Érzékenység vs dwell time

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Érzékenység vs dwell time"

Dezső Kocsis
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 Érzékenység vs dwell time analyte peak area [cps] dwell time [ms] 25ms dwell time alatt számottevő a csökkenés (API 2000 LC/MS/MS system) 100 peszticid per injection

000 0 0 20 40 60 80 100 dwell time [ms] 25ms dwell time

2 Gyors MRM figyelés 50ms dwell time 2ms dwell time Nincs csökkenés 200 MRM csatorna figyelése esetén sem? MRM 200 MRM

3 Maximális érzékenység Átlagos csúcsszélesség A csúcs jellemzéséhez 8-10 mintavételi pont szükséges 4,0e4 3,5e4 4,0e4 3,0e4 3,5e4 2,5e4 3,0e4 2,0e4 2,5e4 1,5e4 2,0e4 1,0e4 5000,0 0,0 24 sec 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 Time, min 1,5e4 1,0e4 5000,0 0,0 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 Time, min egy 24 sec széles csúcs 9 pontos jellemzéséhez szükséges minimális pásztázási idő 2,667 sec. a pásztázási sebesség állításának lehetőségei: dwell time (msec) pause time (msec)

1,5e4 1,0e4 5000,0 0,0 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 Time, min egy 24 sec széles csúcs 9 pontos jellemzéséhez

4 Maximális érzékenység Pause time fixed at 5 msec Dwell time [msec] Total scan time incl. Pause [sec/scan] No. of data points (for 24 sec peak width) D w e m e o r a m a s s r a n s o n Dwell time for all 316 mass transition x e d a 6 m s e c fixed at msec Total scan Pause time incl. No. of data points time Pause (considering 24 [msec] [sec/scan] sec peak width) Con centr ation: N/A Cal culat ed Con c: 0.00 ng /ml Int ensity,cps 5. 1e4 5. 0e4 4. 9e4 4. 8e4 4. 7e4 4. 6e4 4. 5e4 4. 4e4 4. 3e4 4. 2e4 4. 1e4 4. 0e4 3. 9e4 3. 8e4 3. 7e4 3. 6e4 3. 5e4 3. 4e4 3. 3e4 3. 2e4 3. 1e4 3. 0e4 2. 9e4 2. 8e4 2. 7e4 2. 6e4 2. 5e4 2. 4e4 2. 3e4 2. 2e4 2. 1e4 2. 0e4 1. 9e4 1. 8e4 1. 7e4 1. 6e4 1. 5e4 1. 4e4 1. 3e4 1. 2e4 1. 1e4 1. 0e Dwell times 1 msec msec msec msec msec S/N ratio msec Time, min Time,min Time,min Time,min Time, min Ti me,min T ime, min T ime, min 8 10 msec S/N optimum 158 komponensre: dwell time: 6 msec pause time: 4msec msec

of data points time Pause (considering 24 [msec] [sec/scan] sec peak width) 5 3 4 7 6 3.476 7 4 3.16 7 3 2 8 4 4 2.844 8 2 2 5 2 8 2.528 9 1 2 2 1 2 2.

5 A LINAC cella teljesítőképessége XIC of +MRM (297 pairs): 226.2/170.0 amu from Sample 1 (MRMs 100) of Data MRM pesticides_02.wiff (Turbo Spray) Max. 1.1e6 cps. 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5 6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5 2.50e5 2.00e5 1.50e5 1.00e5 5.00e gyógyszermetabolit egyidejű vizsgálata Time, min

50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5 6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5 2.50e5 2.

6 Információfüggő vizsgálat Information Dependent Analysis (IDA) Felhasználása: minden olyan LC-MS mérésnél, ahol előre nem ismert komponensekről kell MSMS felvételeket készíteni, illetve limitált mennyiségű minta áll rendelkezésre (fehérjeazonosítás, metabolitvizsgálatok stb.)

