HPLC MS és HPLC MS/MS. Bobály Balázs, Fekete Jenő

Átírás

1 HPLC MS és HPLC MS/MS Bobály Balázs, Fekete Jenő

2 Készülék felépítése (melyik a műszer?) MS LC ionforrás tömeganalizátor detektor P atm 10-3 torr 10-6 torr 1 ml mozgófázisból keletkező gáz atm nyomáson mozgófázis víz acetonitril metanol THF n C 7 kloroform gáztérfogat (ml)

3 Ionkromatogram, tömegspektrum: I(m/z)

4 HPLC UHPLC

5 Atmoszférikus nyomású ionizáció (API) APPI: atmoszférikus nyomású fotoionizáció 2% APCI: atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció 5% ESI: elektroporlasztásos ionizáció 93% LC MS MALDI: mátrix segített lézerdeszorpciós ionizáció Polaritás kérdése: +/ mód? Lágy ionizációs technikák: Ionizáció során ritkán van fragmentáció, ehhez ütközőcella/ioncsapda kell A spektrumban főként kvázimolekulaion és adduktok jelennek meg [M H], [M+NH 4 ] +, stb.. Az MS/MS spektrum sem gazdag fragmensekben (ált. max 4 5 csúcs) Az spektrum jellege (megjelenő ionok és intenzitásuk) készülékfüggő: nincs univerzális spektrumkönyvtár, csak házi

6 Elektroporlasztásos ionizáció (ESI) Atmoszférikus nyomás 10 3 torr, első vákuumlépcső 10 6 torr, második vákuumlépcső ellenáramú N 2 szárítógáz mozgófázis az LC ről porlasztó N 2 töltött folyadék Taylorkónusz aeroszol nyaláb fűtött N 2 szárítás gázfázisú ionképződés mintázó kónusz tömeganalizátor fűtött kapilláris, 3 5 kv ionoptika deszolvatáció, ionképződés

7 Elektroporlasztásos ionizáció (ESI) fragmens ion Kismolekula Makromolekula [M+H] + 17 kda myoglobin Intenzitás (%) [M+Na] + izotópcsúcsok [M+K] + m/z

8 Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció H 2 O-e - H 2 O + H 2 O + +H 2 O H 3 O + +OH - H 3 O + +M H 2 O+[MH] + (APCI) fűtött N 2 szárítás ellenáramú N 2 szárítógáz porlasztó gáz LC fűtött tömb 1. Oldószermolekulák ionizációja köpeny gáz oldószer molekula mintakomponens korona kisülési tű ~5 µa 2. Kvázi molekulaionok, adduktok képződése ellenáramú N 2 szárítógáz

9 Atmoszférikus nyomású fotoionizáció (APPI) Direkt ionizáció: M+hν M.+ +e - M.+ +H. [MH] + Indirekt ionizáció: dopant (pl. toluol) poszt-kolonna adagolása a mozgófázishoz LC T csatlakozó MS make up, dopant (ld. APPI)

10 Me-O 2 -C 20 H 30, apoláris molekula, APCI/APPI ionizáció működik jobban

11 Felbontás M/ΔM

12 Milyen tömegről beszélünk?

13 Mennyiségi meghatározás Ionizációs hatásfok mátrixfüggő, az érzékenység 20 40% ot is változhat! Kötelező a belső std, vagy addíciós módszer! Legjobb belső std ek: C 13 izotópjelzett, vagy deuterált analógok (D cserélődhet H ra)

14 Pufferek kiválasztása Illékony puffer lehet (nem illékony csak nagyon rövid ideig). Szerves aminok, mint additívek használatát kerülni kell!!!

15 Analizátorok kvadrupól tömeganalizátor (Q) kvadrupól rudak detektálás ionok kilépő nyílás (detektor felé) stabil pályájú ion belépő nyílás (forrás felől) egyen és váltófeszültség instabil pályájú ion

16 Analizátorok kvadrupól tömeganalizátor (Q) y kvadrupól rudak Adott m/z stabilis pályáját a DC mértéke, valamint az AC frekvenciája együttesen határozza meg. z x pozitív ion Egységnyi felbontás Robusztus Olcsó m/z tartomány Tömeginformációt nyújt, plusz szelektivitás

17 Analizátorok kvadrupól tömeganalizátor (Q) SIM mód Adott m/z követése, nagyobb érzékenységgel AC/DC beállítások nem változnak a mérés során Kvantira alkalmas SCAN mód Adott tömegtartomány pásztázása kisebb érzékenységgel AC/DC beállítások változnak a mérés során. Az analizátor egyszerre csak adott m/z t ereszt át, majd vált a következő m/z re

