecske elõállításához. Módosított adenovírusvektorokat elõállíthatunk úgy is, hogy funkcionális deléciót tartalmazzanak az E4 génnek legalább az ORF6 régiójában; és kívánatosabb módon az ezen régióban lévõ redundancia miatt a teljes E4 régióban. Egy még másik találmány szerinti vektor deléciót tartalmaz a késleltetett korai E2a génben. Deléciót végrehajthatunk az adenovírusgenom L1 L5 késõi génjeinek bármelyikében is. Hasonlóképpen az IX és IVa 2 közbülsõ génjeiben végrehajtott deléciók is hasznosak lehetnek bizonyos célokra. Más deléciókat végrehajthatunk más szerkezeti vagy nem szerkezeti adenovírusgénekben. A fent tárgyalt deléciókat egyedileg alkalmazhatjuk, azaz a találmány szerint alkalmazható adenovírusszekvencia csak egyetlen régióban tartalmazhat deléciókat. Más megoldásképpen teljes gének vagy azok részleteinek a deléciói, amelyek a biológiai aktivitás tönkretételére szolgálnak, hatásosak lehetnek bármilyen kombinációban. Például egy szemléltetõ vektorban az adenovírusszekvencia tartalmazhat deléciókat az E1 génekben és az E4 génben, vagy az E1, E2a és E3 génekben, vagy az E1 és E3 génekben, vagy az E1, E2a és E4 génekben, az E3 deléciójával vagy anélkül, és így tovább. Amint fent tárgyaltuk, az ilyen deléciókat más mutációkkal, mint például hõmérséklet-érzékeny mutációkkal kombinálva alkalmazhatjuk a kívánt eredmény elérésére. Az esszenciális adenovirális szekvenciák bármelyikére (például E1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1, L2, L3, L4 és L5) nézve hiányos adenovirális vektort a hiányzó adenovirális géntermékek jelenlétében tenyészthetjük, amelyek szükségesek a virális fertõzõképességhez és az adenovirális részecske szaporításához. Ezeket a segítõ funkciókat az adenovirális vektornak egy vagy több segítõ konstrukció (például plazmid vagy vírus) vagy pakoló sejtvonal jelenlétében történõ tenyésztésével biztosíthatjuk. Lásd például a minimális humán Ad vektor elõállítására feltárt módszereket az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban (publikálva május 9¹én). Függetlenül attól, hogy a módosított adenovírus csak a minimális Ad szekvenciákat tartalmazza¹e vagy a teljes Ad genomot csak funkcionális deléciókkal az E1 és/vagy E3 régiókban, a módosított vírus humán vagy majom adenovírusból származó kapszidot tartal- 10

11 1 HU T2 2 maz. Más megoldásképpen más megvalósítási módok szerint pszeudotípusú adenovírusokat alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárásokban. Az ilyen pszeudotípusú adenovírusok olyan adenovírus kapszidfehérjéket alkalmaznak, amelyekbe az eredeti adenovíruskapszid-forrásától eltérõ forrásból származó adenovírusszekvenciákat hordozó nukleinsavmolekula lett becsomagolva. Ezeket az adenovírusokat a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával állíthatjuk elõ. 1. Segítõ vírusok Ily módon a minigén hordozására alkalmazott virális vektorok adenovírusgén tartalmától függõen segítõ adenovírus vagy nem replikálódó vírusfragmens lehet szükséges a minigént tartalmazó rekombináns fertõzõ virális részecske elõállításához elégséges majom adenovírus génszekvenciák biztosítására. Hasznos segítõ vírusok olyan kiválasztott adenovírus génszekvenciákat tartalmaznak, amelyek nincsenek jelen az adenovírusvektor-konstrukcióban és/vagy nem expresszálódnak a pakoló sejtvonalban, amelybe a vektort transzfektáltuk. Egy megvalósítási mód szerint a segítõ vírus replikációdefektív és különféle adenovírus géneket tartalmaz a fent említett szekvenciák mellett. Ilyen segítõ vírus kívánt esetben kombinálva alkalmazunk E1¹et expresszáló sejtvonallal. Segítõ vírusokat létrehozhatunk polikationos konjugátumokkal, amint azt Wu és mtsai., J. Biol. Chem., 264: old. (1989); K. J. Fisher és J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49. old. (1994. április 1.) ismertetik. A segítõ vírus adott esetben egy második minigént tartalmazhat. Számos ilyen riportergén ismert a szakterületen. Az adenovírusvektoron lévõ transzgéntõl különbözõ riportergén jelenléte a segítõ víruson lehetõvé teszi az Ad vektor és a segítõ vírus egymástól független monitorozását. Ezt a második riportert a kapott rekombináns vírus és a segítõ vírus egymástól történõ elválasztására alkalmazzuk a tisztítás során. 2. Komplementációs sejtvonalak A fent ismertetett gének bármelyikére deletált módosított adenovírusok (Ad) létrehozásához a deletált génrégió funkcióját ha esszenciális a vírus replikációjához és fertõzõképességéhez biztosítani kell a rekombináns vírus számára segítõ vírussal vagy sejtvonallal, azaz komplementáló vagy pakoló sejtvonallal. Sok esetben humán E1¹et expresszáló sejtvonalat alkalmazhatunk az Ad vektor komplementálására. Ez különösen elõnyös, mert a találmány szerinti Ad szekvenciák és a jelenleg elérhetõ pakoló sejtekben található humán AdE1 szekvenciák közötti diverzitás miatt a jelenlegi humán E1¹et tartalmazó sejtek alkalmazása megakadályozza replikációkompetens adenovírusok kialakulását a replikáció és termelési folyamat alatt. Azonban bizonyos körülmények között kívánatos lehet E1 génterméket expresszáló sejtvonal alkalmazása az E1¹deletált adenovírus termelésére. Ilyen sejtvonalakat leírtak. Lásd például US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok Kívánt esetben találmány szerinti szekvenciákat alkalmazhatunk pakoló sejtvonal vagy olyan sejtvonal létrehozására, amely minimálisan az alkalmas szülõi forrásból vagy transzkomplementáló adenovírusforrásból származó adenovírus E1 gént expresszálja, a kiválasztott szülõi sejtvonalban történõ expresszióra szolgáló promoter transzkripciós szabályozása alatt. Szabályozható vagy konstitutív promotereket alkalmazhatunk erre a célra. Ilyen promoterek példáit részletesen ismertetjük másutt a leírásban. Szülõi sejtet választunk ki a bármilyen kívánt AdSAd22/Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 vagy SV39 gént expresszáló új sejtvonal létrehozására. Korlátozás nélkül az ilyen szülõi sejtvonal lehet HeLa (ATCC hozzáférési száma: CCL 2), A549 (ATCC hozzáférési száma: CCL 185), HEK 293, KB (CCL 17), Detroit (például Detroit 510, CCL 72) és WI 38 (CCL 75) sejt, többek között. Ezek a sejtvonalak elérhetõk az American Type Culture Collection intézettõl (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia ). Más alkalmas szülõi sejtvonalakat is beszerezhetünk más forrásokból. Ilyen E1¹et expresszáló sejtvonalak hasznosak adenovírus E1¹re deletált vektorok létrehozására. Ezenfelül vagy más megoldásképpen a találmány tárgyát egy vagy több majom adenovirális génterméket például E1a, E1b, E2a és/vagy E4 ORF6 expresszáló sejtvonalak képezik, amelyeket lényegében a rekombináns majom virális vektorok létrehozására szolgáló ugyanezen eljárásoknak az alkalmazásával lehet elõállítani. Ilyen sejtvonalakat az esszenciális génekre deletált és a termékeket kódoló adenovirális vektorok transzkomplementálására alkalmazhatunk, vagy a segítõ-függõ vírus (például adenoasszociált vírus) pakolásához szükséges funkciók biztosítására. Találmány szerinti gazdasejt elõállítása olyan módszereket foglal magában, mint például kiválasztott DNS-szekvenciák összeállítása. Ezt az összeállítást hagyományos módszerek alkalmazásával érhetjük el. Ilyen módszerek közé tartoznak a cdns- és genomiális klónozás, amelyek jól ismertek és a fent idézett Sambrook és mtsai. irodalmi helyen vannak ismertetve, az adenovírusgenomok átfedõ oligonukleotidszekvenciáinak az alkalmazása, polimeráz-láncreakcióval kombinálva, szintetikus eljárások, és bármilyen alkalmas eljárás, amellyel a kívánt nukleotidszekvenciát elõállíthatjuk. Egy még másik alternatíva szerint az esszenciális adenovirális géntermékeket transz-helyzetben biztosítjuk az adenovirális vektoron és/vagy segítõ víruson. Ilyen esetben alkalmas gazdasejtet bármilyen biológiai organizmusból kiválaszthatunk, beleértve prokarióta (például bakteriális) sejteket, és eukarióta sejteket, beleértve rovarsejteket, élesztõsejteket és emlõssejteket. Különösen kívánatos gazdasejteket választhatunk ki bármilyen emlõsfajból, nem korlátozó példaként beleértve olyan sejtek közül, mint például az A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293-sejtek vagy PERC6 (amely mindkettõ funkcionális adenovirális E1¹et expresszál) [Fallaux, F. J. és mtsai., (1998), Hum Gene Ther, 9: old.], Saos, C2C12, L¹sejtek, HT1080, HepG2 és emlõsökbõl, beleértve emberbõl, majomból, 11

