Tömegspektrometria. Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet

Átírás

1 Tömegspektrometria Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet

2 A tömegspektrometria 0-dik törvénye Nem tömegspektroszkópia! Vagy mégis? Tömegspektroszkópia: különböző tömegű és töltésű részecskék szétválasztása Tömegspektrográfia: szétválasztott részecskék képének egyidejű, fotográfiás megjelenítése Tömegspektrometria: térben és időben szétválasztott részecskék egymás utáni elektromos detektálása

3 Alapelvek Ionok képzése bármely alkalmas anyagból Ionok szétválasztása m/z alapján Ionok minőségi és mennyiségi detektálása az m/z gyakoriság függvény szerint tömegspektrum

4 Miért jó? Nagy érzékenység kvalitatív kimutathatósági tartomány: g kvantitatív kimutathatósági tartomány: g Széles tömegtartomány relatív tömegegység Mért érték specifitása és reprodukálhatósága Alacsony mintaigény µg pg

5 Történeti áttekintés I. 1886, Goldstein gázfázisú ionok felfedezése (anódsugár) 1897, Thomson e - felfedezése és m/z meghatározása (Nobel-díj 1906) 1912, Thomson első tömegspektrométer (parabola spektrográf) 1918, Dempster elektron-ionizáció 1942 az első kereskedelmi készülék 1948, Cameron, time-of-flight (TOF) analizátor Eggers

6 Történeti áttekintés II. 1953, Paul, Steinwedel quadrupol és ioncsapda analizátor (Nobel-díj, 1992) 1966, Munson, Field kémiai ionizáció 1973, McLafferty HPLC és MS összekapcsolása 1978, Yost, Enke tandem tömegspektrométer 1984, Fenn elektrospray (Nobel díj, 2002) 1987, Karas et al. MALDI (matrix assisted laser desoption ionisation)

7

8 Felépítés Adatfeldolgozás, vezérlés mintabevitel ionforrás analizátor detektor Vákuumrendszer

9 Vákuum mbar Diffúziós olajpumpa és turbomolekuláris pumpa Ionizációs hatásfok, érzékenység és felbontás növelése Részecske-ütközések elkerülése Módosítják az ionok röppályáját, kinetikus energiáját Kioltják az ionok töltését Fragmentálják az ionokat más tömeg

10 Mintabevitel Bármilyen halmazállapotú minta vizsgálható Közvetlen gázok, illékony vegyületek, egykomponensű, tiszta anyagok Porlasztás (spray) HPLC, GC Ionizáció során keletkező hő Erős elektromos tér

11 Ionizálás Hő (+ töltéscsere elektrolitban) Elektromos mező Foton (lézer) Elektronütközés Atomok, ionok ütközése Elsősorban a minta anyagi minősége, stabilitása, oldószere határozza meg Befolyásolja az érzékenységet, kinyerhető szerkezeti infomációkat

12 Elektron-ionizáció (EI) Ütközés fűtött katódból kilépő elektron-nyalábbal (Re, 70eV) Könnyen gázfázisba vihető anyagok, Da-ig, magas hőmérséklet Intenzív, stabil, jól reprodukálható Anyagok szűk körére alkalmas, jelentős fragmentáció (in source decay, ISD) spektrumkönyvtárak

13 N Filament Extraction lenses Sample Inlet Collector Source magnets S

14 Lágy ionizációs technikák Kémiai ionizáció (chemical ionisation, CI) Gyors atom/ion bombázás (fast atom/ion bombardment, FAB/FIB) Plazmadeszorpció (plasma desorption, PD) Térdeszorpció erős elektromos térrel (field desorption, FD)

15 Kémiai ionizáció Ion-molekula reakciók (metán): CH 4 + e - CH e - CH 4 + CH 4 + CH 3 + CH 5 + CH 3+ + CH 4 C 2 H 5+ + H 2 CH 5+ + M CH 4 + [M+H] + [M+1] + C 2 H 5+ + M [M+C 2 H 5 ] + [M+29] +

16 Elektrospray/ionspray ionizáció (ESI, ISI) Porlasztásos technika Fém kapilláris, 2-5 kv, szemben erős ellentétes töltés Külső csövön vezett porlasztógáz (N 2 ) Fűtött N 2 ellenáram oldószer párologtatás Nem illékony, poláros szerves vegyületek

17

18 Matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI) Szerves mátrix (mustársav, α-ciano-4-oh-fahéjsav, 2,5-dihidroxi-benzoesav) Minta a mátrixszal fémfelületre szárítva Lézerimpulzusok a mátrix az elnyelt energia révén ionizálja és elpárologtatja a mintát Széles tömegtartomány, makromolekulák vizsgálata Gyors, kíméletes, érzékeny, keverék mintákhoz is jó

