Fotogerjesztett biofizikai rendszerek. Barócsi Attila

Átírás

1 Barócsi Attila 1

2 Tartalom Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Fotoszintézis növények Halobacterium Retinál ChR2 csatorna-rodopszin Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás 2

3 Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Sugárzások biológiai hatásának alapja élő rendszer atomjainak / molekuláinak gerjesztése v. ionizálása energiaátadás Elektromágneses sugárzás emissziója / abszorpciója olyan állapotváltozáskor, amikor a rendszer elektromos dipólus-momentuma megváltozik (elektronátmenet, rezgési/forgási állapotváltozás) Elektromágneses spektrum Fényérzetet a ~ nm (VIS) tartomány ad, tágabban fény az IR-UV, ún. optikai tartomány: nm UV-C (távoli) nm UV-B* (középső) nm UV-A (közeli) nm (látható, VIS) nm IR-A (közeli) 1,4-3,0 m IR-B (középső) m IR-C (távoli) 3

4 Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Elektromágneses spektrum Atommagon kívüli folyamatokban (elektronok, atomok, molekulák állapotváltozásaikor): fény- és röntgensugárzás duális jelleg Rövidebb felé: magfolyamatokból -sugárzás részecskejelleg dominál Hosszabb felé: mikrohullámok hullám leírás Radiometria optikai sugárzás mint energiát szállító folyamat (fizikai mennyiségekkel) Fotometria fényérzet keltő fény átlagos nappali emberi látására jellemző színképi függvénnyel korrigálva. Színmérés: színészleléshez objektíven mérhető mennyiségeket rendel Sugárzott teljesítmény, e = P W Fényáram, v lm Sugárerősség, I e = P W sr 1 Fényerősség, I v cd Ki- (adó) / besugárzott (vevő) intenzitás, I = P A W m 2 Felületi fényáram (adó) / megvilágítás (vevő), E v lx Sugársűrűség, L e = P A, W m 2 sr 1 Fénysűrűség, L v cd m 2 4

5 Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Emisszió: Rendszer gerjesztett állapotú. Gerjesztések: termikus lángfestés fémsókkal elektromos kisülési csövek optikai zöld növények fotoszintézisében Spontán: E 2 E 1 átmenet foton kibocsátással; külső hatás nélkül bekövetkező, statisztikus eloszlású, inkoherens: I ni Indukált: belépő E energiájú foton kölcsönhat a már E 2 állapotú atom elektronjával, amely visszatér E 1 -be két foton kibocsátásával frekvenciájuk, polarizációjuk és fázisuk is azonos monokromatikus és koherens sugárzás: A na 2 I n a 2 n 2 i E 2 E 1 E 2 h E 1 h h h 5

6 Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Abszorpció optikai gerjesztéskor elnyelődő foton 3 módon adhat át energiát: Perturbálja egy elektron állapotát (időtartama ~ foton rezgésideje, ~10 15 s), majd beesőével azonos foton emittálódik: koherens (klasszikus v. Rayleigh-szórás). Eltérő foton kis valószínűséggel: Raman-szórás. Fényszórást bármilyen foton kiválthat. Gerjeszti a rendszert bizonyos-tartományok esetén sokkal nagyobb időállandóval (megengedett optikai átmenet:10 8 s, metastabil állapot: 10 3 s). Gerjesztési energia emissziója: fotonként (lumineszcencia); kémiai folyamatban (fotokémiai reakció); fononként (hővé alakul: szűkebben vett fényabszorpció) áthaladó fényintenzitás csökken, mely-szerinti eloszlása jellemző az abszorbens rendszerre. fényelektromos hatást vált ki. Röntgen- és -sugárzás esetén jelentős lehet a Compton-szórás és párkeltés. be be be ki ki 6

7 Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Abszorpció és pigmentméret: 7

8 Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Abszorpció és pigmentméret: e 2L n p e h e nh 2L E e p 2 e 2m e n 2 8m h e 2 L 2 E e ( n 2 LUMO 8m 2 nhomo 2 e L )h 2 8

9 Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Abszorpció és pigmentméret: e 2 π R n 9

10 A gerjesztett molekula energiája Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Jablonski-diagram molekuláris átmenetek energiahelyes ábrázolására: Kasha-szabály: S 2 S 1 mindig hő, sugárzás S 1 legalsó vibrációs (LUMO) szintjéről T 1 S 0 : spinváltás (kis valószínűség élettartam nő) Szinglet / triplet állapotok: S 2 S 1 vibrációs kaszkád (hő) belső konverzió (hő) szinglet triplet átalakulás (nem sugárzó) s 10 9 s E r r T 1 S, S = 0 E s s E 1 E T T, S = 1 Fluoreszcencia S 0 Foszforeszcencia 10

11 Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Sugárzásmentes átmenetek: Lumineszcencia: nem fonontér rovására, hanem egyéb gerjesztésre >100 ps-nál hosszabb idő után bekövetkező fénykibocsátás. Lumineszcencia centrumok nem egy időben emittálnak lumineszcencia élettartam (~s néhány nap). I lum (T) > I term (T) hidegfény fluoreszcencia késleltetett: metastabil állapot esetén kioltás: reabszorpciós / transzfer folyamatoknál foszforeszcencia gyorsabb transzfer-reakciók miatt ritka a természetes folyamatokban 11