12 1 HU T2 2 egérbõl, patkányból, nyúlból és hörcsögbõl származó primer fibroblasztok, hepatociták és mioblaszt sejtek. A sejtet biztosító emlõsfaj kiválasztása nem korlátozza találmányt; sem az emlõssejt típusa azaz hogy az fibroblaszt, hepatocita, daganatsejt stb. 3. A virális részecske összeállítása és sejtvonal transzfektálása Általában amikor a minigént tartalmazó vektort transzfekcióval juttatjuk be, a vektort körülbelül 5 g és körülbelül 100 g DNS közötti mennyiségben juttatjuk be, és elõnyösen körülbelül 10 és körülbelül 50 g DNS és körülbelül sejt és körülbelül sejt közötti, és elõnyösen körülbelül 10 5 sejt mennyiségben. Azonban a vektor DNS és a gazdasejt viszonylagos mennyiségét beállíthatjuk, olyan faktorokat figyelembe véve, mint például a kiválasztott vektor, a bejuttatás eljárás és a kiválasztott gazdasejtek. A vektor a szakterületen ismert és fent feltárt bármilyen vektor lehet, beleértve csupasz DNS, plazmid, fág, transzpozon, kozmidok, episzómák, vírusok stb. A vektor gazdasejtbe történõ bejuttatását a szakterületen ismert bármilyen módszerrel elérhetjük, amint fent feltártuk, beleértve a transzfekciót és fertõzést. Egy vagy több adenovirális gént stabilan integrálhatunk a gazdasejt genomjába, stabilan expresszálódó episzómákba vagy tranziensen expresszálhatjuk azokat. Az összes génterméket tranziensen expresszáltathatjuk, episzómán vagy stabilan integrálva lehet, vagy a géntermékek némelyikét stabilan expresszáltathatjuk és másokat tranziensen expresszáltathatunk. Ezenkívül az adenovirális gének mindegyikének a promotereit egymástól függetlenül választhatjuk ki konstitutív promoter, indukálható promoter vagy natív adenovirális promoter közül. A promotereket az organizmus vagy sejt specifikus fiziológiás állapota szabályozhatja (azaz a differenciációs stádium vagy replikálódó vagy nyugalmi sejtekben) vagy például exogén módon hozzáadott faktorok. A molekulák gazdasejtbe történõ bejuttatását (plazmidokként vagy vírusokként) elérhetjük a szakember számára ismert módszerek alkalmazásával is, amint a leírásban mindenütt tárgyaljuk. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint szokásos transzfekciós módszereket alkalmazunk, például CaPO 4 -transzfekciót vagy elektroporációt. Az adenovírus kiválasztott DNS-szekvenciáinak (valamint a transzgénnek és más vektorelemeknek) az összeszerelése különféle köztes plazmidokba, és a plazmidok és vektorok alkalmazása rekombináns virális részecske elõállítására hagyományos módszerek alkalmazásával érhetõ el. Ilyen módszerek közé tartoznak cdns hagyományos klónozási módszerei, mint például a kézikönyvekben ismertetettek (Sambrook és mtsai., fent idézve), az adenovírusgenomok átfedõ oligonukleotidszekvenciáinak az alkalmazása, polimerázláncreakció, és bármilyen alkalmas eljárás, amellyel a kívánt nukleotidszekvenciát elõállíthatjuk. Szokásos transzfekciós és együtt transzfekciós módszereket alkalmazunk, például CaPO 4 -kicsapásos módszereket Az alkalmazott egyéb hagyományos eljárások közé tartozik a virális genomok homológ rekombinációja, vírusok szélesztése agarrétegben, jelgenerálást mérõ eljárások, és hasonlók. Például a kívánt minigént tartalmazó virális vektor elõállítását és összeszerelését követõen a vektort in vitro a csomagolásra szolgáló sejtvonalba transzfektáljuk segítõ vírus jelenlétében. Homológ rekombináció megy végbe a segítõ- és vektorszekvenciák között, ami lehetõvé teszi a vektorban található adenovírus-transzgén szekvenciák replikálódását és virion kapszidokba történõ csomagolását, ami rekombináns virális vektorrészecskéket eredményez. A jelenlegi eljárás ilyen vírusrészecskék elõállítására transzfekcióalapú, azonban a találmány nincs korlátozva ilyen eljárásokra. A kapott rekombináns módosított adenovírusok hasznosak a kiválasztott transzgén kiválasztott sejtbe történõ átvitelére. A módosított adenovírusvektorok alkalmazása A találmány szerinti módosított adenovírusvektorok hasznosak géntranszferre humán vagy állatorvosi alanyba (beleértve nem humán fõemlõsöket, és más emlõsöket) in vitro, ex vivo és in vivo. Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovírusvektorokat expressziós vektorokként alkalmazhatjuk a heterológ gének által kódolt termékek in vitro elõállítására. Például alkalmas sejtvonalat megfertõzünk vagy transzfektálunk a módosított adenovírusokkal és hagyományos módon tenyésztjük azokat, lehetõvé téve a módosított adenovírusnak, hogy expresszálja a promoterrõl a génterméket. A génterméket azután visszanyerhetjük a tenyésztõ tápközegbõl fehérjetenyészetbõl történõ izolálásának és visszanyerésének ismert hagyományos eljárásaival. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovirális vektor hatékony géntranszferhordozó eszközt biztosít, amely bejuttathatja a kiválasztott transzgént kiválasztott gazdasejtbe in vivo vagy ex vivo. Például a találmány szerinti módosított adenovirális vektorokat terápiás vagy immunogenikus molekulák bejuttatására alkalmazhatjuk, amint alább ismertetjük. Egy megvalósítási mód szerint a terápiás vagy vakcina beadási rend rekombináns adenovirális vektorok ismételt bejuttatását tartalmazhatja. Az ilyen beadási rendek tipikusan virális vektorok sorozatának bejuttatását foglalják magukban, amelyekben a virális kapszid váltakozik. A virális kapszidot változtathatjuk mindegyik egymást követõ beadáshoz, vagy egy adott szerotípusú kapszid elõre meghatározott számú (például egy, kettõ, három, négy vagy több) beadása után. Ily módon egy beadási rend magában foglalhatja egy elsõ kapszidú Ad bejuttatását, egy második kapszidú Ad bejuttatását és egy harmadik kapszidú Ad bejuttatását. Más megvalósítási módok szerint olyan beadási rendet választhatunk ki, amely a találmány szerinti módosított Ad kapszidokat önmagukban alkalmazza, egymással kombinálva, vagy más Ad szerotípusú Ad¹okkal kombinálva, amint az nyilvánvaló a szakember számára. Adott esetben egy ilyen beadási rend magában fog- 12

