Tömegspektrometria. Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet február 27.

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Tömegspektrometria. Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet február 27."

Regina Gulyásné
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Tömegspektrometria Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet február 27.

2 A tömegspektrometria 0-dik törvénye Nem tömegspektroszkópia! Vagy mégis? Tömegspektroszkópia: különböző tömegű és töltésű részecskék szétválasztása Tömegspektrográfia: szétválasztott részecskék képének egyidejű, fotográfiás megjelenítése Tömegspektrometria: térben és időben szétválasztott részecskék egymás utáni elektromos detektálása

3 Alapelvek Ionok képzése bármely alkalmas anyagból Ionok szétválasztása m/z alapján Ionok minőségi és mennyiségi detektálása az m/z gyakoriság függvény szerint tömegspektrum

4 Miért jó? Nagy érzékenység kvalitatív kimutathatósági tartomány: g kvantitatív kimutathatósági tartomány: g Széles tömegtartomány relatív tömegegység Mért érték specifitása és reprodukálhatósága Alacsony mintaigény µg pg

5 Történeti áttekintés I. 1886, Goldstein gázfázisú ionok felfedezése (anódsugár) 1897, Thomson e - felfedezése és m/z meghatározása (Nobel-díj 1906) 1912, Thomson első tömegspektrométer (parabola spektrográf) 1918, Dempster elektron-ionizáció 1942 az első kereskedelmi készülék 1948, Cameron, time-of-flight (TOF) analizátor Eggers

6 Történeti áttekintés II. 1953, Paul, Steinwedel quadrupol és ioncsapda analizátor (Nobel-díj, 1992) 1966, Munson, Field kémiai ionizáció 1974, McLafferty HPLC és MS összekapcsolása 1978, Yost, Enke triple quadrupol (QqQ) analizátor 1987, Karas et al. MALDI (matrix assisted laser desoption ionisation) 1988, Fenn elektrospray (Nobel díj, 2002)

8 Felépítés Adatfeldolgozás, vezérlés mintabevitel ionforrás analizátor detektor Vákuumrendszer

Vákuum 10-4 10-6 mbar Diffúziós olajpumpa és turbomolekuláris pumpa Ionizációs hatásfok, érzékenység és felbontás növelése

9 Vákuum mbar Diffúziós olajpumpa és turbomolekuláris pumpa Ionizációs hatásfok, érzékenység és felbontás növelése Részecske-ütközések elkerülése Módosítják az ionok röppályáját, kinetikus energiáját Kioltják az ionok töltését Fragmentálják az ionokat más tömeg

10 Mintabevitel Közvetlen gázok, illékony vegyületek Porlasztás (spray) HPLC, GC Ionizáció során keletkező hő Erős elektromos tér

11 Ionizálás Hő (+ töltéscsere elektrolitban) Elektromos mező Foton Elektronütközés Atomok, ionok ütközése Elsősorban a minta anyagi minősége, stabilitása, oldószere határozza meg Befolyásolja az érzékenységet, kinyerhető szerkezeti infomációkat

12 Elektron-ionizáció (EI) Ütközés fűtött katódból kilépő elektron-nyalábbal (Re, 70eV) Könnyen gázfázisba vihető anyagok, Da-ig, magas hőmérséklet Intenzív, stabil, jól reprodukálható Anyagok szűk körére alkalmas, jelentős fragmentáció (in source decay, ISD)

13 N Filament Extraction lenses Sample Inlet Collector Source magnets S

14 Lágy ionizációs technikák Kémiai ionizáció (chemical ionisation, CI) Gyors atom/ion bombázás (fast atom/ion bombardment, FAB/FIB) Plazmadeszorpció (plasma desorption, PD) Térdeszorpció erős elektromos térrel (field desorption, FD)

15 Elektrospray/ionspray ionizáció (ESI, ISI) Porlasztásos technika Fém kapilláris, 2-5 kv, szemben erős ellentétes töltés Külső csövön vezett porlasztógáz (N 2 ) Fűtött N 2 ellenáram oldószer párologtatás Nem illékony, poláros szerves vegyületek

17 Matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI) Szerves mátrix (mustársav, α-ciano-4-oh-fahéjsav, 2,5-dihidroxi-benzoesav) Minta a mátrixszal fémfelületre szárítva Lézerimpulzusok Mátrix az elnyelt energia révén ionizálja és elpárologtatja a mintát Gyors, kíméletes, érzékeny, keverék mintákhoz is jó makromolekulák vizsgálata

19 Ionok szétválasztása Statikus mágneses tér Dinamikus mágneses tér Statikus elektromos tér Dinamikus elektromos tér Kinetikus energia és repülési idő

20 Szektoros analizátorok Mágneses térerősség röppálya szerint Elektromos térerősség kinetikus energia szerint szűr Nagy felbontás, nagy érzékenység, széles tömegtartomány Drága, lassú, nagyméretű, nagy technikai háttérigény

21 r=mv 2 /zee r=mv/zeb r=2u/e

22 Quadrupol analizátor

23 TOF (time of flight) analizátor Detektorhoz való megérkezés ideje függ a tömegtől és a töltéstől (gyorsítófeszültség) Hosszú tér- és ütközésmentes útszakasz kell Korrekció (iontükör reflektron) Olcsó, jó felbontóképesség, széles tömegtartomány MALDI + TOF fehérjeanalitika

Detektorok 10-9 - 10-15 A ionáram érzékelése A detektorok jellemzése: érzékenység ionáram változás követésének sebessége erősítési tényező elektromos zajszint (un.

