Modern mikroszkópiai módszerek

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Modern mikroszkópiai módszerek 2 2011 2012"

Benjámin Fekete
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA A mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcencia emisszióját képezzük le. 1 Bugyi Beáta - PTE ÁOK Biofizikai Intézet 2 FLUOROFÓROK BELSŐ (INTRINSIC) FLUORESZCENCIA klorofil KÜLSŐ (EXTRINSIC) FLUORESZCENCIA fluoreszcens molekulák A FELBONTÓKÉPESSÉG NÖVELÉSE SZUPERREZOLÚCIÓS MÓDSZEREK a fluoreszcencia mikroszkópiában KIS MOLEKULA kémiai d = 1, 20 atom FEHÉRJE: zöld fluoreszcens fehérje (GFP) kémiai d = 2-10, atom antitest* másodlagos antitest* KVANTUM GYÖNGY kémiai d = 2-10, atom elsődleges antitest biomolekula biomolekula antigén antigén IMMUNOFLUORESZCENCIA - DIREKT, INDIREKT kémiai d = 2-10, atom 3 4 FELBONTÓKÉPESSÉG ABBE ELV DIFFRAKCIÓS LIMIT Ernst Abbe ( ) XY irányban a minta síkjában Z irányban optikai tengely mentén A FELBONTÓKÉPESSÉG NÖVELÉSE #1: Z irányú emisszió d x, y = λ 0.61 nsinα 2λ d z = ( nsinα) d: az a legkisebb távolság, amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól a képen: DIFFRAKCIÓS LIMIT λ: a megvilágítás hullámhossza ω : objektív fél nyílásszöge (apertura szög) n: a minta és az objektív közötti közeg törésmutatójától hagyományos fénymikroszkópia XY Z gerjesztés μm HÁTTÉRFLUORESZCENCIA!!! jel/zaj arány Z IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA háttérfluoreszcencia kiküszöbölése KONFOKÁLIS TECHNIKA EVANESZCENS MEZŐ ALKALMAZÁSA 6 1

MÓDSZEREK a fluoreszcencia mikroszkópiában KIS MOLEKULA kémiai d = 1, 20 atom FEHÉRJE: zöld fluoreszcens fehérje (GFP) kémiai d = 2-10, 100-100000 atom antitest* másodlagos antitest* KVANTUM GYÖNGY

2 Marvin Minsky 1961 Marvin Minsky 1961 detektor SZÉLESLÁTÓTERŰ MIKROSZKÓPIA egy sík van fókuszban detektor APERTÚRA egy sík van fókuszban mégisazösszessíkhozzájárula képhez APERTÚRA: térbeli szűrés objektív fókuszpontból fókuszponton kívüli fókuszponton kívüli APERTÚRA objektív egy sík járul hozzá a képhez az apertúra kiszűri a többit KONJUGÁLT SÍK KONJUGÁLT FOKALITÁS minta fókuszsík 7 minta fókuszsík apertúra mérete: 1 Airy egység Airy egység:airy korong átmérője 8 HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA KONFOKÁLIS XY Z hagyományos konfokális D 4D: 3D + idő minta felszeletelése optikai szeletek tárgy sok 2D kép összefűzése 3D kép pollen autofluoreszcencia 11 tengeri csillag petesejt meiozis kromoszómák aktin mikrotubulusok 12 2

FOKALITÁS minta fókuszsík 7 minta fókuszsík apertúra mérete: 1 Airy egység Airy egység:airy korong átmérője 8 HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA KONFOKÁLIS XY Z hagyományos 230 1000 konfokális

3 optikailag sűrűbb közeg: 1 optikailag ritkább: 2 beesési szög( α) < törési szög( β ) Beesési α sinα n2 = sin β n1 n < n α : = α β = 2 o kritikus 90 TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS 1 α3 visszaverődés α2 α kritikus α1 törés β1 β2 90 ο β3 TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS 13 n 2 n 1 n 2 n 1 EVANESZCENS MEZŐ z α kritikus EVANESZCENS (TOVATŰNŐ) MEZŐ 90 ο d I0 I( z) = I0 e exponenciális lecsengés I(z) z I( z) = I0 exp( ) d d: behatolási mélység - független a beeső nyaláb polarizációjától - függ - a beeső nyaláb hullámhosszától (λ) - a közegek törésmutatójától (n 1, n 2 ) - beesési szögtől (α) távolság z, intenzitás %-ban HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA TIRFM XY Z hagyományos TIRFM B16/F1 melanoma sejtek (EGÉR) Multi-color TIRF Green: EGFP-Miozin. Excitation 488, Red: mrfp-aktin. Excitation AKTIN μm 17 aktin formin 18 3

