FEHÉRJESZINTÉZIS: a transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa. Gergely Pál 2009

Átírás

1 FEHÉRJESZINTÉZIS: a transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa Gergely Pál 2009

2 Fehérjeszintézis és poszttranszlációs módosítások A kódszótár A riboszóma szerkezete A fehérjeszintézis (transzláció) lépései i. Iniciáció ii. Peptidkötés képződése; peptidil-transzferáz iii. Elongáció és termináció A fehérjeszintézis gátlószerei Antibiotikumok Az interferon antivirális hatása 2-5 A szintáz indukciója eif-2 kináz indukciója Poszttranszlációs módosítások A fehérjék irányítása (targeting)

3 A kódszótár 64 kodont (nukleotidhármast) tartalmaz (A, G, C, U) 4 3 = 64 A nukleotidok és az aminosavak 1:1 megfelelése esetén az mrns csak 4 aminosavat kódolhatna, míg 2:1 esetében 4 2 =16 aminosavat. Ez utóbbi sem elégséges a fehérjékben előforduló 20-féle aminosav beépítésére. A nukleotidhármast tartalmazó genetikai kód, amikor az mrns-ben lévő 4 különböző bázis mindegyike a kodonban 3 lehetséges helyen fordulhat elő pedig 4 3 =64 különböző kodont alakít ki. a fehérjeszintézis során mindegyik kodonnak van jelentése 19 aminosavat 60 kodon határoz meg AUG (metionin) a startkodon - a láncközi metionint is ez jelöli 3 stopkodon (nonsense kodon): UAA, UAG, UGA

4 A kódszótár UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Phe Leu Leu Val Ile Met Ser Pro Thr Ala Tyr Stop His Gln Asn Lys Asp Glu Cys Arg Ser Arg Gly Stop Trp

5 A kódszótár 64 kodont (nukleotidhármast) tartalmaz (A, G, C, U) 4 3 = 64 a fehérjeszintézis során mindegyik kodonnak van jelentése 19 aminosav (60 kodon) 3 stopkodon (nonsense kodon): UAA, UAG, UGA AUG (metionin) a startkodon (a láncközi metionint is ez jelöli) A Met és a Trp kivételével a többi aminosavat egynél több kodon határoz meg: a genetikai kód degenerált 5 aminosavat már az első két nukleotid meghatároz 3 aminosavnak (Arg, Leu és Ser) hat kodonja van

6 UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Phe Leu Leu Val Ile Met Ser Pro Thr Ala Tyr Stop His Gln Asn Lys Asp Glu Cys Arg Ser Arg Gly Stop Trp A kódszótár

7 A genetikai kód univerzális, néhány kivétel azonban ismert: az E. coliban az UGA szelenociszteint is kódol. A mitokondrium kódszótára is különbözik csekély mértékben.

8 Transzfer RNS: trns A trns az adapter szerepét látja el a fehérjeszintézisben: három jellegzetes hurok antikodon (7 nukleotidból áll) D-hurok (dihidrouridint tartalmaz) T-hurok (timidinpszeudouridin-citidin szekvencia) CCA-3 véghez kapcsolódik a szállított aminosav dihidrouridin: D pszeudouridin: Ψ

9 A trns szerkezete

10 Kodon antikodon kölcsönhatás

11 Kodon antikodon kölcsönhatás a kodon-antikodon kapcsolat komplementer a kodon 3. helyén lévő bázisa és az antikodon 1. helyén lévő bázisa közötti kapcsolat nem olyan szigorú: lötyögős ezért az adott trns több kodont is felismerhet (nem kell 61 trns) lötyögési szabályok C = G vagy I (inozin) A = U vagy I G = C vagy U U = A, G vagy I 3 trns Met 5 U A C A U G 5 mrns 3 trns Leu 3 5 egy trns Leu két leucin kodont is felismer G A U lötyögős bázis C U A 5 mrns G 3

12 Lötyögő bázispárok Inozin = Citidin Inozin = Adenozin Inozin = Uridin Guanozin = Uridin

13 A lötyögési szabályok figyelembevételével legalább 31 trns szükséges a 61 kodon felismeréséhez, ennek ellenére kb. 50 trns található a sejtek fehérjeszintetizáló készletében.