25 Detektorok A ionáram érzékelése A detektorok jellemzése: érzékenység ionáram változás követésének sebessége erősítési tényező elektromos zajszint (un. sötétáram) stabilitás (élettartam) Pontdetektorok (ionok szekvenciális detektálása) chaneltron Detektorsor (ionok szimultán detektálása) Alkalmazásuk: mágneses analizátor

27 Felbontás R= m/ m 10 % szabály: két egyenlő intenitású csúcs között a völgy legfeljebb a csúcsmagasság 10 %-a Példa 1. Egyszeres töltésű m/z 1000 és 1001 ionok szétválasztásához R=1000 felbontás kell Példa 2. CO M=27, nominális tömegük: 28, m = 0, N 2 M=28, R = 2500 felbontás kell

28 Tandem tömegspektrometria I. MS/MS, MS 2

29 Tandem tömegspektrometria II. Lehetséges mérési módok parent/precursor ion scan ( anyaion pásztázás) daughter/product ion scan ( leányion pásztázás) constant neutral loss scan (konstans semleges vesztés) Selected ion / multiple reaction monitoring (SIM, MRM)

30 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai I. Mintabevitel: folyékony állapotú biológiai minta, megfelelően előkészített szérum, vércsepp, vizelet, liquor, szövetminta extraktum Egy vizsgálatból gyorsan, akár 30 féle anyagcserebetegségre adható diagnosztikai vélemény Fehérje (enzim) szintű diagnosztika szekvenciaeltérés azonosítása poszttranszlációs modifikációk azonosítása konformáció eltérések vizsgálata kvantitatív fehérje expressziós profil vizsgálata

31 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai II. Metabolit szintű diagnosztika: veleszületett anyagcsere-betegségek karnitin-észter profil meghatározás: primér/szekunder karnitinhiány, zsírsavoxidációs zavarok, szervessav aciduriák aminosav profil meghatározás: aminoacidopathiák guanidinovegyületek: kreatinszintézis zavarok epesavmetabolitok: epesavszintézis zavarok homocystein: hiperhomocysteinaemiák purinek, pirimidinek galaktosaemia szteroidszintézis, koleszterinszintézis zavarok hormonszintézis zavarok (trijódtironin, katekolaminok) szénhidrát-anyagcsere zavarai

35 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai III. Újszülöttkori szűrés Általában egészséges/teljes populáció vizsgálata, ebből a betegek felismerése Normál tartomány kijelölése; az egyes metabolitokra széles határok között mozoghat Cut-off értékek megállapítása Cél: durva eltérések és nem biológiai variabilitás kimutatása, kevésbé pontos módszer is elegendő

36 WHO kritériumok a populációs szűrőprogramok számára A vizsgált betegség egy jelentős egészségügyi problémát jelent Az azonosított betegek számára létezik elfogadható és hatásos kezelés Rendelkezésre állnak megfelelő diagnosztikai és kezelő intézmények Van felismerhető korai vagy lappangási állapot Létezik alkalmas vizsgálati módszer vagy teszt A vizsgálati módszer vagy teszt elfogadható a lakosság számára A betegség kórtörténete és a koraiból a kifejlett állapotba való átmenete kellőképpen tisztázott Szabályozott megegyezés van arról, hogy kit kell betegnek tekinteni A szűrés és a betegek kezelésének költségei nem haladják meg jelentősen a késői diagnózissal járó egészségügyi kiadásokat A betegek kiszűrése nem egyszeri program, hanem folyamatos tevékenység

37 Proteomikai alkalmazások Móltömegmeghatározás Szekvenálás, azonosítás Diszulfid hidak helyzetének meghatározása Konformáció vizsgálata Aktív centrum / kötőhely meghatározása Fehérje-ligand kölcsönhatás tanulmányozása

38 Egyéb alkalmazások Gyógyszerkutatás: szennyezésprofil vizsgálat Igazságügy: pl. drog-screening, doppingszerek, mérgek Agrártudomány: pl. bor aktív alkotói (rezveratrol) Környezetvédelem (dioxinok), élelmiszeripar Nukleotid szekvencia meghatározás

Hasonló dokumentumok

Tömegspektrometria A tömegspektrometria. Az n-dekán tömegspektruma. A tömegspektrometria rövid története: Biofizika szeminárium

Tömegspektrometria A tömegspektrometria. Az n-dekán tömegspektruma. A tömegspektrometria rövid története: Biofizika szeminárium Tömegspektrometria Biofizika szeminárium Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet A tömegspektrometria Definíció: térben és időben szétválasztott részecskék egymás utáni elektromos detektálása. Alapelvek: