Tömegspektrometria A tömegspektrometria. Az n-dekán tömegspektruma. A tömegspektrometria rövid története: Biofizika szeminárium

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Tömegspektrometria A tömegspektrometria. Az n-dekán tömegspektruma. A tömegspektrometria rövid története: Biofizika szeminárium"

Sándor Hajdu
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Tömegspektrometria Biofizika szeminárium Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet A tömegspektrometria Definíció: térben és időben szétválasztott részecskék egymás utáni elektromos detektálása. Alapelvek: Ionok képzése bármely alkalmas anyagból. Ionok szétválasztása m/z alapján. Ionok minőségi és mennyiségi detektálása az m/z gyakoriság függvény szerint. Az ionintenzitás- fajlagos tömeg közötti függvénykapcsolat a tömegspektrum. Az n-dekán tömegspektruma C 10 H 22 A tömegspektrometria rövid története: Goldstein 1886: gázfázisú ionok felfedezése (anódsugár). Thomson 1912: az első tömegspektrométer. Aston, Dempster 1919-től: izotópok pontos tömege, tömegspektrum kifejezés. 1942: első kereskedelmi készülék. Cameron, Eggers : time-of-flight (TOF) analizátor Paul 1955: quadrupol analizátor. McLafferty 1974: HPLC és MS összekapcsolása Karas et al. 1987: MALDI (matrix assisted laser desoption ionisation) Fenn 1988: elektrospray szervetlen MS szerves MS 1950-től 1

2 Miért jó az MS? Nagy érzékenység kvalitatív kimutathatósági tartomány: g kvantitatív kimutathatósági tartomány: g Széles tömegtartomány relatív tömegegység Specifitása, reprodukálhatóság, alacsony mintaigény ~μg - ~pg Bármilyen halmazállapotú, érzékenységú, szerkezetű anyag vizsgálható. Milyen információkat kaphatunk az MS-el? MW meghatározás, minőségi azonosítás. Szerkezetvizsgálat (pontos tömeg = elemösszetétel) Izotóparány GC, LC, stb. kombinációk összetett mátrixok elemzésére Proteomika Molekulák termodinamikai tanulmányozása: ionizációs energia, aktivációs entalpia és entrópia stb. LC/LC-MS/MS-Tandem LC, Tandem MS Az MS elvi felépítése Vákuum rendszer Mintabevitel Ion forrás Analizátor Detektor Adatfeldolgozás, vezérlés 2

3 Mintabeviteli megoldások 1. Direkt mintabevitel (zsilipelés) gázok folyadékok szilárd minták bevitele 2. Indirekt (elválasztás utáni) mintabevitel GC-MS LC-MS CE-MS Vákuumrendszerek: Analitikai készülékek: kétfokozatú Szerkezetvizsgálók: három fokozatú: 1. fokozat: elővákuum-rotációs szivattyú (10 2 kpa-0.1-1kpa-ig) 2. fokozat: turbomolekuláris szivattyú diffúziós szivattyú (0.1-1 kpa-ról kpa-ig) 3. fokozat: iongatter (10-8 -kpa-ig) Az ionforrások feladata: Ionok előállítása ionok gyorsítása koherens ionnyaláb biztosítása Az ionizáció történhet gáz, folyadék és szilárd fázisban. Ionizálás H ő (töltéscsere elektrolitban) Elektromos mező Foton Elektronütközés Atomok, ionok ütközése. Elsősorban a minta anyagi minősége, stabilitása, oldószere határozza meg. Befolyásolja az érzékenységet, kinyerhető szerkezeti infomációkat. 3

4 Analizátor Közvetlen ionizáció. Elektron ionizáció Ütközés fűtött katódból kilépő elektron-nyalábbal (50-75eV). Könnyen gázfázisba vihető anyagok meghatározására alkalmas 1000 Da-ig, magas hőmérséklet. Intenzív, stabil, jól reprodukálható. Anyagok szűk körére alkalmas, jelentős fragmentáció (in source decay, ISD) minta (M) M e Az elektron ütközéses ionizáció elve repeller M 2e izzó katód elektron nyaláb anód U ionoptika gyorsító elektród () ionnyaláb - U = 1-100kV Lágy ionizációs technikák Kémiai ionizáció Kémiai ionizáció (chemical ionisation, CI) Gyors atom/ion bombázás (fast atom/ion bombardement, FAB/FIB) Plazmadeszorpció (plasma desorption, PD) Térdeszorpció erős elektromos térrel (field desorption, FD) Közvetett ionizáció. Kombinált EI/CI forrás. Ion-molekula ütközések a reagens ionok és a minta molekulái között. Reagens gázok: metán, i-bután, ammónia. Gyenge fragmentáció, főleg molekulatömeg információ. 4

