Sejt. Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég 1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Sejt. Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég 1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly"

Enikő Hegedüsné
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 Biofizikai módszerek a citoszkeleton vizsgálatára I: Kinetikai és steady-state spektroszkópiai módszerek Sejt Citoszkeletális rendszerek Orbán József, 2014 április Institute of Biophysics Citoszkeleton: ktin Mikrotubulusok Intermedier filamentumok inamikus!!! Fotométer Fluoriméter ktin alapú mikrofilamentális rendszer ktin működés, dinamika pozitív / szakállas vég 1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly Milyen gyors? Milyen tartós? inamizmus? On-rate Kötési állandó On/off rate negatív / hegyes vég On/off-rate Kötési/disszociációs állandó Rigiditás/flexibilitás Hossz Kölcsönhatás más fehérjékkel ktin működés, dinamika pozitív / szakállas vég 1. aktív nukleálás 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly ktin-kötő fehérjék működése, dinamika (aktív) nukleálás sapkázás (capping) filamentum törés (severing) negatív / hegyes vég (felépülést) nukleáló faktor (assembly) nucleation factor Sapkázás (capping)? sequestration profilin (-szerű) 1

elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly Milyen gyors? Milyen tartós? inamizmus? On-rate Kötési állandó On/off rate http://www.nature.com/nature/journal/v422/n6933/fig_tab/nature01598_f1.

2 bszorbancia (-) Extinction coefficient Capping Barbed-end () growth TP P profilin assembly factor nucleator CP TP Pointed-end (-) depolymerization F P Tb Sequestration 1. Spontaneous assembly 2. Facilitated assembly rp2/3 complex machinery: autocatalytic branching Formins: nucleation and processive elongation WH2-domain nucleators - Severing F Profilin CP - adapted from Renault L. Bugyi B. Carlier MF. Trends in CB alapállapot tomok abszorpciója és emissziója E abs = hn E em = hn Gerjesztett állapot (foton) bszorpció (elektron) Excitáció Gerjesztés (elektron) e-excitation Visszagerjesztődés (foton) Emisszió Kibocsátás z molekula (fehérje) sávos (abszorpciós) spektruma 2,5 2,0 1,5 Fehérjék abszorpciója - aminosavak 3 aminosav nyel el az UV-ban. Ezek segítségével lehet pl. fehérje koncentrációt meghatározni, egy adott fehérje tiszta oldata esetén. 0,5 G- 0, Hullámhossz (nm) wavelength Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer működésének elméleti sémája Hogyan mérjük a fluoreszcenciát? Egy fluoriméter működésének elméleti sémája fényforrás (rács v. prizma) Minta etektor 1 gerjesztési Minta Fény Elektromos jel Referencia csatorna Referencia (blank) etektor 2 Kiértékelés (PC) mérés során hullámhosszonként határozzuk meg az abszorbancia értékét egy széles (spektrális) tartományban. fényforrás Fény (gerjesztés) Fény (emisszió) Elektromos jel emissziós etektor Kiértékelés (PC) 2

3 filamentum filamentum Milyen információt nyerhetünk ki a rendszerből? Mire következtethetünk az eredményekből? struktúra változás kölcsönhatás dinamikája ktin-kötő profilin molekula Röntgen szórási eredmények (X-ray diffraction) biokémiai bizonyítékok! ktin-kötő (WH2-szerű) Tb4 molekula Röntgen szórási eredmények (X-ray diffraction) biokémiai bizonyítékok! csökkent polimerizációs sebesség és F- mennyiség profilin- a filamentum csak egyik végéhez tapad gátolt polimerizáció Tβ4- csak formában fordul elő Irobi, EMBO J., Sep Reakció kinetika k B B k és k - sebességi állandók: Összeszerelés/felépülés és szétszerelés/leválás (B komplexre nézve) egy kétirányú biokémiai reakcióban gln 41 K k - B B Sebesség függ: Használt anyagok minőségétől koncentrációktól hőmérséklettől katalizátorok / inhibítorok K, disszociációs állandó, meghatározza egyensúlyban a szabad (, B) és komplexben (B) lévő molekulák mennyiségét. Staedy state dinamikus egyensúly! cys 374 3