komponensekről kell MSMS felvételeket készíteni, illetve limitált

7 Információfüggő vizsgálat (IDA)

8 Multi-target target screening

9 Multi-target target screening

10 Kizárás (dynamic exclusion) Paracetamol Codeine Nicotine Caffeine Dibenzepin Propranolol

11 Kizárás A Paracetamol kizárása szükséges a Propranolol csúcs azonosításához

12 Screening módszerek előnyei 300 komponens MRM technikán alapuló mennyiségi meghatározása a LINAC segítségével lehetséges A konfirmáció EPI spektrumok és spektrumkönyvtár alkalmazásával megoldható A konfirmáció a quantifier/qualifier csúcsok arányával is megoldható

konfirmáció EPI spektrumok és spektrumkönyvtár alkalmazásával

13 Screening módszerek korlátai Az alacsonyabb dwell timenak (5ms) köszönhetően kisebb érzékenység (LOD) Hosszú ciklusidő (max 4s) következtében kevesebb pont nyerhető Kevesebb adatpont következtében Kisebb a reprodukálhatóság (CV %) Kisebb a pontosság (%) Csúcsalakok nem szépek Kisebb szelektivitású oszlop, szélesebb csúcs, kisebb érzékenység

Kevesebb adatpont következtében Kisebb a reprodukálhatóság (CV %) Kisebb a pontosság

14 Összehasonlítás 24 MRM Colour Data points Area Green Blue Red MRM 300 MRM + EPI

15 Oszlop szerepe XIC of +MRM (297 pairs): Exp 1, 85.0/58.0 amu from Sample 1 (Mix 100) of Data Pesticide MTS_01.wiff (Turbo Spray) Max cps. I n t e n s i t y, c p s 2.4e6 2.2e6 2.0e6 Aqua: szélesebb csúcsok 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e Time, min XIC of +MRM (297 pairs): Exp 1, 85.0/58.0 amu from Sample 1 (Mix 100) of Data Pesticide MTS Fusion_01.wiff (Turbo Spray) Max cps. I n t e n s i t y, c p s 3.0e6 2.5e6 2.0e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 Fusion: nagyobb érzékenység Time, min

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Time, min XIC of +MRM (297 pairs): Exp 1, 85.0/58.

16 Mindenre egyformán alkalmas módszer nem létezik!

17 Orvosi diagnosztika Megoldandó feladatok: Módszerek átvétele Új módszerek kifejlesztése Szűrés A vizsgálat menete: Metanolos extrakció Beszárítás Észterképzés Beszárítás Feloldás

18 Mintaelőkészítés 1. Vérminta szűrőpapíron (kb 6 µl) 2. Hozzáadunk 100µL izotópjelzett belső standardot tartalmazó metanolt percig állni hagyjuk 4. A metanolt lepipettázzuk, majd N 2 áramban beszárítjuk 5. BuOH/HCl-t adunk hozzá majd 65 C-on 20 percig tartjuk 6. N 2 áramban szárazra pároljuk (~ 40 C) 7. Az eluensben felvesszük (100µL ACN/H 2 O 50: % HCOOH) µl-t injektálunk folyadékáramba 9. Elválasztás nélküli direkt vizsgálat 10.Flow Injection Analysis (FIA) TurboIonSpray forrással 11.Tipikus IS koncentrációk: ~ 60 fmol/µl C8-carnitine ~ 100 fmol/µl D5 phenylalanine

N 2 áramban szárazra pároljuk (~ 40 C) 7. Az eluensben felvesszük (100µL ACN/H 2 O 50:50 0.02% HCOOH) 8. 10 µl-t injektálunk folyadékáramba 9.

19 MS vizsgálati módok Prekurzor ion scan - acilcarnitinek Semlegesvesztéses scan aminosavprofil

20 Acilkarnitinek R Acilkarnitinek butilvesztése: H 3 C CH 3 N CH 2 O CH H CH O C O CH 2 CH R = H carnitine CH 2 CH 3 R = acyl acylcarnitine CH 3 H H 2 C CH CH COOH + N(CH 3 ) 3 + ROH + C 4 H 8 Precursor Ion Scan of 85amu

21 Aminosavak Aminosavak butilvesztési reakciója: H H N R C O C O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 R = aminosav oldallánc H H H H N C R H + O H C O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 Neutral Loss Scan of 102amu

22 Kibővített vizsgálati módszer Acilkarnitin profil Precursors (Parents) of 85 Da Aminosav profil Neutral Loss of 102 Da Bázikus aminosav profil Neutral Loss of 119 Da MRM (5 masses): 189 Da(Orn) -232 Da(Cit) -246 Da {homocit} Arginin profil Neutral Loss of 161 Da MRM (2 masses): 231 Da(Arg), 237 Da (C 13 D 5 -Arg)

