Abszorpciós fotometria

Átírás

1 abszorpció Abszorpciós fotometria Spektroszkópia - Színképvizsgálat Spektro-: görög; jelente kép/szín -szkópia: görög; néz/látás/vizsgálat Ujfalusi Zoltán PTE ÁOK Biofizikai Intézet február Vizsgálatok EM sugarakkal (pl. fény) A spektroszkópia célja Anyag kvalitatív /vagy kvantitatív megismere: Anyagi minőség összetétel: karakterisztikus, ujjlenyomat Szerkezet Az anyag időbeli változásának nyomon követe: (időbontásos spektroszkópia) Anyagi minőségbeli változás (pl. kémiai reakció hatására), Szerkezeti változások követe (gyors kinetikai folyamatok vizsgálatára is alkalmas) Nem látjuk a molekulát, hanem a spektrum (változása) alapján, fizikai ismereteink segítségével következtetünk a szerkezetre (ill. a módosulásra)! A spektrum Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. Egy intenzitás-jellegű mennyiség ábrázolva egy energiajellegű mennyiség függvényében. intenzitás, beütszám (pl. radioaktivitás mére), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD) energia azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám) Folytonos emissziós spektrum: Magas hőmérsékleten izzó szilárd folyékony anyagok. Vonalas emissziós spektrum: Meleg gázok emissziós spektruma. Joseph von Fraunhofer ( ) Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a szoláris kromoszférában lévő elemeknek a Nap forró belsejéről kibocsátott látható sugárzás bizonyos hullámhosszain történő abszorpciója okoz. Vonalas abszorpciós spektrum: Hideg gázok abszorpciós spektruma. 1

2 Fontos fizikai mennyiségek, összefüggek Fény anyag kölcsönhatása Frekvencia: Hullámhossz: (m) Hullámszám: vagy f (1/s) (cm -1 ) c f 1 Energia: E (J) h. f Einstein: foton (fénykvantum) energiája Kvantált energiafelvétel (foton) Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: visszaverődhet (reflexió) elnyelődhet (abszorpció) áthaladhat (transzmisszió) A biológiai hatás létrejöttének feltétele! Extinkc. koeff.: (M -1 cm -1 vagy (mg/ml) -1 cm -1 ) Az energia felbontása E összes = E elektron + E vibrációs + E rotációs Az energiatípusok nagyságrendje: E elektron ~ 1,000 * E vibrációs ~ 1,000,000 * E rotációs Abszorpció Az abszorpció - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - additív E OD A = - log (I / I 0 ) = ( ). c. x I = I ( ) x c Lambert-Beer törvény ( ) : az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a koncentrációja, x: az optikai úthossz 2

3 Számítási feladat I. Határozza meg egy ismeretlen oldat koncentrációját! Miért ( ) nemcsak? Adott: E (450) = 0,45 (450) = 2,25 (mg/ml) -1 cm -1 Optikai úthossz (x) = 1 cm c =? c = 0,45 / (2,25 (mg/ml) -1 cm -1 * 1 cm) c = 0,2 mg/ml E (450) = (450) * c * x c = E (450) /( (450) * x) Mert az abszorpció függő, így az is az kell hogy legyen! Számítási feladat II/A Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját mm-ban ( = nm-en)! Adott: E (280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték!!!) E (290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték!!!) (280) = 1,11 ml*mg -1 *cm -1 (290) = 0,63 ml*mg -1 *cm -1 Optikai úthossz (x) = 1 cm c =? Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mm anyagmennyiségnek felel meg: 0,1867 * 11 = 2,0537 E (290) = (290) * c * x c = E (290) /( (290) * x) c = 3,2598 mg/ml c = ~ 75 mm Számítási feladat II/B Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját mm-ban ( = nm-en)! Adott: E (280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték!!!) E (290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték!!!) (280) = 1,11 ml*mg -1 *cm -1 (290) = 0,63 ml*mg -1 *cm -1 Optikai úthossz (x) = 1 cm c =? Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mm anyagmennyiségnek felel meg: 0,3289 * 11 = 3,6179 E (280) = (280) * c * x c = E (280) /( (280) * x) c = 3,2598 mg/ml c = ~ 75 mm Transzmisszió Számítási feladat III. I 0 fényforrás T = I / I 0 Általában százalékban (%) adjuk meg. I detektor 10% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = OD = - log (I/I 0 ) = - log (0,1) = 1 50% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = 0,301 Ha a 10% az 1% transzmittanciájú anyagot együtt használjuk, mennyi lesz az eredő transzmittancia abszorbancia? A = 2+1 = 3, T = 0,01 0,1 = 0,001 = 0,1 % Megjegyz: a transzmittancia (T=I/I 0 ) nem additív! 3

4 Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer működének elméleti sémája Az alapelv Folytonos fényű, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa Prizma + r vagy optikai rács + r R mérete változtatható! műanyag, üveg, kvarc küvettákban PMT Minta Fényforrás Diffrakciós rács fényforrás monokromátor Minta Detektor 1 R Referencia csatorna Referencia (blank) Detektor 2 Fény Elektromos jel Időbeli instabilitások (például a lámpáé) kiküszöbölődnek. Kiértékel (PC) Fény detektálás: Elektromágneses sugárzás átalakítása elektromos jellé (feszültségváltozássá). Az emisszió az abszorpció mére A fotométer linearitása; stray light effect emisszió Tér bármely irányából! Várható tendencia Meredekség: abszorpció Csak lineáris elrendezben! koncentráció A fotométer linearitása; stray light effect Kicsi abszorpció mellett A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok! I 0 I 99% kiválasztott 89% kiválasztott Optikai rács Második, harmadik, stb. felharmónikusok! 4

5 Nagy abszorpció mellett Fényszórás I 0 I Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál már számottevő lehet a stray light effect mellett! 99% kiválasztott 1% kiválasztott Ezt is érzékeli a detektor!!! Az abszorpciós fotometria alkalmazásai Fehérjék abszorpciójának mére Az alapvonal (baseline) jelentősége Különböző oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása Időfüggő változások nyomonkövete Fehérje PUFFER!!! Elektroforézis minták kiértékele Időfüggő mérek 0,2 Abszorpció egyéb alkalmazása Elektroforézis minták kiértékelénél Anyagi, minőségbeli, szerkezeti változások követe (pl. kémiai reakciók hatására) Abszorpció 0,0-0,2-0, idõ (s) 5

6 Additivitás Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása Számítási feladat IV. Határozza meg egy fluoreszcensen (IAEDANS) jelölt ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját mm-ban jelöltségének arányát %-ban kifejezve! fehérje fluoreszcens próba Adott: E (290) = 0,269 (21x-esen hígított érték!!!) E (336) = 0,047 (21x-esen hígított érték!!!) (290) = 0,63 ml*mg -1 *cm -1 (336) = 6100 M -1 *cm -1 Optikai úthossz (x) = 1 cm Korrigálni kell a 290 nm-en mért abszorpcióra!!! E (korr.) = E (290) -0,21*E (336) E (korr.) = 0,259 E = ( ) * c * x c (aktin) = 198,5 mm c (aktin) =? c (IAEDANS) =? Jelöltség =? 81,5 % c (IAEDANS) = 0,047 6 *21* c (IAEDANS) = 161,8 mm 6