14 Az aminosavak aktiválása: aminoacil-trns-szintetázok aminoacil-trns-szintetázok kapcsolják az aminosavakat a trns molekulákhoz az mrns 20 különböző aminosavat kódolhat mindegyik aminosavnak specifikus aminoacil-trns-szintetáza van egyféle aminosavnak több adapter trns molekulája is lehet azonos aminosavat kódoló trns molekulákhoz ugyanaz a specifikus aminoacil-trns-szintetáz kapcsolja az aminosavat mindegyik aminoacil-trns-szintetázhoz kapcsolódik: a megfelelő aminosav ATP a megfelelő trns molekula vagy molekulák

15 R O aminosav trns ATP - = H 2 N-C-C-OH H - 3 R O adenilált (aktivált) aminosav PPi - = H 2 N-C-C-O-P-O-ribóz-adenin H - Aminosavak aktiválása: a trns feltöltése AMP R O H 2 N-C-C-O H - = - aminosav- trns (feltöltött trns)

16 ATP AMP Aminosavak aktiválása: a trns feltöltése Az aminoacil-trns-szintetázok a legnagyobb specificitású enzimek közé tartoznak. Ha téves aminosavat aktiválnak, akkor hidrolizálják a hibás kötést (második szubsztrát felismerő hely). Hatékonyság: kb. 1 hiba/10 4 aminosav. Példák az elnevezésre: fmet-trns fmet formil-metionil-trns fmet Ala-tRNS Ala alanil-trns Ala

17 Hírvivő RNS: mrns 5 sapka m 7 Gppp 5 -nemkódoló régió startkodon AUG kódoló régió 3 -nemkódoló régió UGA stopkodon AAUAAA (AAAA) n 3 poli(a) farok

18 Olvasási keret az AUG kodon jelzi az mrns-en a polipeptidlánc szintézisének startpontját. az olvasási keret a startkodon első nukleotidjától a stopkodonig tart....agagcgga.aug.gca.gag.ugg.cua.agc.aug.ucg.uga.ucgaauaaa... MET.ALA.GLU.TRP.LEU.SER.MET.SER frameshift - kereteltolódással járó mutáció (példánkban deléció)...agagcgga.aug.gca.ga.ugg.cua.agc.aug.ucg.uga.ucgaauaaa... az új olvasási keret hibás aminosavsorrendet eredményez...agagcgga.aug.gca.gau.ggc.uaa.gcaugucgugaucgaauaaa... MET.ALA.ASP.GLY stopkodon

19 A transzlációt befolyásoló mutációk hemoglobin Wayne (a 3 -terminális vég frameshift mutációja) Normális α-globin.acg.ucu.aaa.uac.cgu.uaa.gcu GGA GCC UCG GUA.THR.SER.LYS.TYR.ARG A kékkel jelölt U bázis deléciója miatt: stopkodon Wayne α-globin.acg.uca.aau.acc.guu.aag.cug.gag.ccu.cgg.uag.thr.ser.asn.thr.val.lys.leu.glu.pro.arg mutált régió stopkodon missense mutáció (pl. AGC Ser módosul AGA Arg) nonsense mutáció (pl. UGG Trp módosul UGA Stop) sense (továbbolvasó) mutáció (pl. UAA Stop módosul CAA Gln-ra a hemoglobin Constant Spring formában) néma mutációk (pl. CUA Leu változik CUG Leu) a transzlációt nem befolyásolják

20 A riboszómák: egy kisebb és egy nagyobb alegységből álló ribonukleoprotein részecskék prokarióta riboszóma 50S alegység 23S rrns 5S rrns 35 különböző fehérje 70S riboszóma 30S alegység 16S rrns 21 különböző fehérje eukarióta riboszóma 60S alegység 28S rrns 5S rrns 5.8S rrns 49 különböző fehérje 80S riboszóma 40S alegység 18S rrns 33 különböző fehérje