19

20 Ionok szétválasztása Statikus mágneses tér Dinamikus mágneses tér Statikus elektromos tér Dinamikus elektromos tér Kinetikus energia és repülési idő Tárolási idő

21 Szektoros analizátorok Mágneses térerősség röppálya szerint Elektromos térerősség kinetikus energia szerint szűr Nagy felbontás, nagy érzékenység, széles tömegtartomány Drága, lassú, nagyméretű, nagy technikai háttérigény

22 r=mv 2 /zee r=mv/zeb

23 Quadrupol analizátor

24 TOF (time of flight) analizátor Detektorhoz való megérkezés ideje függ a tömegtől és a töltéstől (gyorsítófeszültség) Hosszú tér- és ütközésmentes útszakasz kell Korrekció (iontükör reflektron) Olcsó, jó felbontóképesség, széles tömegtartomány MALDI + TOF fehérjeanalitika

25

26 Ioncsapda

27 Az ioncsapda analizátor előnyei a hagyományos lineáris kvadrupólokkal szemben: kb szeresen nagyobb érzékenység gyorsabb pásztázási sebesség szélesebb tömegtartomány nagyobb tömegfelbontás egyszerűbb felépítés, alacsonyabb árigény Hátrány: gyengébb kvantitativ meghatározási lehetőség

28 Detektorok A ionáram érzékelése A detektorok jellemzése: érzékenység ionáram változás követésének sebessége erősítési tényező elektromos zajszint (un. sötétáram) stabilitás (élettartam) Pontdetektorok (ionok szekvenciális detektálása) chaneltron Detektorsor (ionok szimultán detektálása) Alkalmazásuk:: mágneses analizátor

29

30 Nitrogén szabály: ha a molekulaion páratlan számú N atomot tartalmaz, tömegértéke mindig páratlan, ha nem tartalmaz N atomot vagy ezek száma páros, akkor a mólcsúcs mindig páros m/z értéknél jelentkezik A - elem monoizotópos pl. 19 F, 31 P, 127 I, H A + 1 elem A + 2 elem van egy 1 amu-val nagyobb izotópja a legnagyobb természetes előfordulású izotópjáénál pl. 12 C 13 C, 14 N 15 N van egy másik fő izotópja, ami 2 amu-val nagyobb tömegű a legnagyobb természetes előfordulású izotópjáénál pl. 35 Cl 37 Cl, 79 Br 81 Br

31 Felbontás R= m/ m 10 % szabály: két egyenlő intenitású csúcs között a völgy legfeljebb a csúcsmagasság 10 %-a Példa 1. Egyszeres töltésű m/z 1000 és 1001 ionok szétválasztásához R=1000 felbontás kell Példa 2. CO M=27, nominális tömegük: 28, m = 0, N 2 M=28, R = 2500 felbontás kell

32 Tandem tömegspektrometria I. MS/MS, MS 2

33 Tandem tömegspektrometria II. Lehetséges mérési módok parent/precursor ion scan ( anyaion pásztázás) daughter/product ion scan ( leányion pásztázás) constant neutral loss scan (konstans semleges vesztés) Selected ion / multiple reaction monitoring (SIM, MRM)

34

35 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai I. Mintabevitel: folyékony állapotú biológiai minta, megfelelően előkészített szérum, vércsepp, vizelet, liquor, szövetminta extraktum Egy vizsgálatból gyorsan, akár 30 féle anyagcserebetegségre adható diagnosztikai vélemény Fehérje (enzim) szintű diagnosztika szekvenciaeltérés azonosítása poszttranszlációs modifikációk azonosítása kvantitatív fehérje expressziós profil vizsgálata

36 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai II. Metabolit szintű diagnosztika: veleszületett anyagcsere-betegségek karnitin-észter profil meghatározás: primér/szekunder karnitinhiány, zsírsavoxidációs zavarok, szervessav aciduriák aminosav profil meghatározás: aminoacidopathiák guanidinovegyületek: kreatinszintézis zavarok epesavmetabolitok: epesavszintézis zavarok homocystein: hiperhomocysteinaemiák purinek, pirimidinek galaktosaemia szteroidszintézis, koleszterinszintézis zavarok hormonszintézis zavarok (trijódtironin, katekolaminok) szénhidrát-anyagcsere zavarai