$ktin-kötő (WH2-szerű) Tb4 molekula Röntgen szórási eredmények (X-ray diffraction) biokémiai bizonyítékok!$

4 Pirén fluoreszcencia intenzitás (a.u.) B ENS intensity (au) Fss (mm) Pirén N-(1-Pyrene) iodoacetamide FITC Fluorescein isothiocyanate Folyamat: (e)polimerizáció mérhető: intenzitás IENS 5-({2-[(iodoacetyl)amino]ethyl}diamino)naphthalene-1-sulfonic acid Folyamat: kötési esszé mérhető: intenzitás vagy anizotrópia Folyamat: quenching ( szerkezet) mérhető : intenzitás Folyamat : FRET ( szerkezet) IF! mérhető : intenzitás lexa Fluor 488 Carboxylic cid, Succinimidyl Ester (e)polimerizációs folyamat mérhető: intenzitás mikroszkópia Polimerizációs esszé 2 mm 10% pirén jelölt (spectrin nélkül, változó [VopF V0]) Szekvesztrálás (VopF) steady state Idő (perc) Nukleálás vagy elongációs sebesség változás? nm összeszerelés seb. steady state szint nm összeszerelési seb. steady state szint ktin szekvesztrálás 2 mm 10% pyrene labeled actin, no spectrin seeds, varied VopF, KME (hs), ph7.8 0,8 0,6 0,4 0,2 [actin] 0,5 0,25 0, VopF concentration (nm) depolimerizáció [VopF] G- szekvesztrálás platót a G- szinten éri el max. depolimerizáció változás a kritikus koncentrációban 3 WH2 domén szakállas vég kötés? I/I max 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 G- kötés steady state ENS jelölt G-, fluoreszcencia intenzitás 1.1 mm ENS ata 1 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 [VopF] K d = 0.03 mm % ENS fluoreszcencia intenzitás kioltás (quenching) 1:2 VopF:actin arány nagy affinitás 3 WH2 domén van, de csak kettő köt t! 1.1/2.2 mm 90% ENS labeled actin, varied VopF, in G buffer, ph7.8 ENS VopF kötési kinetika stopped flow 10,00 [VopF V0] 9,75 (mm) 0 9, , , , , , ,00 0,0 0,5 1,5 2,0 time (s) 4

) B ENS intensity (au) Fss (mm) Pirén N-(1-Pyrene) iodoacetamide FITC Fluorescein isothiocyanate Folyamat: (e)polimerizáció mérhető: intenzitás IENS

filamentum F R E T Förster type resonance energy transfer 1 donor-akceptor párral jelölve Gln-41 labelled by FITC (cceptor) TP intramolekuláris flexibilitás Cys-374 labelled by IENS (onor) IM-lipid

5 filamentum F R E T Förster type resonance energy transfer 1 donor-akceptor párral jelölve Gln-41 labelled by FITC (cceptor) TP intramolekuláris flexibilitás Cys-374 labelled by IENS (onor) IM-lipid FRET hatékonyság a membránlipidek függvényében IRSp53-IM Homo sapiens gln 41 cys mm IM növekvő lipidkoncentráció mellett % PS - 70% PS, 30% PC -100% PC -15 % PIP2, 85 % PC -4 % PIP2, 96 % PC Kd (um) PS ,38 PS ,86 PC ,87 PIP2/PC 15/85 87,73 PIP2/PC 4/96 99,35 5

függvényében IRSp53-IM Homo sapiens gln 41 cys 374 1 mm IM növekvő lipidkoncentráció mellett - 100 % PS - 70% PS, 30% PC

Hasonló dokumentumok

Komplex egyszerű Aktin alapú mikrofilamentum rsz. Hogyan vizsgálhatunk folyamatokat? Komplex egyszerű S E J T

Komplex egyszerű Aktin alapú mikrofilamentum rsz. Hogyan vizsgálhatunk folyamatokat? Komplex egyszerű S E J T Biofizikai módszerek a citoszkeleton vizsgálatára I. Kinetikai, steady-state módszerek, spektroszkópiai vizsgálatok Komplex egyszerű S E J T A citoszkeletális rendszer Orbán József, 213 Április Aktin citoszkeleton