21 Poliszómák a transzláció 5 3 irányban folyik az mrns molekulán az aminosavmaradékok az N-terminálissal kezdődően épülnek be nagy riboszóma alegység szintetizálódó peptidlánc N N 5 AUG UGA A poliszómát az mrns-sel összefűzött riboszómák alkotják. kis riboszóma alegység az alegységek disszociálnak

22 A fehérjeszintézis iniciációja A startkodon (AUG) megtalálása: prokariótákban a Shine-Dalgarno szekvencia segítségével eukariótákban az első AUG felismerése (scanning) Riboszómák Kis alegység Nagy alegység Teljes méret prokarióták 30S 50S 70S 21 fehérje 35 fehérje 16S RNS 23S és 5S RNS eukarióták 40S 60S 80S (citoszol) 33 fehérje 18S RNS 49 fehérje 28S, 5.8S és 5S RNS

23 Iniciáció prokariótákban és eukariótákban a prokarióta mrns egyik belső AUG kodonjánál következik be az iniciáció az E. coli lac operonját egyetlen policisztronos mrns kódolja több iniciációs AUG kodonnal lac I P O lac Z lac Y lac A AUG AUG AUG AUG 5 SD AUG AUG SD AUG iniciációs kodon Shine-Dalgarno szekvenciával belső Met kodon Shine-Dalgarno szekvencia nélkül iniciációs kodon Shine-Dalgarno szekvenciával az iniciáció az első AUG kodonnál történik az eukariótákban 5 -sapka AUG AUG Az iniciációs első AUG az 5 -sapka után, downstream található A belső (downstream) Met kodonok nem lehetnek iniciációs helyek

24 Iniciáció prokariótákban A szintézis az N-terminális N-formil-metionin (fmet) beépítésével kezdődik. Az mrns olvasása 5 3 irányban. Iniciáció: IF-3 megakadályozza a két alegység idő előtti asszociációját IF-1 az A-helyet blokkolja IF-2 GTP komplex és az fmet-trns fmet kapcsolódik A kezdő AUG azonosítása a Shine-Dalgarno szekvenciával: az mrns-ben a kezdő AUG előtt kb. 10 nukleotidból álló purin-gazdag szekvencia van, amely bázispárokat alakít ki a riboszóma 16S rrns pirimidin-gazdag szekvenciájával A- és P-helyeket mindkét alegység meghatározza, az E hely teljesen az 50S alegységen van. Az első fmet-trns fmet kapcsolódását a kodon:antikodon (mrns) és a Shine-Dalgarno szekvencia (rrns) együttesen határozza meg.

25 Elongáció a prokariótákban Does not use ATP proofreading AA 2 Minden aminosav beépítéséhez 4 nagy energiájú kötés (122 kj/mol) fordítódik. A peptidkötés energiája csupán 21 kj/mol.

26 Termináció Prokariótákban három terminációs faktor van: RF 1 felismeri az UAG és UAA stopkodonokat. RF 2 felismeri az UGA és UAA stopkodonokat RF 3 a riboszóma szétesését segíti elő Eukariótákban egyetlen terminációs faktor (release factor: erf) van.

27

28 Eukarióta Prokarióta

29 A riboszóma szerkezete P-hely: peptidlánc-trns kötődése P P P PP P PP A Nagy alegység A-hely: aminoacil-trns kötődése 5 mrns Kis alegység A riboszóma két alegysége a kötött mrns és trns molekulákkal

30 A fehérjeszintézis iniciációja eukariótákban: az mrns kötődése eif-2 Met A trns met kötődik a kis alegységhez az eukarióta iniciációs faktor-2 (eif-2) segítségével 40S alegység A kis alegység a mrns 5 -sapka régiója utáni első AUG kodont felismeri (scanning) 5 -sapka AUG mrns