18 Analizátorok repülési idő tömeganalizátor (ToF) ionáram ionoptika, koherens ionnyaláb belépő nyílás Azonos m/z ionok, a gyorsító elektródtól való eltérő távolság miatt eltérő E kin re tesznek szert. merőleges kigyorsítás (impulzus szerű) gyorsító elektród detektor % % ionok pályája m/z m/z repülési cső reflektron gyűrű alakú elektródok, (iontükör) ToF reflektron ToF Kisebb m/z ionok jobban felgyorsulnak, repülési idejük rövidebb. Nagyobb m/z ionok repülési ideje hosszabb felbontás Kevésbé robusztus, kalibráció Drágább Egész tömegtartomány gyors pásztázása m/z (rtof) m/z (ToF, kisebb felbontás) Tömeginformációt nyújt, plusz szelektivitás Inkább kvalira alkalmas, pontos tömeg mérése (1 10 ppm)

19 belső elektród külső elektród Analizátorok ioncsapda típusú analizátorok, itt: szigetelés ionpálya belépő nyílás Orbitrap Különböző m/z ionok eltérő frekvenciával oszcillálnak a csapdában, az eredő frekvencia függvényt felbontva és FT va számítható a tömegspektrum (FT IR, FT NMR) detektor elektród 1 oszcilláció erősítés detektor elektród 2 frekvencia jel Fouriertranszformáció % m/z Akár felbontás Méregdrága Szerkezetfelderítés nagyágyúja az NMR mellett, pontos tömeg mérése

20 Tandem tömegspektrometria: mennyiségi meghatározás szelektív átmenetek + aktiváció, fragmentáció + semleges fragmentum mobilitás MS/MS mobilitás prekurzor ion termék (fragmens) ion Leggyakoribb: ütközéses aktiváció (Collision Induced Dissociation)

21 Tandem tömegspektrometria: hármas kvadrupól (QqQ) Q 1 q 2 Q 3 Ar 1) Termékion pásztázás 2) Kiválasztott átmenet detektálása 3) Prekurzor ion pásztázás 4) Semleges vesztés pásztázása Q 1 SIM q 2 CID Q 3 SCAN Q 1 SIM q 2 CID Q 3 SIM Q 1 SCAN q 2 CID Q 3 SIM Q 1 SCAN q 2 CID Q 3 SCAN (Δ m/z)

22 SIM/SRM/MRM/sMRM SRM SIM

23 Tandem tömegspektrometria: mennyiségi meghatározás smrm mennyiségi meghatározásra UHPLC módszerrel intenzitás 6 perc mérési idő 2,2 ml/min 256 komponens monitorozása ~5 másodperc széles csúcsok Idő (perc) intenzitás intenzitás intenzitás A komponensek termékion (product ion scan) spektrumai

24 Hibrid készülékek: IM QToF mozgófázis LC ről tömegkalibráció ionoptikai ionoptika KVADRUPÓL ETD IONMOBILITÁS MS IM CID gyorsító elektród detektor ION FORRÁS elővákuum nagyvákuum ioncsapda (ETD) mobilitás cella ioncsapda (CID) KETTŐS REFLEKTRON TOF

25 IM MS (izomerek izobárok elválasztása) V d =KE t t 2 t 3

26 Orbitrap Fusion Orbitrap tömeganalizátor Lineáris ioncsapda detektorok Ionoptika Kvadrupól tömeganalizátor S lencsék (ionoptika) C ioncsapda Ionoptika Alacsony nyomású Magas cella nyomású cella Ionforrás

27 Q LIT ToF ToF reflektron Orbitrap Felső tömeghatár (m/z) Felbontás (m/z 1000 nél) Tömegpontosság (ppm) Iondetektálás módja Alkalmazott vákuum (torr) > (egységnyi) <5 folyamatos pulzus pulzus pulzus pulzus Tandem MS MS/MS MS n MS/MS (QToF) MS/MS (Fusion) Alkalmazás kvanti (szerkezet) szerkezet (kvanti) szerkezet (kvanti) szerkezet (kvanti) szerkezet (kvanti) Ár

28 Melyik a műszer? MS Szelektív és érzékeny ha az anyag hajlandó ionizálódni $$$ Nem univerzális, nem old meg minden problémát Izobárokat továbbra is el kell választani Bonyolult mátrixokhoz, nyomelemzéshez ( ppt/ppq), szerkezeti információ LC (optikai detektorok) kevésbé érzékeny (kiv. FL) kevésbé szelektív Sokkal olcsóbb Nem univerzális, kromofór, vagy egyéb mérhető fiz. tul. Az árat a módszerfejlesztéssel kell megfizetni Egyszerűbb mátrixok, minor komponensek elemzése ( ppb)

29