23 Aminosav profil +Neutral Loss (102): 7.74 min (8 scans) from juhar Pro 4.04e4 cps Leu, OH-Pro Normal amino acid profile Intensity, cps Ala Ser Val Thr Met His Phe Tyr Glu m/z, amu +Neutral Loss (102): 1.10 min (8 scans) from juhar 4e5 3e5 Leu/OH-Pro Maple Syrup Urine Disease profile 4.71e5 cps Intensity, cps 2e5 Val 1e5 Ala Ser Pro His Phe Tyr Glu m/z, amu

24 Aminosav profil 100 Phe Pro INTERNAL STANDARDS % Intensity 50 Ala Phe Leu+Ile Gly Gly Ala Ser Gln Val Val Leu Met Cit Tyr Tyr Asp Glu Glu m/z, amu

25 Fenilketonúria (PKU) +Neutral Loss (102): Expt. 2, 0.50 min (16 scans) from P h e n y l a l a n i n phenylalanine e5 cps 1.5e5 1.0e5 5.0e4 D 5 -phenylalanine d 5 - P h e n y l a l a n i n m/z, amu +Neutral Loss (102): Expt. 2, 0.42 min (13 scans) from e4 cps 1.5e5 1.0e5 5.0e m/z, amu

26 Közepes szénláncú AcCoA Dehidrogenáz hiány +Precursor (85): Expt. 1, 0.53 min (16 scans) from Octanoylcarnitin MCAD-Patient C 8 -carnitine 2.39e4 cps Intensity, cps d3-C m/z, amu +Precursor (85): Expt. 1, 0.53 min (16 scans) from e4 cps Intensity, cps Normal m/z, amu

27 Szűrhető betegségek Fenilketonúria ésegyéb hiperfenilalaninémiák Tirozinémiák Jávorfaszörp betegség (MSUD) Izovaleriánsavacidémia (IVA) Propionsavacidémia Metilmalonsavacidémia Glutársavacidúria I., II. Karnitintranszporter defekt Karnitinpalmitoli transzferáz I hiány Nonketotikus Hyperglicinémia Homocisztinúria (CBS deficiency) Rövid szénláncú AcCoADehidr. hiány(scad) 3 metilkrotonilglicinémia Közepesszénláncú AcCoA Dehidr. hiány(mcad) Hosszúszénláncú AcCoA Dehidr. hiány(lcad) Citrullinémia Hisztidinémia 3 hidroxi 3 metilglutaril CoAliáz hiány Béta ketotioláz hiány TöbbszörösAcCoAhiány Hipervalinémia Hiperornitinémia

28 Immunoszuppresszánsok H 3 C (CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 3 O HO CH 3 O H 3 C N N N H N N CH 3 O CH(CH 3 ) 2 CH 3 O R O (H 3 C) 2 CHCH 2 CH2 CH(CH 3 ) 2 O CH 3 O O N CH 3 H 3 C N N H H N N H N CH 2 CH(CH 3 ) 2 O CH 3 O CH 3 O Cyclosporin A CH(CH 3 ) 2 Mol. Wt Exact Wt

29 Normál Q1 MS 4.0e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 M+H M+NH M+Na M+K m/z, amu

30 Mennyiségi értékelés

31 Mennyiségi értékelés

32 Mennyiségi értékelés r=0.9992

33 A módszer összehasonlítása CSA concentration by FPIA (ng/ml) y= *x r 2 = CSA concentration by LC-MS (ng/ml)

34 A módszer összehasonlítása CSA concentration by EMIT (ng/ml) y= *x r 2 = CSA concentration by LC-MS (ng/ml)

35 Igazságügyi gyi alkalmazások +MRM: 304/ / /82 304/ O C O CH 3 H 3 C N O C O Kokain meghatározása hajból Intensity, cps Time, min

36 Alprazolam kalibrációs görbe 2.0 Calibration Alprazolam y = x (r = ) CH 3 N N N Analyte Area / IS Area 1.0 Cl N e4 Analyte Conc. / IS Conc.

37 Alprazolam időbeli változása hajban Conc [pg/mg] 10 8 July 2001 January Segment [cm]

Hasonló dokumentumok

meghatároz lete és sa Szabó Pál MTA TTK

meghatároz lete és sa Szabó Pál MTA TTK 1 LC-MS/MS alapú mennyiségi meghatároz rozásokok elmélete lete és megvalósítása sa Szabó Pál MTA TTK Követelmények 2 Érzékenység Szelektivitás Gyorsaság Magas komponensszám/injektálás Mennyiségi meghatároz