37 A karnitin-észter profilvizsgálat diagnosztikus alkalmazása Vizsgált betegség Marker metabolit Vizsgált betegség Marker metabolit Zsírsavoxidáció rendellenességei Organikus aciduriák, acidaemiák Karnitin acilkarnitin transzlokáz defektus C16, C18-karnitin Propionaciduria C3-karnitin Karnitin Csökkent C0-karnitin Metilmalonsav acidaemia C3-karnitin, plazmamembrán /Cobalamin defektusok metilmalonil-karnitin transzporter defektus Karnitin palmitoil transzferáz I. Karnitin palmitoil transzferáz II. Emelkedett C0/C16 + C18 arány Izovaleriánsav acidaemia C5-karnitin C16, C18, C18:1-karnitin Glutársav acidaemia I. glutarilkarnitin MCAD C6, C8, C10:1-karnitin 3-metilkrotonil glicinuria C5OH, C5:1-karnitin SCAD C4-karnitin 3-metilglutakonátaciduria LCHAD C14OH, C16OH, C18OHkarnitin HMG-CoA liáz hiány C5OH, C6DCkarnitin VLCAD C14:1, C16:1-karnitin Biotinidáz deficiencia C3, C5OH-karnitin Többszörös acil CoA C4, C5, C8, C12-karnitin Mit. acetoacetil-coa C5:1, C5OH-karnitin dehidrogenáz tioláz hiány

38 Példák az aminosavprofil diagnosztikus alkalmazására glicin Nonketoticus hyperglycinaemia Detektált molekula Vizsgált betegség A betegség kialakulásának oka fenilalanin/tirozin Phenylketonuria fenilalanin-hidroxiláz enzim kóros működése vagy hiánya leucin/izoleucin Jávorfaszirup-betegség elágazó szénláncú ketonsavdekarboxiláz hiánya tirozin Tyrosinaemiák fumarilacetoacetáz/tirozinaminotranszferáz enzim defektusa glicin lebontásában szerepet játszó mitokondriális enzimek zavara metionin Hypermethioninaemia metionin-adenozil-transzferáz hiány metionin Homocystinuria cisztation-β-szintáz hiány citrullin Citrullinaemia arginin-szukcinát-szintetáz hiány arginin Argininaemia argináz hiány ornitin Ornithinaemia ornitin-ketonsav-aminotranszferáz hiány

39

40

41 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai III. Újszülöttkori szűrés Általában egészséges/teljes populáció vizsgálata, ebből a betegek felismerése Normál tartomány kijelölése; az egyes metabolitokra széles határok között mozoghat Cut-off értékek megállapítása Cél: durva eltérések és nem biológiai variabilitás kimutatása, kevésbé pontos módszer is elegendő

42 A korai diagnózis megelőzi a tünetek megjelenését, időben elkezdett terápia enyhíti vagy megakadályozza a késői szövődmények kialakulását Selective screening = diagnosztika: tüneteket mutató betegek mintáinak vizsgálata cél: kisebb anyagcsere-eltérés kimutatása pontos, érzékeny mérés, min. 2x, lehetőleg éhgyomri és étkezés utáni mintapár mérése

43 WHO kritériumok a populációs szűrőprogramok számára A vizsgált betegség egy jelentős egészségügyi problémát jelent Az azonosított betegek számára létezik elfogadható és hatásos kezelés Rendelkezésre állnak megfelelő diagnosztikai és kezelő intézmények Van felismerhető korai vagy lappangási állapot Létezik alkalmas vizsgálati módszer vagy teszt A vizsgálati módszer vagy teszt elfogadható a lakosság számára A betegség kórtörténete és a koraiból a kifejlett állapotba való átmenete kellőképpen tisztázott Szabályozott megegyezés van arról, hogy kit kell betegnek tekinteni A szűrés és a betegek kezelésének költségei nem haladják meg jelentősen a késői diagnózissal járó egészségügyi kiadásokat A betegek kiszűrése nem egyszeri program, hanem folyamatos tevékenység

44 Proteomikai alkalmazások Móltömegmeghatározás Szekvenálás, azonosítás Diszulfid hidak helyzetének meghatározása Konformáció vizsgálata Aktív centrum / kötőhely meghatározása Fehérje-ligand kölcsönhatás tanulmányozása

45 Egyéb alkalmazások Gyógyszerkutatás: szennyezésprofil vizsgálat Igazságügy: pl. drog-screening, doppingszerek, mérgek Agrártudomány: pl. bor aktív alkotói (rezveratrol) Környezetvédelem (dioxinok), élelmiszeripar Nukleotid szekvencia meghatározás

46