13 1 HU T2 2 lalja nem humán fõemlõs adenovírusok, humán adenovírusok vagy mesterséges (például kiméra) szerotípusok kapszidjainak a beadását, amint a leírásban ismertetjük. A beadási rend mindegyik fázisa magában foglalhatja injekciók sorozatát (vagy más beadási útvonalakat) egyetlen Ad szerotípusú kapsziddal, amit egy sorozat követ egy másik Ad szerotípusú kapsziddal. Más megoldásképpen a találmány szerinti módosított Ad vektorokat olyan beadási rendben alkalmazhatjuk, amely más nem adenovirális-közvetített bejuttatási rendszereket foglalnak magukban, beleértve más virális rendszereket, nem virális bejuttatás rendszereket, fehérjéket, peptideket, és más biológiailag aktív molekulákat. A következõ részekben olyan szemléltetõ molekulákra koncentrálunk, amelyek bejuttathatók a találmány szerinti módosított adenovirális kapszidokkal (például fehérje formában) vagy módosított adenovirális vektorokkal. Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított Ad vektorokat embereknek adjuk be génterápia publikus eljárásai szerint, A kiválasztott transzgént hordozó találmány szerinti virális vektort beadhatjuk páciensnek, elõnyösen felszuszpendálva biológiailag kompatibilis oldatban vagy gyógyászatilag elfogadható bejuttató vivõanyagban. Alkalmas vivõanyag a steril sóoldat. Más, ismert módon gyógyászatilag elfogadható, és a szakember számára jól ismert vizes és nemvizes izotóniás steril injekciós oldatok és vizes és nemvizes steril szuszpenziók is alkalmazhatók erre a célra. A módosított adenovirális vektorokat a kívánt biológiai hatás eléréséhez elegendõ mennyiségben adjuk be. A beadás hagyományos és gyógyászatilag elfogadható útjainak a nem korlátozó példái közé tartozik a közvetlen beadás a retinára, és más intraokuláris bejuttatási eljárások, közvetlen beadás a májba, inhalálás, intranazális, intravénás, intramuszkuláris, intratracheális, szubkután, intradermális, rektális, orális, intracochleáris és más parenterális beadási utak. A beadási utakat kívánt esetben kombinálhatjuk vagy módosíthatjuk az transzgéntõl és az állapottól függõen. A beadás útja elsõdlegesen a kezelt állapot természetétõl függ. A virális vektor adagolása elsõdlegesen olyan tényezõktõl függ, mint például a kezelt állapot, a páciens kora, tömege és egészsége, és ily módon változhat a páciensek között. Például a virális vektor felnõtt humán vagy állatorvosi dózisa általában a körülbelül 100 l és körülbelül 100 ml közötti mennyiségû hordozó, amely körülbelül és körülbelül közötti koncentrációjú részecskét, körülbelül és közötti koncentrációjú részecskét, vagy körülbelül és közötti koncentrációjú vírus részecskét tartalmaz. A dózistartományok függenek az állat méretétõl és a beadás útjától. Például alkalmas humán vagy állatorvosi dózis (egy körülbelül 80 kg tömegû állatnak) intramuszkuláris injekció esetében a körülbelül és körülbelül részecske per ml tartományban van, egyetlen helyre bejuttatva. Adott esetben több beadási helyen is bejuttathatjuk. Egy másik példában az alkalmas humán vagy állatorvosi dózis a körülbelül és körülbelül közötti mennyiségû részecske tartományban van orális kiszerelés esetében. A szakember megváltoztathatja ezeket a dózisokat, a beadás útjától, és az alkalmazott terápiás vagy vakcinázási alkalmazástól függõen, amelyre a rekombináns vektort alkalmazzuk. A transzgén expressziójának szintjét, vagy egy immunogén esetében a keringõ ellenanyag szintjét monitorozhatjuk, hogy meghatározzuk a dózis beadásának gyakoriságát. A beadás gyakoriságának meghatározására szolgáló más eljárásokat nyilvánvalóak a szakember számára. 1. Terápiás molekulák Egy aspektus szerint a módosított adenovírushexon-fehérjék egy vagy több terápiás transzgén inszertjét tartalmazhatják, hogy elõsegítsék a célzást, és/vagy terápiás rendben történõ alkalmazásra, amint a leírásban ismertetjük. Egy másik aspektusban a találmány szerinti módosított adenovirális vektorok egy vagy több terápiás transzgént hordozhatnak beléjük pakolva. A transzgén által kódolt hasznos terápiás termékek közé tartoznak hormonok és növekedési és differenciálódási faktorok, amelyek nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbiak: inzulin, glukagon, növekedési hormon (GH), paratiroid hormon (PTH), növekedési hormont felszabadító faktor (GRF), follikulus stimulálóhormon (FSH), luteinizálóhormon (LH), humán koriogonadotropin (hcg), vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), angiopoietinek, angiosztatin, granulocita kolóniastimuláló faktor (GCSF), eritropoietin (EPO), kötõszöveti növekedési faktor (CTGF), bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bfgf), savas fibroblaszt növekedési faktor (afgf), epidermális növekedési faktor (EGF), transzformáló növekedési faktor a (TGF ), vérlemezke-eredetû növekedési faktor (PDGF), inzulin növekedési faktor I és II (IGF¹I és IGF¹II), a transzformáló növekedési faktor szupercsalád bármelyik tagja, köztük a TGF, aktivinek, inhibinek, vagy BMP 1 15 csont morfogenikus fehérjék (BMP) bármelyike, a heregluin/neuregulin/aria/neu differenciációs faktor (NDF) növekedési faktorok családjának bármelyik tagja, idegi növekedési faktor (NGF), agyi eredetû neurotrofikus faktor (BDNF), NT 3 és NT 4/5 neurotrofinok, ciliáris neurotrofikus faktor (CNTF), gliasejtvonal-eredetû neurotrofikus faktor (GDNF), neurturin, agrin, szemaforin/kollapszin család bármelyik tagja, netrin¹1 és netrin-2, hepatocita növekedési faktor (HGF), efrinek, noggin, sonic hedgehog és tirozin-hidroxiláz. Más hasznos transzgéntermékek közé tartoznak azok a fehérjék, amelyek az immunrendszert szabályozzák, nem korlátozó példaként citokinek és limfokinek, mint például trombopoietin (TPO), interleukinek (IL) IL 1-tõl IL 25¹ig (beleértve például IL 2, IL 4, IL 12 és IL 18), monocita kemoattraktáns fehérje, leukémia inhibitoros faktor, granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor, Fas ligandum, tumornekrózis-faktorok, interferonok és õssejtfaktor, flk-2/flt3 ligandum. Az immunrendszer által termelt géntermék is alkalmazhatók a találmány szerint. Ezek nem korlátozó példái közé 13

14 1 HU T2 2 tartoznak az IgG, IgM, IgA, IgD és IgE immunglobulinok, kiméra immunglobulinok, humanizált ellenanyagok, egyláncú ellenanyagok, T¹sejt-receptorok, kiméra T¹sejt-receptorok, egyláncú T¹sejt-receptorok, I. és II. osztályba tartozó MHC-molekulák, valamint génsebészeti úton módosított immunglobulinok és MHC-molekulák. Hasznos géntermékek közé tartoznak a komplementet szabályozó fehérjék, mint például komplementszabályozó fehérjék, membrán-kofaktorfehérje (MCP), lebomlást gyorsító faktor (DAF), CR1, CF2 és CD59. Még más hasznos géntermékek közé tartoznak a különféle hormonok, növekedési faktorok, citokinek, limfokinek, szabályozófehérjék és immunrendszeri fehérjék receptorai. A találmány tárgykörébe tartoznak a koleszterin szabályozásának a receptorai, mint például az alacsony sûrûségû lipoprotein (LDL) receptor, magas sûrûségû lipoprotein (HDL) receptor, a nagyon alacsony sûrûségû lipoprotein (VLDL) receptor, a lipidek szabályozásában hasznos fehérjék, beleértve például az apolipoprotein (apo) A és izoformái (például ApoAI), apoe és izoformái (beleértve E2, E3 és E4), SRB1, ABC1, és a scavenger receptor. A találmány tárgykörébe tartoznak olyan géntermékek is, mint például a szteroidhormon-receptor szupercsalád tagjai, közöttük a glukokortikoidreceptorok és ösztrogénreceptorok, D¹vitamin-receptorok és más sejtmagi receptorok. Ezenfelül hasznos géntermékek közé tartoznak a transzkripciós faktorok, mint például jun, fos, max, mad, szérumreakciós faktor (SRF), AP 1, AP2, myb, MyoD és miogenin, ETS-boxot tartalmazó fehérjék, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF 4, C/EBP, SP1, CCAAT-boxot kötõ fehérjék, interferont szabályozó faktor (IRF 1), Wilms-tumorfehérje, ETS-kötõ fehérje, STAT, GATA-boxot kötõ fehérjék, például GATA-3, és a szárnyashélix-fehérjék villásfejû családja. Más hasznos géntermékek közé tartozik a karbamoil-szintetáz¹i, ornitin-transzkarbamiláz, arginoszukcinát-szintetáz, arginoszukcinát-liáz, argináz, fumarilacetacetát-hidroláz, fenil-alanin-hidroxiláz, alfa¹1 antitripszin, glükóz-6-foszfatáz, porfobilinogén-deamináz, cisztation-béta-szintáz, elágazó láncú ketoacid-dekarboxiláz, albumin, izovaleril-coa-dehidrogenáz, propionil-coa-karboxiláz, metil-malonil-coa-mutáz, glutaril- CoA-dehidrogenáz, inzulin, béta-glükozidáz, piruvátkarboxilát, májbeli foszforiláz, foszforiláz-kináz, glicindekarboxiláz, H¹fehérje, T¹fehérje, cisztás fibrózis transzmembrán regulátor (CFTR) szekvencia és disztrofin cdns-szekvencia. Más hasznos géntermékek közé tartoznak a hemofilia A kezelésre hasznosak (például VIII¹as faktor és variánsai, beleértve a heterodimer könnyû láncát és nehéz láncát, adott esetben mûködõképesen kapcsoltan kapcsolórégióval, és a VIII¹as faktor B¹doménja, lásd az