5 Analizátor CI ionforrás M CH 5 [MH] CH 4 Elektrospray/ionspray ionizáció (ESI, ISI) izzó katód gyorsító elektród Porlasztásos technika repeller CH 5 Fém kapilláris, 2-5 kv, szemben erős ellentétes töltés Külső csövön vezetett porlasztógáz (N 2 ) Reagens gáz: CH 4, NH 3, propán, PB anód minta (M) Fűtött N 2 ellenáram oldószer párologtatás Nem illékony, poláros szerves vegyületek ESI Pressure = 1 atm Inner tube diam. = 100 um Sample Inlet Nozzle (Lower Voltage) Partial vacuum N 2 MH Sample in solution N2 gas MH 2 2 MH 3 3 High voltage applied to metal sheath (~4 kv) Charged droplets 5

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) MALDI Szerves mátrix (mustársav, -ciano-4-oh-fahéjsav, 2,5-dihidroxi-benzoesav). Minta a mátrixszal fémfelületre szárítva.

Mátrix M D Gyors, kíméletes, érzékeny, keverék mintákhoz is jó makromolekulák vizsgálata ionizáció deszorpció Analizátorok Kvadrupól analizátor Feladatuk: Az ionforrásból érkező nagy sebességű ionok

6 MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) MALDI Szerves mátrix (mustársav, -ciano-4-oh-fahéjsav, 2,5-dihidroxi-benzoesav). Minta a mátrixszal fémfelületre szárítva. [Mátrix M] lézer [Mátrix] M [Mátrix] M Nitrogén lézer Lézerimpulzusok. Mátrix az elnyelt energia révén ionizálja és elpárologtatja a mintát. Mátrix M D Gyors, kíméletes, érzékeny, keverék mintákhoz is jó makromolekulák vizsgálata ionizáció deszorpció Analizátorok Kvadrupól analizátor Feladatuk: Az ionforrásból érkező nagy sebességű ionok szétválasztása fajlagos tömegük szerint. Mágneses analizátorok (180, 90, 60 -os eltérítésű) kvadrupól analizátorok (felső tömeghatár: 100 kda) Ioncsapda (olcsó, érzékeny, de mennyiségi meghatározásra nem alkalmas) Repülési idő (TOF) készülék (felső tömeghatár: 300 kda) Orbitrap FT-ICR kettős fókuszálású Tandem analizátorok: MS/MS, MS n 6

TOF (time of flight) analizátor TOF analizátor Detektorhoz való megérkezés ideje függ a tömegtől és a töltéstől (gyorsítófeszültség). Hosszú tér- és ütközésmentes útszakasz kell.

A detektorok jellemzése: érzékenység ionáram változás követésének sebessége erősítési tényező elektromos zajszint (ún.

7 TOF (time of flight) analizátor TOF analizátor Detektorhoz való megérkezés ideje függ a tömegtől és a töltéstől (gyorsítófeszültség). Hosszú tér- és ütközésmentes útszakasz kell. Lineáris és reflektron mód. Olcsó, jó felbontóképesség, széles tömegtartomány. MALDI TOF fehérjeanalitika Detektorok Feladatuk: A ionáram érzékelése. A detektorok jellemzése: érzékenység ionáram változás követésének sebessége erősítési tényező elektromos zajszint (ún. sötétáram) stabilitás (élettartam) Pontdetektorok (ionok szekvenciális detektálása) Detektorsor (ionok szimultán detektálása) Alkalmazásuk: mágneses analizátor Felbontóképesség: MS felbontás R m / m R<10 4 kisfelbontású R>10 4 nagyfelbontású 10 % szabály: két egyenlő intenzitású csúcs között a völgy legfeljebb a csúcsmagasság 10 %-a. 7

8 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai I. Mintabevitel: folyékony állapotú biológiai minta, megfeleleőn elkészített szérum, vércsepp, vizelet, liquor, szövetminta extraktum. Egy vizsgálatból gyorsan, akár 30 féle anyagcsere betegségre adható diagnosztikai vélemény Fehérje (enzim) szint diagnosztika: szekvenciaeltérés azonosítása poszttranszlációs modifikációk azonosítása konformáció eltérések vizsgálata kvantitatív fehérje expressziós profil vizsgálata A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai II. Metabolit szint diagnosztika: veleszületett anyagcsere-betegségek karnitin-észter profil meghatározás: primér/szekunder karnitinhiány, zsírsavoxidációs zavarok, szervessav aciduriák aminosav profil meghatározás: aminoacidopathiák guanidinovegyületek: kreatinszintézis zavarok epesavmetabolitok: epesavszintézis zavarok homocystein: hiperhomocysteinaemiák purinok, pirimidinek galaktosaemia szteroidszintézis, koleszterinszintézis zavarok hormonszintézis zavarok (trijódtironin, katekolaminok) szénhidrát-anyagcsere zavarai Köszönöm a figyelmet! 8

Hasonló dokumentumok

Tömegspektrometria. Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet február 27.

Tömegspektrometria. Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet február 27. Tömegspektrometria Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet 2008. február 27. A tömegspektrometria 0-dik törvénye Nem tömegspektroszkópia! Vagy mégis? Tömegspektroszkópia: különböző tömegű és töltésű