I0 exp( ) d d: behatolási mélység - független a beeső nyaláb polarizációjától - függ - a beeső nyaláb hullámhosszától (λ) - a közegek törésmutatójától (n 1, n 2 ) - beesési szögtől (α) távolság z,

4 A FELBONTÓKÉPESSÉG NÖVELÉSE #2: XY irányú ABBE ELV DIFFRAKCIÓS LIMIT EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE STED FLUORESZCENCIA EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE XY irányban a minta síkjában d x, y = λ 0.61 nsinα gerjesztés gerjesztett állapot - fluoreszcencia XY IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA FIZIKAI MÓDON STED MATEMATIKAI MÓDON dekonvolúció 19 nem lineáris le-gerjesztés alapállapot - nonfluoreszcens maradék fluoreszcencia 20 EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE STED EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE STED fázislemez gerjesztés gyengítés HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA STED gyengítő lézer STED lézer red shift dikroikus tükrök gerjesztő lézer objektív minta 21 AKTIN FILAMENTUMOK 22 EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE STED SPECIÁLIS FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK FRET Förster rezonancia energia transzfer XY Z hagyományos STED FRAP Fluoreszcencia visszatérése kioltás után FLIM FADIM Fluoreszcencia élettartam / anizotrópia lecsengés mikroszkópia

maradék fluoreszcencia 20 EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE STED EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE STED fázislemez gerjesztés gyengítés HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA STED gyengítő lézer STED lézer red shift

5 SPECIÁLIS FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK TÁRGY-PONT HAGYOMÁNYOS fluoreszcencia mikroszkópia PIXEL = FLUORESCENE INTENSITY intenzitás térkép FRET PIXEL = TRANSZFER HATÁSFOK hatásfok térkép FRET FÖRSTER REZONANCIA ENERGIA TRANSZFER Theodor Förster Fernandez és Berlin 1976 energia transzfer E = 6 6 r ( távolság) hatásfoka 1+ R 0 AKCEPTOR DONOR AKCEPTOR DONOR KÉP-PONT: PIXEL FLIM PIXEL = FLUORESZCENCIA ÉLETTARTAM élettartam térkép FADIM PIXEL = FLUORESZCENCIA ANIZOTRÓPIA anizotrópia térkép 25 távol NINCS FRET donor intenzitás = közel (1-10 ) VAN FRET donor intenzitás 26 FRET FÖRSTER REZONANCIA ENERGIA TRANSZFER BIOMOLEKULÁK - KÖZÖTTI KÖLCSÖNHATÁSOK - ELOSZLÁSA LIPID RAFTOK LÉTEZÉSE Rajat Varma & Satyajit Mayor Nature 1998 CHO: kínai hörcsög petesejt membrán: PLF GPI (glikosilfoszfatidilinositol) kötő fehérjék FRET FRAP FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN W. Bähr 1974 előtte INTENZÍV LÉZERIMPULZUS fluoreszcencia kioltás DIFFÚZIÓ kioltás utána visszatérés mobilis fluoreszcens molekulák nem-fluoreszcens molekulák fluoreszcens molekulák nem-fluoreszcens molekulák 50% immobilis 27 idő (t) 28 FRAP FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN FRAP FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN fluoreszcencia kioltás fluoreszcencia visszatérése LAMELLIPODIUM DINAMIKÁJA Lai és mtsai EMBO Journal 2008 Fluoreszcencia intenzitás kioltás visszatérés 50% mobilis immobilis kioltás visszatérés 50% mobilis immobilis B16-F1 sejt EGFP-aktin idő (t) 29 idő 30 5