US és számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat), és a hemofilia B kezelésére hasznosak (például IX¹es faktor). Még más hasznos géntermékek közé tartoznak természetben nem elõforduló polipeptidek, mint például kimérák vagy hibrid polipeptidek, amelyek aminosavak inszercióit, delécióit vagy szubsztitúcióit tartalmazó természetben nem elõforduló aminosavszekvenciákat tartalmaznak. Például génsebészeti úton módosított egyláncú immunglobulinok hasznosak lehetnek bizonyos hibás immunrendszerû páciensekben. Más típusú természetben nem elõforduló génszekvenciák közé tartoznak antiszensz molekulák és katalitikus nukleinsavak, mint például ribozimok, amelyek alkalmazhatók egy célpont túltermelésének csökkentésére. Egy gén expressziójának csökkentése és/vagy modulálása különösen elõnyös hiperproliferatív állapotok kezelésére, amelyeket hiperproliferáló sejtek jellemeznek, mint például rákok és pszoriázis. A célpolipeptidek közé tartoznak azok a polipeptidek, amelyek kizárólag hiperproliferáló sejtekben termelõdnek, vagy normális sejtekkel összehasonlítva magasabb szinten termelõdnek azokban. A célantigének közé tartoznak onkogének mint például myb, myc, fyn és a bcr/abl transzlokációs gén, ras, src, P53, neu, trk és EGRF által kódolt polipeptidek. Az onkogéntermékek mint célantigének mellett a rákellenes kezelések és védõ kezelések célpolipeptidjei közé tartoznak béta-sejtes limfómák által termelt ellenanyagok variábilis régiói és T¹sejtes limfómák T¹sejt-receptorainak variábilis régiói, amelyek bizonyos megvalósítási módok szerint szintén alkalmazhatók autoimmun betegség célantigénjeként. Más daganattal kapcsolatos polipeptideket is alkalmazhatunk célpolipeptidként, mint például azokat a polipeptideket, amelyek magasabb koncentrációban találhatunk meg daganatsejtekben, beleértve a 17¹A1 monoklonális ellenanyag és folátkötõ polipeptidek által felismert polipeptidet. Más alkalmas terápiás polipeptidek és fehérjék közé tartoznak azok, amelyek hasznosak lehetnek autoimmun betegségekben és rendellenességekben szenvedõ személyek kezelésére, és amelyek széles körû védõ immunválaszt biztosítanak olyan célpontok ellen, amelyek autoimmunitással kapcsolatosak, beleértve sejtreceptorokat és olyan sejteket, amelyek saját anyagok ellen irányuló ellenanyagokat termelnek. T¹sejt-közvetített autoimmun betegségek közé tartozik a reumatoid arthritisz (RA), sclerosis multiplex (MS), Sjögren-szindróma, szarkoidózis, inzulinfüggõ diabetes mellitus (IDDM), autoimmun tiroiditisz, reaktív arthritisz, merev szpondilitisz, szkleroderma, polimiozitisz, dermatomiozitisz, pszoriázisz, vaszkulitisz, Wegener-féle granulomatózis, Crohn-féle betegség és ulceratív kolitisz. Ezen betegségek mindegyikét olyan T¹sejt-receptorok (TCR) jelenléte jellemzi, amelyek endogén antigénekhez kötõdnek, és az autoimmun betegséghez kapcsolódó gyulladásos kaszkádreakciót váltanak ki. A találmány szerinti módosított adenovirális vektorok különösen alkalmasak olyan terápiás beadási rendekben, amelyekben több adenovirális közvetítéssel bejuttatott transzgén kívánatos, például ugyanannak a transzgénnek az újbóli bejuttatását vagy más transzgénekkel kombinálva való bejuttatást magában foglaló beadási rendekben. Az ilyen beadási rendek módosított adenovirális vektor beadását foglalhatják magukban, majd a vektor újbóli beadását ugyanabba a szero- 14

15 1 HU T2 2 típusba tartozó adenovírusból származó vektorral. Különösen kívánatos beadási rendek olyan találmány szerinti módosított adenovirális vektor beadását foglalják magukban, amelyben az elsõ beadásnál bejuttatott virális vektor szerotípusa különbözik az egy vagy több késõbbi beadásban alkalmazott virális vektor szerotípusától. Például egy terápiás beadási rend módosított adenovirális vektor beadását foglalja magában, és ismételt beadást egy vagy több, ugyanabba vagy eltérõ szerotípusba tartozó módosított adenovírussal. Egy másik példában a terápiás beadási rend adenovirális vektor beadását foglalja magában, majd találmány szerinti módosított adenovírusvektor ismételt beadását, amelynek a szerotípusa különbözik az elsõnek bejuttatott adenovirális vektor szerotípusától, és adott esetben egy további beadást egy másik vektorral, amely ugyanaz, vagy elõnyösen különbözõ a korábbi beadási lépésekben alkalmazott vektor szerotípusától. Ezek a beadási rendek nem korlátozódnak a találmány szerinti kiméra szerotípusok alkalmazásával létrehozott adenovirális vektorok bejuttatására. Sõt, ezek a beadási rendek könnyen alkalmazhatják más adenovirális szerotípusok vektorait (akár módosítottak, akár nem), amelyek lehetnek mesterségesek, humán vagy nem humán fõemlõs, vagy más emlõsforrásból származók, kombinációban egy vagy több találmány szerinti kiméra vektorral. Ilyen szerotípusok példáit részletesen tárgyaljuk másutt a leírásban. Továbbá ezek a terápiás beadási rendek magukban foglalhatják a találmány szerinti módosított adenovirális vektorok egyidejû vagy egymás utáni bejuttatását kombinációban nem adenovírusvektorokkal, nem virális vektorokkal és/vagy különféle egyéb terápiásan hatásos vegyületekkel vagy molekulákkal. A találmány nem korlátozódik ezekre a terápiás beadási rendekre, amelyek közül számos nyilvánvaló a szakember számára. 2. Immunogenikus transzgének bejuttatása Amint korábban ismertettük, a módosított adenovírushexon-fehérje önmagában módosított lehet, hogy kiválasztott peptidet, polipeptidet vagy fehérjét tartalmazzon, amely immunválasz indukál egy kiválasztott immunogén ellen. Az ilyen módosított adenovírushexon-fehérjét önmagában olyan adenovíruskapszid létrehozására alkalmazhatjuk, amely önmagában hasznos célzásra, adjuvánsként és/vagy specifikus immunválasz indukálására. Egy további megvalósítási mód szerint az ilyen módosított adenovíruskapszid virális részecske létrehozására alkalmazható, amelybe alkalmas expressziós kazetta vagy minigén van pakolva. Ily módon egy megvalósítási mód szerint találmány szerinti módosított adenovirális vektor továbbá az adenovíruskapszidba pakolva olyan peptidet, polipeptidet vagy fehérjét kódoló transzgént tartalmaz, amely kiválasztott immunogén elleni immunválaszt indukál. Az ilyen találmány szerinti módosított adenovírusok önbeindító hatást, adjuváns hatást biztosíthatnak és/vagy nagyon hatékonyak lehetnek a vektor által expresszált beinszertált heterológ fehérjék elleni citolitikus T¹sejtek és/vagy ellenanyagok indukálására A találmány szerinti adenovírusokat alkalmazhatjuk immunogenikus készítményekként is. A rekombináns adenovírusokat profilaktikus vagy terápiás vakcinákként alkalmazhatjuk bármilyen olyan kórokozó ellen, amelyre az immunválasz indukálására kulcsfontosságú és a kórokozó elterjedését limitálni képes antigén(eke)t azonosítottak Is, amelyekre a cdns hozzáférhetõ. Az ilyen vakcina (vagy más immunogenikus) készítményeket alkalmas bejuttatási hordozóban szereljük ki, amint fent ismertetjük. Általában az immunogenikus készítmények dózisai a terápiás készítményekre fent megadott tartományokba esnek. Követhetjük a kiválasztott gén immunitásának a szintjét, hogy meghatározzuk a megerõsítõ oltások szükségességét, ha kellenek egyáltalán. Az ellenanyagtiterek szérumbeli meghatározását követõen adott esetben megerõsítõ immunizációkra lehet szükség. Adott esetben a találmány szerinti vakcinakészítményt úgy szerelhetjük ki, hogy más komponenseket is tartalmazzon, például adjuvánst, stabilizálószert, ph¹beállító ágenst, vagy tartósítószert, és hasonlókat. Ilyen komponensek jól ismertek a vakcinák területén járatos szakember számára. Az alkalmas adjuvánsok nem korlátozó példái közé tartoznak a liposzómák, alum, monofoszforil-lipid¹a, és bármilyen biológiailag aktív faktor, mint például