31 eif-2a A fehérjeszintézis iniciációja eukariótákban: részletek GTP Met GTP eif-2a Met Az eukarióta iniciációs faktor- 2a (eif-2a), a GTP és az inciátor Met-tRNS hármas komplexet alkot. eif-3 40S alegység Az eukarióta iniciációs faktor-3 (eif-3) gátolja a 40S és a 60S alegységek asszociációját: anti-asszociációs faktor. Az eukarióta iniciációs faktor-4 (eif-4a. 4f) megszünteti az mrns másodlagos szerkezetét és az mrns-t korrekt pozicióban a 40S alegységre helyezi: scanning folyamat az ATP energiájának felhasználásával. 5 -sapka AUG mrns

32 az AUG iniciációs kodon felismerése GTP hidrolizál GDP-vé eif-2a-gdp disszociál a komplexről (és több más molekula is ) a nagy riboszóma alegység kötődik 60S alegység eif-2a GDP M 5 AUG mrns 40S alegység

33 M A 5 AUG GCC mrns aminoacil-trns kötődik az A-helyhez M A létrejön az első peptidkötés 5 AUG GCC mrns az iniciáció befejeződik

34 A peptidkötés kialkulása P-hely NH 2 CH 3 -S-CH 2 -CH 2 -CH O=CC O A-hely NH 2 CH 3 -CH O=C O a peptidkötés kialakulását a peptidil-transzferáz katalizálja trns trns a peptidil-transzferáz aktivitás a prokarióta nagy alegység 23S rrns részén, ill. az eukarióta 28S rrns részén lokalizálható a peptidkötéshez szükséges energiát a trns feltöltésével az ATP szolgáltatja képződött peptid a P-helyről átkerül az A-helyre; az üres trns disszociál a P-helyről NH 2 CH 3 -S-CH 2 -CH 2 -CH O=C NH CH 3 -CH O=C OH O trns trns

35 Nagy riboszóma alegység 23S rrns (narancs és fehér) alkotja a peptidil-transzferáz egységet Adenin-2451 vesz részt a sav-bázis katalízisben Cech (2000) Science 289: Ban et al. (2000) Science 289: Nissen et al. (2000) Science 289:

36 Elongáció P PP P P a peptidkötés kialakulása után a szabad trns disszociál a P-helyről UCA GCA GGG UAG EF-1 a riboszóma egy kodonnal továbbcsúszik az mrns-en, a peptid-trns átkerül az A-helyről a P-helyre; a transzlokációt az elongációs faktor EF-2 biztosítja EF-2 P P P P P A a következő aminoacil-trns kötődik az A-helyhez; ehhez szükséges az EF-1 elongációs faktor UCA GCA GGG UAG az elongációhoz szükséges energiát két GTP hidrolízise szolgáltatja: egyik a transzlokációt, másik az aminoacil-trns kötődését biztosítja.

37 Elongáció: részletek Három ismétlődő lépésből áll: 1. Az aminoacil-trns kötődik az A-helyhez, illeszkedve a kodonnak megfelelő pozícióba: - a folyamat GTP-t igényel (az EF-1α GTP-kötő fehérje) - a bekötés során a GTP hidrolizál, de a GDP kötve marad az EF-1 molekulán (EF-1α-GDP) - másik elongációs faktor (EF-1βγ) cseréli le a kötött GDP-t GTP-re (a GDP disszociációját elősegítő ún. exchange fehérje) 2. A P-helyen kötött peptidil-trns és az A-helyen kötött aminoaciltrns között létrejön a peptidkötés: - peptidil-transzferáz katalizálja - külön energiát nem igényel (ez már megtörtént a trns feltöltése során) 3. Transzlokáció: a riboszóma elgördül az mrns-en. - az üres trns legördül a P-helyről - az A-helyen megjelenik az új kodon - a folyamat GTP energiát igényel (EF-2-GTP EF-2-GDP)