PIXEL = FLUORESZCENCIA ÉLETTARTAM élettartam térkép FADIM PIXEL = FLUORESZCENCIA ANIZOTRÓPIA anizotrópia térkép 25 távol NINCS FRET donor intenzitás = közel (1-10 ) VAN FRET donor intenzitás 26 FRET

6 FRAP FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN FOTOAKTIVÁLHATÓ FLUORESZCENS FEHÉRJÉK BIOMOLEKULÁK MOZGÁSA kinetikai analízis fluoreszcencia intenzitás visszatérésének sebessége mennyisége fluoreszcencia intenzitás kioltás visszatérés 50% mobilis immobilis idő (t) idő (t) 31 B16-F1 sejt mrfp-aktin fotoaktiválható GFP-aktin 32 TOVÁBBI KÉPALKOTÁSI ELJÁRÁSOK TOVÁBBI KÉPALKOTÁSI ELJÁRÁSOK A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA OPTIKAI (FÉNY) ELEKTRON PÁSZTÁZÓSZONDÁS A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA OPTIKAI (FÉNY) ELEKTRON PÁSZTÁZÓSZONDÁS megvilágítás: látható fény lencsék: üveg jel: fény Abbe elv: IGEN megvilágítás : elektron nyaláb lencsék: elektromágnes jel: elektron Abbe elv: IGEN megvilágítás : mikroszkópikus próba jel: a minta és a próba közötti kölcsönhatás Abbe elv: NEM Fáziskontraszt mikroszkópia Sztereomikroszkópia Fluoreszcencia mikroszkópia Transzmissziós elektroikroszkópia (TEM) Pásztázó elektroikroszkópia (SEM) Ernst Russka (1931) OPTIKAI - FÉNY EM képalkotás fénynyaláb elektronnyaláb hullámhossztartomány nagyítás 2000 x x ( x) TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM) PÁSZTÁZÓ ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM)

A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA OPTIKAI (FÉNY) ELEKTRON PÁSZTÁZÓSZONDÁS A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA OPTIKAI (FÉNY) ELEKTRON PÁSZTÁZÓSZONDÁS megvilágítás: látható fény lencsék:

7 TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM) áteresztett e - PÁSZTÁZÓ ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM) visszafelé szórt e - rendszámbeli különbségek, nehézatomok másodlagos e - felület topográfiája Auger e - karakterisztikus rtg sugárzás spektruma felület kémiai összetétele TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM) szívizom PÁSZTÁZÓ ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM) trachea epithelium KIEGÉSZÍTÉS FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA 39 MIKROSZKÓP LEGFONTOSABB KOMPONENSEI FÉNYFORRÁS GERJESZTÉS LÁMPA hullámhossztartomány LÉZER, LED adott hullámhossz KÉP SZEM TÁRGY MINTA FÉNYFORRÁS GERJESZTÉS xenon ív lámpa OKULÁR KÉP DETEKTOR higanygőz lámpa OBJEKTÍV SZŰRŐK TÜKRÖK

ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM) trachea epithelium 37 38 KIEGÉSZÍTÉS FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA 39 MIKROSZKÓP LEGFONTOSABB KOMPONENSEI FÉNYFORRÁS GERJESZTÉS LÁMPA

8 SZŰRŐK A MEGFELELŐ HULLÁMHOSSZ KIVÁLASZTÁSA DIKROIKUS TÜKÖR NYALÁBOSZTÓ ALULÁTENGEDŐ SÁV FELÜLÁTENGEDŐ TRANSZMITTANCIA (%) VISSZAVER ÁTENGED HULLÁMHOSSZ () OBJEKTÍV GERJESZTÉS szűrő kocka emissziós szűrő EMISSZIÓ nagyítás típus immerzió immerzió típusa típusa NA fedőlemez típusa nagyítás színkód dikroikus tükör gerjesztési szűrő fedőlemez tárgylemez munka távolság

szűrő kocka emissziós szűrő EMISSZIÓ nagyítás típus immerzió immerzió típusa típusa NA

Hasonló dokumentumok

2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: Brainbow

2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: Brainbow transgenic mouse hippocampus (40x) Technique: Confocal Mikroszkóp