citokin, interleukin, kemokin, ligandumok, és optimális esetben ezek kombinációi. Ezen biológiailag aktív faktorok némelyikét expresszáltathatjuk in vivo, például plazmid vagy virális vektorral. Például egy ilyen adjuvánst beadhatunk antigént kódoló beindító DNS-vakcinával, hogy fokozzuk az antigénspecifikus immunválaszt, összehasonlítva a csak az antigént kódoló DNS-vakcinával történõ beindítással létrehozott immunválasszal. Az adenovírusokat immunogenikus mennyiségben adjuk be, azaz olyan mennyiségben, amely hatásos a beadás útján a kívánt sejtek transzfektálására és a kiválasztott gén elegendõ szintû expresszióját biztosítják immunválasz indukálására. Ahol védõ immunitást biztosítunk, az adenovírusokat fertõzés és/vagy visszatérõ betegség megakadályozására hasznos vakcinakészítményeknek tekintjük. Például az immunogének különféle víruscsaládokból származhatnak. A kívánatos víruscsaládok, amelyek ellen immunválasz lehet kívánatos: picornavíruscsalád, amelybe tartozik a Rhinovirusok nemzetsége, amelyek a közönséges megfázásos esetek körülbelül 50%-áért felelõsek; az Enterovirusok nemzetsége, amelybe tartoznak a Poliovirusok, Coxsackievirusok, Echovirusok és humán enterovírusok, mint például a hepatitis A vírus; és az Apthovirusok nemzetsége, amelyek a száj- és körömfájás betegségekért felelõsek, elsõsorban nem humán állatokban. A vírusok picornavírus családjában a célantigének közé tartozik a VP1, VP2, VP3, VP4 és VPG. Egy másik víruscsalád a Calcivirusok családja, amelybe tartozik a vírusok Norwalk csoportja, amelyek a járványos gasztroenteritisz fontos kórokozói. Még másik víruscsalád az immunválaszt indukáló célantigénekként történõ alkalmazásra emberekben és nem humán állatokban a Togavirusok 15

16 1 HU T2 2 családja, amelybe tartozik az Alfavirusok nemzetsége, amelybe tartoznak a Sindbis-vírusok, RossRiver-vírus, és a venezuelai, keleti és nyugati lóenkefalitisz, és a Rubivirusok, köztük a Rubella-vírus. A Flaviviridae családba tartoznak a dengue, sárgaláz, japán enkefalitisz, St. Louis enkefalitisz és kullancs által hordozott enkefalitiszvírusok. Más célantigéneket állíthatunk elõ a Hepatitis C vagy a koronavirus családból, amelyek tagjai közé tartoznak különféle humán és nem humán vírusok, mint például fertõzõ bronchitisz vírus (baromfi), sertés átvihetõ gasztroenterikus vírus (sertés), sertés hemagglutinációs enkefalomielitisz vírus (sertés), macska fertõzõ peritonitisz vírus (macskák), macska enterikus koronavírus (macska), kutya koronavírus (kutya) és humán respiratorikus koronavírusok, amelyek közönséges megfázást és/vagy nem A, B vagy C hepatitiszt okozhatnak. Emellett a humán koronavírusok közé tartozik a hirtelen akut respiratorikus szindróma (SARS) feltételezett kórokozója. A koronavírus családban a célantigének közé tartozik az E1 (más néven M vagy mátrix fehérje), E2 [más néven S vagy tüske ( Spike ) fehérje], E3 (más néven HE vagy hemagglutin-elteróz) glikoprotein (nincs jelen minden koronavírusban) vagy N (nukleokapszid). Még más antigéneket is célozhatunk a Rhabdovirus család ellen, amelyek közé tartozik a Vesiculovirus család (például vezikuláris sztomatitisz vírus), és az általános Lyssavirus nemzetség (például veszettség). A Rhabdovirus családban a megfelelõ antigéneket a G fehérjébõl vagy N fehérjébõl származtathatjuk. A Filoviridae család, amelybe tartoznak a hemorrágiás láz vírusok, mint például a Marburg- és ebolavírus, antigének megfelelõ forrásai lehetnek. A Paramyxovirusok családjába tartozik a parainfluenzavírus 1¹es típusa, parainfluenzavírus 3¹as típusa, szarvasmarha parainfluenzavírus 3¹as típusa, rubulavírus (mumpszvírus, parainfluenzavírus 2¹es típusa, parainfluenzavírus 4¹es típusa, Newcastle-betegség vírusa (csirkék), marhavész, Morbillivirusok, amelyek közé tartozik a kanyaró és szopornyica, és Pneumovirusok, amelyek közé tartozik a respiratorikus szinciciális vírus. Az influenzavírust az Orthomyxovirusok családjába soroljuk, és antigének alkalmas forrása (például a HA fehérje, az N1 fehérje). A Bunyavirusok családjába tartoznak a Bunyavirus (kaliforniai enkefalitisz, La Crosse), Phlebovirus (Rift Valley láz), Hantavirus (a puremala egyfajta hemorrágiás láz vírus), Nairovírus (Nairobi juhbetegség) nemzetségek és különféle nem osztályozott Bungavirusok. Az Arenavírusok családja LCM és Lassa láz vírusok elleni antigének forrása. A Reovirusok családjába tartoznak a Reovirus, Rotavirus (amely akut gasztroenteritiszt okoz gyermekekben), Orbivirus és Cultivirus [Colorado kullancs láz, Lebombo (emberek), lóenkefalózis, kék nyelv] nemzetségek. A retrovírusok családjába tartozik az Oncorivirinal alcsalád, amely olyan humán és állatorvosi betegségeket tartalmaz, mint például macska leukémiavirus, HTLV I és HTLV II, Lentivirinal [amely tartalmazza a humán immundeficiencia-vírust (HIV), majom immundeficiencia-vírust (SIV), macska immundeficiencia-vírust (FIV), ló fertõzõ anémiavírust], és a Spumavirinal A lentivírusok között sok alkalmas antigént feltártak és könnyen kiválaszthatók. Az alkalmas HIV- és SIV-antigének nem korlátozó példái közé tartoznak a gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef és Rev fehérjék, valamint azok különféle fragmensei. Például az Env fehérje alkalmas fragmensei közé tartozhat bármelyik alegysége, mint például a gp120, gp160, gp41, vagy kisebb fragmensei, például a legalább körülbelül 8 aminosav hosszúságúak. Hasonlóképpen a tat fehérje fragmenseit is kiválaszthatjuk (lásd az US és az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat). Lásd még a D. H. Barouch és mtsai., J. Virol., 75(5): old. (March 2001), és R. R. Amara, és mtsai., Science, 292: old. (6 April 2001) irodalmi helyeken ismertetett HIV- és SIV-fehérjéket. Egy másik példában a HIV és/vagy SIV immunogenikus fehérjéket vagy peptideket fúziós fehérjék vagy más immunogenikus molekulák kialakítására alkalmazhatjuk. Lásd például a O 01/54719 számú nemzetközi közzétételi iratban (publikálva 2001, augusztus 2.) és WO 99/16884 számú nemzetközi közzétételi iratban (publikálva április 8.) ismertetett HIV 1 Tat és/vagy Nef fúziós fehérjéket és immunizációs beadási rendeket. A találmány nem korlátozódik a leírásban ismertetett HIV és/vagy SIV immunogenikus peptidekre. Ezenfelül ezen fehérjék különféle módosításait is ismertették vagy könnyen elvégezhetõk a szakember számára. Lásd például a módosított gag protein fehérjét, amelyet az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetnek. Továbbá bármely kívánt HIV és/vagy SIV immunogén bejuttatható egyedül vagy kombinációban. Az ilyen kombinációk közé tartozhat expresszió egyetlen vektorról vagy több vektorról. Adott esetben egy másik kombináció magában foglalhatja egy vagy több expresszált immunogén bejuttatását egy vagy több fehérje formában lévõ immunogén bejuttatásával együtt. Az ilyen kombinációkat részletesen ismertetjük alább. A Papovavirus családba tartozik a Polyomavirusok alcsaládja (BKU és JCU vírusok) és a Papillomavirusok alcsaládja (amelyek rákokkal és papilloma rosszindulatú kialakulásával kapcsolatosak). Az Adenovirusok családjában olyan vírusok (EX, AD7, ARD, O.B.) tartoznak, amelyek respiratórikus betegséget és/vagy enteritiszt okoznak. A Parvovirusok családjába tartozik a macska parvovírus (macska enteritisz), macska panleucopenia vírus, kutya parvovírus és sertés parvovírus. A Herpeszvirus családba tartozik az Alphaherpesvirinae alcsalád, amelybe beletartozik a Simplexvirus (HSVI, HSVII) és Varicellovirus nemzetség (álveszettség, Varicella zoster) és a Betaherpesvirinae alcsalád, amelybe beletartozik a Cytomegalovirus nemzetség (HCMV, muromegalovírus), és a Gammaherpesvirinae alcsalád, amelybe beletartozik a Lymphocryptovirus nemzetség, EBV (Burkitts-limfóma), fertõzõ rinotracheitisz, Marek-féle betegség vírusa és a Rhadinovirus. A Poxvirus családba tartozik a Chordopoxvirinae alcsalád, amelybe beletartozik az orthopoxvírus nemzetség [Variola (himlõ) és Vaccinia (tehénhimlõ)], Para- 16