38 Termináció RF P P P P P UCA GCA GGG UAG amikor a transzláció stopkodonhoz ér a terminációs (release) faktor (RF) felismeri a stopkodont és kötődik az A-helyhez P P P P P P P P UCA GCA GGG UAG az RF katalizálja az elkészült polipeptidlánc hidrolízisét a hordozó trns-ről; a riboszóma disszociál

39 Fehérjeszintézis a mitokondriumokban Eltér az eukarióta sejt citoszoljában lévő transzlációs berendezéstől és a prokarióta riboszómára emlékezetet. A transzláció a mitokondrium matrixban történik. A mitokondriális DNS 2 rrns-gént 22 trns-gént és 13 fehérjét kódol. A többi mitokondriális fehérjét a nukleáris DNS kódolja. Csak 22 trns van, több a kodon-antikodon lötyögés. Négy eltérés is van az univerzális genetikai kódszótárban, pl. az UGA stopkodon a mitokondriumban triptofánt jelent. Az arginin két kodonja (AGA és AGG) viszont a mitokondriumban stopkodonként szolgál. A mitokondriális mrns-nek nincs 5 -sapkája, de van 3 -poli-a-farok régiója.

40 Antibiotikumok és toxinok gátolják a transzlációt (fehérjeszintézist) A fehérjeszintézis mechanizmusában részt vevő komponensek működésének a gátlása az egyik igen gyakran használt fegyver a kórokozó baktériumok ellen. A módszer alapja, hogy a prokarióták és eukarióták ribiszómái és transzlációs faktorai (fehérjéi) különböznek egymástól és így bizonyos vegyületek gátolják a fertőzést okozó baktériumok transzlációját és ezzel szaporodásukat (bakteriosztatikus hatásúak), míg a gazdaszervezet sejtjeiben a fehérjeszintézist nem károsítják. Az antiobiotikumok bizonyos gombák által termelt vegyületek, illetve ezek szintetikus származékai.

41 A puromicin gátlása A puromicin kémiai szerkezete emlékeztet az aminosavat hordozó trns 3 -végére, ezért be tud kötni az A-helyre. Ezután a puromicin aminocsoportja hozzákötődik a P-helyen lévő peptidil-trns utolsó aminosavának karboxilcsoportjához. További akceptor helyet azonban a puromicin nem tartalmaz (a peptidkötések tovább nem jöhetnek létre), ezért a puromicinre végződő peptid disszociál a riboszómáról, korai láncterminációt okoz. A puromicin gátolja mind az eukarióták, mind a prokarióták transzlációját.

42 A tetraciklinek a prokarióta riboszóma kis alegységéhez kötődve az aminoacil-trns-ek bekötődését gátolják A klóramfenikol gátolja a prokarióta riboszóma nagy alegységének peptidil-transzferáz aktivitását A sztreptomicin gátolja az iniciációt és az mrns téves leolvasását okozza a prokariótákban A cikloheximid csak az eukariótákban gátolja a peptidil-trns transzferét a riboszóma nagy alegységén A diftéria exotoxin az eukarióta EF-2 ADPribozilációja révén inaktiválja a sejt fehérjeszintézisét A ricin inaktiválja a 60S eukarióta riboszóma alegységét

43 A fehérjeszintézis néhány gátlószere Antibiotikum Gátolt folyamat A gátlás helye Kaszugamicin iniciátor trns kötése 30S riboszóma Sztreptomicin iniciáció, elongáció 30S riboszóma Tetraciklin aminoacil-trns kötése A-hely Eritromicin peptidil-transzferáz 50S riboszóma Linkomicin peptidil-transzferáz 50S riboszóma Klindamicin peptidil-transzferáz 50S riboszóma Kloramfenikol peptidil-transzferáz 50S riboszóma Staphylococcus eritromicin rezisztenciája néhány Staphylococcus törzs plazmidja RNS-metiláz gént is tartalmaz a gén terméke az RNS-metiláz enzim átalakítja a 23S rrns egyik adenozin maradékát N 6 -dimetil-adenozinná pl. eritromicin (linkomicin vagy klindamicin) esetén ez az adenozin a gátlás helye az N 6 -dimetil-adenozin gátolja ezen antibiotikumok hatását azok a törzsek, amelyek pl. eritromicint termelnek saját RNS-metilázzal rendelkeznek, ezért rezisztensek a termelt antibiotikummal szemben

44 Az interferon hatása A sejt interferont termel a vírus RNS hatására vírus A sejt fertőződik a vírussal A sejt önmagát nem védi meg a vírus szaporodik Az interferon a környező sejtek receptoraihoz kötődve aktiválja azokat Ezek a sejtek antivirális fehérjéket szintetizálnak, A sejt elpusztul és a környező sejtekbe jut amely védelmet nyújt a vírus ellen

45 Antivirális fehérjék hatása inaktív endonukleáz ATP kettősszálú dsrns 2-5 A szintáz oligo 2-5 -adenilát (2-5 A) [-A-2 -p-5 -A-2 -p-5 A-] N az interferon elősegíti aktív endonukleáz: pl. a vírus mrns-t elbontja eif-2 aktív P eif-2 kináz eif-2 dsrns inaktív a fehérjeszintézis gátlódik pl. retikulocitákban a globin és hem szintézisének koordinációja

46 A transzláció utáni (poszttranszlációs) módosulások N-terminális és C-terminális módosulások a lánckezdő Met eltávolítása az eukarióta fehérjék 50%-a N-acetilált A szignálpeptid eltávolítása Aminosav-oldalláncok módosítása pl. Ser, Thr vagy Tyr oldalláncok foszforilációja, γ-karboxiglutamát kialakulása, Lys-oldallánc metilációja Diszulfid-hidak kialakulása Szénhidrát láncok hozzáadása Izoprenil- vagy más acilcsoportok kapcsolódása Prosztetikus csoportok hozzáadása Limitált proteolízis

47 A fehérjék sejtorganellumba irányítása: szekréció 3. Az SRP kapcsolódik az SRP-receptorhoz az ER membrán citoszol felőli oldalán, a szignálpeptidet egy pórushoz irányítja 2. A szignál felismerő részecske a (SRP) kötődik a szignálpeptidhez b : a transzláció szünetel SRP SRP-receptor ER lumen c citoszol 5 AUG 1. A transzláció a citoszolban indul A riboszómák kötődése a durva endoplazmás retikulum membránjához a szignál felismerő részecske (signal recognition particle:srp) fehérjéből és RNS-ből áll; kötődik a szignálpeptidhez, a riboszómához és az ER membrán SRP-receptorához b szignálpeptid kb aminsavból áll a fehérje N-terminális részén (nem mindig) és elsősorban hidrofób, apoláris aminosavakból áll c ER = durva endoplazmás retikulum (riboszómákat tartalmaz kötött formában)

48 4. A transzláció szünetel, a polipeptid az ER lumenjéhez kerül 5. A szignál-peptidáz, amelyik az ER lumenjében van, lehasítja a szignálpeptidet citoszol ER lumen szignál-peptidáz 5 6. AZ SRP felszabadul, újabb ciklusban vehet részt 7. A riboszóma kapcsolódik az ER membránhoz; a durva endoplazmás retikulumon poliszóma alakul ki

49 8. A transzláció folytatódik: a polipeptid az ER lumenjébe kerül 9. A transzláció befejeződik, a kész fehérje az ER-en belül tovább módosul a szekréció előtt ER lumen A kész fehérje módosítások után szekretálódik citoszol 5 UGA

50 Példák szekretált fehérjékre: polipeptid hormonok (pl. inzulin) albumin kollagén immunoglobulinok Az integráns membránfehérjék is hasonló mechanizmussal szintetizálódnak: részlegesen szekretált fehérjéknek tekinthetőek Példák integráns membránfehérjékre: polipeptid hormonreceptorok (pl. az inzulinreceptor) transzport fehérjék ioncsatornák citoszkeletont horgonyzó fehérjék (pl. band-3) Ajánlott irodalom Orvosi biokémia (Ádám Veronika szerk.) 2. kiadás, 2002, pp