17 1 HU T2 2 poxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Suipoxvirus, és az Entomopoxvirinae alcsalád. A Hepadnavirus családba tartozik a Hepatitis B vírus. Egy nem osztályozott vírus, amely alkalmas lehet antigének forrásaként a Hepatitis delta vírus. Még további vírusforrások közé tartozik a madár fertõzõ burzális betegség vírusa és a sertés respiratórikus és reproduktív szindróma vírus. Az Alphavirus családba tartozik a ló arteritiszvírus és különféle enkefalitiszvírusok. A találmány szerinti vírusok hordozhatnak olyan immunogéneket is, amelyek hasznosak humán vagy nem humán állat immunizálására más patogének ellen, mint például baktériumok, gombák, parazita mikroorganizmusok vagy többsejtû paraziták ellen, amelyek humán és nem humán gerinceseket fertõznek meg, vagy ráksejtekbõl vagy daganatsejtekbõl származnak. A bakteriális patogének példái közé tartoznak a patogén Gram-pozitív kokkuszok, például pneumokokkuszok; sztafilokokkuszok; és sztreptokokkuszok. Patogén Gram-negatív kokkuszok közé tartoznak a meningokokkusz; gonokokkusz. Patogén enterikus Gram-negatív bacillusok közé tartoznak az Enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria és eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. ducreyi (ami kankroidot okoz); brucella; Franisella tularensis (ami tularémiát okoz); yersinia (pasteurelia); streptobacillus moniliformis és spirillum; Gram-pozitív bacillusok közé tartozik a listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphtheria (diftéria); cholera; B. anthracis (anthrax); donovanosis (granuloma inguinale); és bartonellosis. Patogén anaerob baktériumok által okozott betegségek közé tartozik a tetanusz; botulizmus; más Clostridiumok; tuberkulózis; lepra; és más Mycobacteriumok. Patogén spirochetás betegségek közé tartozik a szifilisz; treponematózis: yaws, pinta és endemikus szifilisz; és leptospirózis. Más, magasabb rendû baktériumok és patogén gombák által okozott betegségek közé tartozik az aktinomikózis; nokardiózis; kriptokokkózis, blasztomikózis, hisztoplazmózis és kokcidioidomikózis; kandidiázis, aszpergillózis és mukormikózis; sporotrichózis; parakokcidiodomikózis, petriellidiózis, torulopszózis, micetóma és kromomikózis; és dermatofitózis. Rickettsiafertõzések közé tartozik a tífuszos láz, Rocky Mountain foltos láz, Q láz és Rickettsia-himlõ. Mycoplasma- és Chlamydia-fertõzések példái közé tartozik: Mycoplasma pneumoniae; Lymphogranuloma venereum; pszittakózis; és születés körüli Chlamydia-fertõzések. Patogén eukarióták közé tartoznak a patogén egysejtûek és bélférgek, és az általuk okozott fertõzések közé tartozik: amebiázis; malária; leishmaniázis; tripanoszomiázis; toxoplazmózis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babeziózis; giardiázis; trichinózis; filariázis; schistoszomiázis; hengeresférgek; bélgiliszták vagy mételyek; és galandféreg-fertõzések. Ezen organizmusok és/vagy toxinok közül sokat biológiai támadásokra alkalmasnak nyilvánított a Centers for Disease Control intézet [(CDC), Department of Heath and Human Services, USA]. Például ezen biológiai ágensek közé tartozik a Bacillus anthracis (anthrax), Clostridium botulinum és a toxinja (botulizmus), Yersinia pestis (pestis), variola major (himlõ), Francisella tularensis (tularémia), és virális hemorrágiás lázak [filovíruses (például Ebola, Marburg)], és arenavírusok (például Lassa, Machupo), amelyek mindegyikét A kategóriás ágensnek sorolták be; Coxiella burnetti (Q¹láz); Brucella species (brucellózis), Burkholderia mallei (takonykór), Burkholderia pseudomallei (meloidózis), Ricinus communis és a toxinja (ricin toxin), Clostridium perfringens és a toxinja (epszilon toxin), Staphylococcus fajok és toxinjaik (enterotoxin B), Chlamydia psittaci (pszittakózis), vízbiztonsági fenyegetések (például Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), tífuszos láz (Richettsia powazekii), és virális enkefalitisz (alphavírusok, például Venezuelan equine encephalitis; keleti equine encephalitis; nyugati equine encephalitis); amelyek mindegyike jelenleg B kategóriás ágensként vannak besorolva; és a Nipan-vírus és hantavírusok, amelyek jelenleg C kategóriás ágensként vannak besorolva. Emellett más organizmusok, amelyeket így osztályoznak vagy eltérõen osztályoznak, azonosíthatók és/vagy alkalmazhatók ilyen célra a jövõben. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti virális vektorok és más konstrukciók hasznosak ezekbõl az organizmusokból, vírusokból, toxinjaikból vagy más melléktermékeikbõl származó antigének bejuttatására, ami megelõzheti és/vagy kezelheti az ezen biológiai ágensek általi fertõzést vagy más káros reakciókat. A találmány szerinti vektorok beadása a T¹sejtek variábilis régiója elleni immunogének bejuttatására citotoxikus limfocitákat (CTL) magában foglaló immunválaszt vált ki ezen T¹sejtek eliminálására. A reumatoid arthritiszben (RA) T¹sejt-receptorok (TCR) betegségben részt vevõ számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR¹ek közé tartozik a V 3, V 14, V 17 és V 17. Ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló nukleinsavszekvencia bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, amelyik az RA¹ban részt vevõ T¹sejteket céloz. A sclerosis multiplexben (MS) TCR¹ek betegségben részt vevõ számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR¹ek közé tartozik a V 7 és V 10. Ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló nukleinsavszekvencia bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, amelyik az MS¹ben részt vevõ T¹sejteket céloz. A szklerodermában TCR¹ek betegségben részt vevõ számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR¹ek közé tartozik a V 6, V 8, V 14 és V 16, V 3C, V 7, V 14, V 15, V 16, V 28 és V 12. Ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló kiméra adenovírus bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, amelyik a szklerodermában részt vevõ T¹sejteket céloz. 3. Bejuttatási eljárások Követhetjük a kiválasztott gén terápiás szintjét, vagy az immunitás szintjét, hogy meghatározzuk a megerõsítõ oltások szükségességét, ha kellenek egyáltalán. A CD8+ T¹sejtes válasz vagy adott esetben az ellenanyagtiterek szérumbeli meghatározását követõen adott esetben megerõsítõ oltásokra lehet szük- 17

18 1 HU T2 2 ség. Adott esetben a találmány szerinti adenovirális vektorokat egyetlen beadással juttathatjuk be vagy különféle kombinációs beadási rendekben, például más hatóanyag beadását magában foglaló beadási renddel vagy kezelési móddal kombinálva vagy beindító-megerõsítõ beadási rendben. Különféle ilyen adagolási rendeket írtak le a szakirodalomban, amelyek közül könnyen választhatunk. Például beindítási-megerõsítési rendszerben egy DNS-alapú (például plazmid) vektort adhatunk be az immunrendszer beindítására egy második vagy további, hagyományos antigénnel végzett megerõsítõ beadás számára, mint például fehérjével vagy ilyen antigént kódoló szekvenciákat hordozó rekombináns vírussal. Lásd például a WO 00/11140 számú nemzetközi közzétételi iratot (publikálva március 2¹án). Más megoldásképpen egy immunizációs beadási rend magában foglalhatja találmány szerinti módosított adenovirális vektor beadását az immunválasz beindítására egy antigént vagy fehérjét hordozó vektor (akár virális akár DNS-alapú) számára. Egy még másik alternatívában egy immunizációs rend magában foglalja fehérje beadását, amit az antigént kódoló vektorral végzett megerõsítés követ. Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy kiválasztott antigén elleni immunválasz beindítására és megerõsítésére olyan beadási rendben, amely a találmány szerinti módosított adenovirális vektor bejuttatását foglalja magában. Az ilyen beadási rend magában foglalhatja kiválasztott immunogént hordozó plazmid DNS-vektor bejuttatását és/vagy multiproteinek expresszáltatását a beindító és/vagy megerõsítõ hordozóeszközrõl. Lásd például R. R. Amara, Science, 292: old. (2001. április 6.), amely multiprotein beadási rendet ismertet HIV és SIV elleni immunválasz létrehozására alkalmas fehérjealegységek expresszáltatására. Például egy beindítás bejuttathatja a Gag, Pol, Vif, VPX és Vpr és Env, Tat, és Rev fehérjéket egyetlen transzkriptumról vagy több transzkriptumról. Más megoldásképpen a SIV Gag, Pol és HIV 1 Env fehérjéket juttatjuk be egyetlen konstrukción. Még más beadási rendeket ismertetnek a WO 99/16884 és WO 01/54719 számú nemzetközi közzétételi iratokban. Azonban a beindítás-megerõsítés rendszerek nem korlátozódnak HIV elleni immunizálásra vagy ezen antigének bejuttatására. Például a beindítás magában foglalhatja egy elsõ vektor bejuttatását, majd megerõsítést egy második vektorral, vagy magát az antigént fehérje formában tartalmazó készítménnyel. Egy példában a beindítási-megerõsítési beadási rend védõ immunválaszt biztosíthat a vírus, baktériumok vagy más organizmus ellen, amelybõl az antigén származik. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a beindításimegerõsítési beadási rend terápiás hatást biztosíthat, amelyet hagyományos vizsgálati eljárásokkal mérhetünk azon állapot jelenlétének detektálására, amelyre a terápiát alkalmazzuk. A beindító készítményt különféle helyekre adhatjuk be a testben dózisfüggõ módon, amely attól az antigéntõl függ, amelyre a kívánt immunválaszt célozzuk A találmány nem korlátozódik az injekció(k) mennyiségére és helyére, vagy a gyógyászati hordozóra. Sõt, a beadási rend magában foglalhat olyan beindítási és/vagy megerõsítési lépést, amelyek mindegyike egyetlen dózist tartalmazhat, vagy olyan dózisokat, amelyeket óránként, naponta, hetente vagy havonta, vagy évente adunk be. Például az emlõsök egy vagy két dózist kaphatnak, amelyek körülbelül 10 g éskörülbelül 50 g közötti mennyiségû plazmidot tartalmaznak hordozóban. A DNS-készítmény kívánatos mennyisége körülbelül 1 g és körülbelül g közötti mennyiségû DNS-vektor. Az adagolás változhat körülbelül 1 g és 1000 g DNS/testtömeg¹kg mennyiség között. A bejuttatás mennyiségét vagy helyét elõnyösen az emlõs fajától és állapotától függõen választjuk ki. Az antigén emlõsbe történõ bejuttatására alkalmas vektor egységdózisát ismertetjük a leírásban. A vektort gyógyászatilag vagy fiziológiailag elfogadható hordozóban szuszpendálva vagy feloldva készítjük elõ a beadásra, például izotóniás sóoldatban; vagy olyan másféle kiszerelésben, amely nyilvánvaló az ilyen beadásban járatos szakember számára. A megfelelõ hordozó nyilvánvaló a szakember számára, és nagymértékben a beadás útjától függ. A találmány szerinti készítményeket a fent ismertetett utakon adhatjuk be emlõsnek, fenntartott felszabadulású kiszerelésben biodegradábilis biokompatibilis polimer alkalmazásával, vagy helyszínre történõ bejuttatással micellák, gélek és liposzómák alkalmazásával. Adott esetben a találmány szerinti beindítási lépés magában foglalja adjuváns megfelelõ mennyiségének a beadását is a beindító készítménnyel együtt, amint azt a leírásban definiáljuk. Elõnyösen a megerõsítõ készítményt körülbelül 2 hét és körülbelül 27 hét közötti idõvel a beindító készítmény beadása után adjuk be az emlõs alanynak. A megerõsítõ készítmény beadását megerõsítõ készítmény hatásos mennyiségének az alkalmazásával érjük el, amely a beindító DNS-vakcinával megegyezõ antigént tartalmaz vagy annak bejuttatására képes. A megerõsítõ készítmény rekombináns virális vektorból állhat, amely azonos virális forrásból származik (például találmány szerinti adenovirális szekvenciák), vagy egy másik forrásból származik. Más megoldásképpen a megerõsítõ készítmény olyan készítmény lehet, amely a beindító DNS-vakcina által kódolt antigénnel megegyezõ antigént tartalmaz, de fehérje vagy peptid formájában, amely készítmény immunválaszt indukál a gazdában. Egy másik megvalósítási mód szerint a megerõsítõ készítmény az antigént kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz az expresszióját emlõssejtben irányító szabályozószekvencia irányítása alatt, például vektorokat, mint például jól ismert bakteriális vagy virális vektorokat. A megerõsítõ készítménnyel szemben az elsõdleges követelmény az, hogy a vakcinakészítményben lévõ antigén ugyanaz az antigén, vagy keresztreagáló antigén legyen, mint a beindító készítmény által kódolt antigén. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovirális vektorok jól alkalmaz- 18

19 1 HU T2 2 ható különféle más immunizációs és terápiás beadási rendekben történõ alkalmazásra. Ilyen beadási rendek magukban foglalhatják találmány szerinti adenovirális vektor egyidejû vagy egymást követõ beadását eltérõ szerotípusba tartozó kapszidú Ad vektorokkal, olyan beadási rendeket, amelyekben a találmány szerinti adenovirális vektorokat egyidejûleg vagy egymás után juttatjuk be nem Ad vektorokkal, olyan beadási rendeket, amelyekben a találmány szerinti adenovirális vektorokat egyidejûleg vagy egymás után juttatjuk be fehérjékkel, peptidekkel, és/vagy más biológiailag hasznos terápiás vagy immunogenikus vegyületekkel. Az ilyen alkalmazások nyilvánvalóak szakember számára. Ily módon a találmány tárgyát képezik immunogenikus készítmények különféle kezelési és vakcinázási beadási rendekben történõ alkalmazásra, amelyek a találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazzák. Egy megvalósítási mód szerint a módosított adenovírushexont bejuttathatjuk alanyba üres módosított adenovirális kapszid formájában (azaz a módosított adenovírushexont tartalmazó adenovíruskapszidban, amelybe nincs semmilyen minigén pakolva a célsejtre célzott bejuttatás céljából). Egy másik megvalósítási mód szerint az ezt a hexont a célsejtben expresszáló vektort alkalmazhatunk. Egy még másik megvalósítási mód szerint minigént hordozó módosított adenovirális részecskét juttatunk be alanynak. Ilyen módosított adenovirális részecske célzószekvenciát tartalmazhat a módosított kapszidjában. Azonban az ilyen módosított adenovirális részecske önbeindító immunogenikus készítmény alapját képezheti. Az ilyen önbeindító készítményt akkor állíthatunk elõ, amikor egy exogén aminosavszekvencia az adenovíruskapszidban immunogén, és a kapszidba szintén immunogént kódoló nukleinsavszekvencia van bepakolva. Amint ismertetjük a leírásban, a kapszidfehérje és a kapszidba pakolt molekulában található immunogén ugyanaz lehet, és ugyanazon vírus vagy organizmus elleni immunválaszt indukálhat. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti önbeindító adenovirális részecske a kapszidjában olyan immunogént tartalmazhat, amely nemspecifikus immunválaszt indukál és egy olyan második immunogén lehet bele pakolva, amely egy kiválasztott sejttípus, molekula vagy organizmus elleni specifikus vagy keresztreagáló immunválaszt indukál. Szabadalmi példák A következõ példák csak szemléltetõk, és nem tekinthetõk a találmányt a bemutatott megvalósítási módokra korlátozónak. A feltalálók demonstrálták, hogy életképes adenovírus mutánst lehet létrehozni, amely 25 aminosavméretû deléciót (ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK, 11. azonosító számú szekvencia) tartalmaz a hexonban [a Rux, és mtsai., (2003, fent idézve) által definiált HVR1]. A feltalálók továbbá demonstrálták, hogy kívánt peptidszekvenciát kódoló exogén DNS-szegmens (ebben a példában a EQELLELDKWASLW peptidszekvencia, 12. azonosító számú szekvencia amely megfelel a HIV burokfehérje egy HlV-semlegesítõ epitópját hordozó szakaszának) inszertálható be a deléció helyére. 1. példa: A HAdV 5 hexon inszerciós mutagenezise A hexon DNS-szekvenciájának idegen peptidet kódoló mutáltatására végrehajtott lépések a következõk voltak. Az HAdV 5 genom hexont kódoló régióját hordozó AscI fragmenst szubklónoztuk a pneb193 plazmidba (a New England Biolabs cégtõl vásárolva), létrehozva pnebasc¹t (lásd az 1. ábrát). PCR (polimeráz-láncreakció) mutagenezist hajtottunk végre a hexonon egy új SpeI hely létrehozására az inszerciós helyen. Az SpeI-hely létrehozására szolgáló PCR-mutagenezis részletei a következõk. Az 1. és 2. reakció PCR-templátja a pnebasc (a hexon régiót tartalmazó Ad5 AscI fragmens a pneb193 plazmidba klónozva). Az 1. és 2. reakciók termékeit kombináltuk és a 3. reakció templátjaként alkalmaztuk. A PCR-enzim a Tgo polimeráz volt. A ciklizálás mindhárom reakció esetében a következõ volt: mp., mp., mp., 40 alkalommal. Az 1. reakcióhoz az 5hex1 (GACCGCCGTTGTT- GTAACCC, 13. azonosító számú szekvencia) és az lt rev (GTTGTCATCGTCCACTAGTCCCTCTTCTTC- TAGGTTTATTTCAAG, 14. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 713 bp méretû fragmens amplifikálására. A 2. reakcióhoz az rt fwd (GGACTAGTGGAC- GATGACAACGAAGACGA, 15. azonosító számú szekvencia) és az rt rev (ATGGTTTCATTGGGG- TAGTC, 16. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 259 bp méretû fragmens amplifikálására. A 3. reakcióhoz az 1. reakcióból és a 2. reakcióból származó fragmenseket összefûztük az 5hex1 és az rt rev láncindítók alkalmazásával, ami egy 951 bp méretû terméket eredményezett. Az összefûzött 951 bp méretû terméket elhasítottuk BlpI-gyel; a kapott 518 bp méretû fragmenst alkalmaztuk a pnebasc natív BlpI fragmensének helyettesítésére, ami a pnebascspe¹et adta. Ez beinszertálja a GGACTAGTG¹t (a 15. azonosító számú szekvencia 1 9. nt¹jai) (ami a GLV aminosavakat kódolja), ami egy SpeI-helyet tartalmaz az EEE és DDD között (a 149. és 150. aminosav között) a hexon aminosavszekvenciájába. A kívánt peptidszekvenciát kódoló szintetikus DNSszekvenciákat inszertáltunk be az SpeI-helyre. Az eljárás részletei a következõk voltak. A CD4 top (CTAGGCTGCTACGGCGTGAGCGC- CACCAAGCTGGGG, 18. azonosító számú szekvencia) és CD4 bot (CTAGCCCCAGCTTGGTGGCGCT- CACGCCGTAGCAGC, 19. azonosító számú szekvencia) oligomerek anneálását követõen, a SARS koronavírus tüskefehérjéjébõl származó Balb/c egér CD4 epitópot inszertáltuk be a pnebascspe SpeI-helyére, ami a pne- BAscSpe-spikeCD4¹t adta. Ez GLGCYGVSATKLGLV¹t (20. azonosító számú szekvencia) rak be a hexon EEE és DDD közé (a 149. és 150. aminosav közé). 19

20 1 HU T2 2 A SARS koronavírus tüske fehérjéjébõl származó Balb/c egér CD8 epitóp beinszertálásához a CD8 top (CTAGGGACCAGCACCGGCAACTACAACTACAAG- TACCGCTACCTGCGCCACGGC AAGCTGCG- CCCCGGG, 21. azonosító számú szekvencia) és a CD8 bot (CTAGCCCGGGGCGCAGCTTGCCG- TGGCGCAGGTAGCGGTACTTGTAGTTGTAGT TGCCGGTGCTGGTCC, 22. azonosító számú szekvencia) oligomereket anneáltuk és inszeráltuk be a pnebascspe SpeI-helyére, ami a pnebascspe-spikecd8¹at adta. Ez a GLGTSTGNYNYKYRYLRH- GKLRPGLV (23. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciát rakja be a hexon EEE és DDD közé (a 149. és 150. aminosav közé). E1 és E3 deletált HAdV 5 vektor (psrad5egfp) natív hexont tartalmazó molekuláris klónját helyettesítettük az idegen szekvenciákat beinszertálva tartalmazó hexont tartalmazókkal, hogy a mutáltatott hexont tartalmazó új plazmid molekuláris klónokat (rendre ph5scd4 és ph5scd8) hozzunk létre. PCR- (polimeráz-láncreakció) mutagenezist hajtottunk végre a hexonon egy új BspEI-hely létrehozására az inszerciós helyen. A BspEI-hely létrehozására szolgáló PCR-mutagenezis részletei a következõk. A pnebasc (a hexonrégiót tartalmazó Ad5 AscI fragmens a pneb193 plazmidba klónozva) volt az 1. és 2. reakció PCR-templátja. Az 1. és 2. reakciók termékeit kombináltuk és a 3. reakció templátjaként alkalmaztuk. Phusion nagy pontosságú PCR-reagenskészletet vettünk a NEB cégtõl, és azt alkalmaztuk a gyártó utasításai szerint. A ciklizálás mindhárom reakció esetében a következõ volt: 98 5 mp., mp., mp., 25 alkalommal. Az 1. reakcióhoz az 5hex1 (GACCGCCG- GTTGTAACCC, 24. azonosító számú szekvencia) és a BspSOErev (CGTGAGTTCCGGAAGTAGCAGCTT- CATCCCATTCG, 25. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 678 bp méretû fragmens amplifikálására. A 2. reakcióhoz a BspSOEfwd (TGCTACTTCCGGAACTCACGTATTTGGG- CAGGCG, 26. azonosító számú szekvencia) és az 5hex4 (GGAAGAAGGTGGCGTAAAGG, 27. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 1379 bp méretû fragmens amplifikálására. A 3. reakcióhoz az 1. reakcióból és a 2. reakcióból származó fragmenseket összefûztük az 5hex1 és az 5hex4 láncindítók alkalmazásával, és a 2037 méretû terméket elhasítottuk RsrII+AvrII enzimekkel; a kapott the 1908 bp méretû fragmenst beligáltuk a pne- BAsc/RsrII+AvrII plazmidba, ami a pnebasebspei¹et adta. Ez deletálja az ALEINLEEEDDDNEDEVDE- QAEQQK¹t (11. azonosító számú szekvencia) kódoló 75 bp¹t, és beinszertálja a TCCGGA¹t (a 27. azonosító számú szekvencia nt¹i, ami SG¹t kódol), és egy BspEI-helyet visz be a hexon szekvenciájába. A kívánt peptidszekvenciát kódoló szintetikus DNSszekvenciákat inszertáltunk be az BspEI-helyre. Az eljárás részletei a következõk voltak. A HIV 2F5 epitóp régió pnebascbspe1¹be történõ beinszertálásához a 2F5 top (CCGGCGAGCAGGAGCTGCTGGAGCTG GACAAGTGGGCCAGCCTGTGGT, 28. azonosító számú szekvencia) és 2F5 bot (CCGGACCA- CAGGCTGGCCCACTTGTCCAGCTCCAG- CAGCTCCTGCTCG, 17. azonosító számú szekvencia) oligomereket anneáltuk, és beinszertáltuk a BspEIhelyre, ami a pnebasc 2F5 plazmidot eredményezte. Ez az ALEINLEEEDDDNBDEVDEQAEQQK (11. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciát rakja be a fent végrehajtott 25 aminosavnyi deléció helyére. E1 és E3 deletált HAdV 5 vektor (psrad5egfp) natív hexont tartalmazó molekuláris klónját helyettesítettük az idegen szekvenciákat beinszertálva tartalmazó hexont tartalmazókkal, hogy a mutáltatott hexont tartalmazó új plazmid molekuláris klónokat (rendre ph5hexbspei és ph5 2F5) hozzunk létre. Fertõzõ rekombináns HAdV 5 vektort hoztunk létre mutáltatott hexonnal a mutáltatott hexont tartalmazó új plazmid molekuláris klónoknak (PacI-gyel linearizálva) HEK 293-sejtekbe történõ transzfektálásával. Ez az új, módosított hexonfehérjét tartalmazó HAdV 5 vektor különféle alkalmazásokra alkalmazható, amint ismertetjük a leírásban. Míg a találmányt egy különösen elõnyös megvalósítási módra történõ hivatkozással írtuk le, nyilvánvaló, hogy végrehajthatók módosítások a mellékelt igénypontok oltalmi körén belül. A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása: 6. azonosító számú szekvenciához: <223> bármilyen aminosav lehet <223> bármilyen aminosav lehet 13. azonosító számú szekvenciához: <223> 5hex1 láncindító 14. azonosító számú szekvenciához: <223> lt rev láncindító 15. azonosító számú szekvenciához: <223> rt forward láncindító 16. azonosító számú szekvenciához: <223> rt rev láncindító 17. azonosító számú szekvenciához: <223> 2F5 bot oligomer 18. azonosító számú szekvenciához: <223> CD4 top oligomer 19. azonosító számú szekvenciához: <223> CD4 bot oligomer 21. azonosító számú szekvenciához: <223> CD8 top oligomer 22. azonosító számú szekvenciához: <223> CD8 bot oligomer 24. azonosító számú szekvenciához: <223> 5hex1 láncindító 25. azonosító számú szekvenciához: <223> BspSOErev láncindító 26. azonosító számú szekvenciához: <223> BspSOEfwd láncindító 27. azonosító számú szekvenciához: <223> 5hex4 láncindító 28. azonosító számú szekvenciához: <223> 2F5 top oligomer 20