12 Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Lumineszcencia fotolumineszcencia: gerjesztett állapot g foton hatására Fluoreszcens foton energiája nem lehet nagyobb, mint a gerjesztő fotoné: f g Köztes nemsugárzó átmenetek is lehetségesek Két / több foton egymást követő elnyelésekor a kilépő foton energiája lehet nagyobb frekvencia felkonvertálás ( f < { g1, g2 }) feltétele: csapda, mely az elektront tárolja a következő foton elnyeléséig g h 2 h 1 Két / több foton egyidejű elnyelése: virtuális köztes állapoton keresztül ( f < g ) csapda f hc( 1 2) g g g f f 12

13 Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Energia- és töltéstranszfer: Energiatranszfer reakciók: gerjesztett elektron lyuk pár exciton transzfer (nettó töltés = 0) 13

14 14 Foto-gerjesztett molekulák viselkedése FRET Förster (fluoreszcens) rezonáns energiatranszfer: monopólus indukálta dipólus dipólus kölcsönhatás ~ (r 3 ) 2 : E E E I I R r R r 1 ) ( ) ( ~, ) / ( 1 1 D DA D DA ) ( ~ ~ ) ( 1 ~ 1 0,5 1 1 ] száma átmenet [, 1, 1, ) ( ~ DA DA r DA D r D D 6 0 D nr r nr r nr r nr r DA DA r D I k k I R k k k k k k s i k k k k k k k k k k r n k I k E E E i E E E E E E E E E

15 Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Fluoreszcencia kioltás: Fluoreszcencia csökken olyan molekulák / ionok jelenlétében melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotú fluorofór gerjesztési energiáját átvegyék és disszipálják (pl. hő, fotokémiai munka). k r DQ kr DQ ~ IDQ ID ~ kr knr kq Statikus kioltás: Nem fluoreszkáló (sötét) komplex kialakulása alapállapotú fluorofórral gerjesztett molekulák száma csökken fluorofór élettartam nem változik diffúziónak nincs szerepe k Dinamikus kioltás: Ütközés a gerjesztett fluorofórral gerjesztett állapot relaxál fluorofór élettartam csökken diffúzió kontrollált: I I 1 K[ Q] DQ / D r D k r kr k nr 15

16 Fotoszintézis Autotróf élőlények (növények, bizonyos baktériumok és más egysejtűek) a fény energiáját kémiai energiává alakítva szervetlen anyagból (legtöbbször CO 2 + H 2 O) szerves anyagot (pl. glükózt) állítanak elő O 2 képződés mellett. Növények: alkalmazkodtak (???) a fény látható tartományához különböző pigmentek (konjugált kettős kötések). Hatékony abszorpció kétféle fotorendszer (PSI II), reakcióközpontjukban egy-egy (chl-a) molekula-dimer áll. 16

17 Fotoszintézis növények Fotoszintézis akkor hatékonyan, ha (a többi biokémiai folyamathoz hasonlóan) térben elkülönül a sejt más részétől színtest 17

18 Fotoszintézis növények Fényszakasz: 1. Tilakoidba ágyazott fehérjealapú PSI II a szerkezetének megfelelő fény energiáját elnyeli, és továbbítja a reakcióközpont felé. A többletenergiától a chl-a elektront ad le (oxidálódik), amely szállítómolekulákra (antenna) kerül. Mindkét PS energiacsapdaként (LHC) működik, de: PSI gyenge oxidáló- / erős redukálószert termel (NADP + -t redukálja) h 6 (2H2O 2NADP 3ADP3Pi 2NADPH 2H 3ATP O2 ) 18

19 Fotoszintézis növények Fényszakasz: PSII erős oxidáló- / gyenge redukálószert termel (+1,1 V: természetes biológiai rendszerekben legnagyobb: víz-oxidáció feltétele) Gerjesztett állapot élettartama ~10 9 s a reakcióközpont feladata ezalatt eljuttatni az elektront a szállítórendszerhez (P680 * Pheo feofitin: elsődleges e -akceptor Q A Q B kinon e -akceptorok) 19

20 Fotoszintézis növények 2. PSINADP +, és PSIII között működik elektronszállító rendszer. Nem ciklikus elektronáram: PSII PSI NADP + Ciklikus elektronáram: Fd ferredoxin a NADPH mennyiségétől függően elektronokat csatol vissza PSI-ből a PQ plasztokinon protonpumpa működtetésére. 20

21 Fotoszintézis növények Fotogerjesztés és lehetséges relaxációs útvonalai: 21

22 Fotoszintézis növények Klorofill fluoreszcencia: 22

23 Fotoszintézis növények Klorofill fluoreszcencia kioltás: F 0 : minimális fluoreszcencia, PSII nyitott (sötétadaptált) F' 0 : fényadaptált (PSI gerjesztett) F m : maximális fluoreszcencia, PSII zárt (sötétadaptált) F' m : fényadaptált F v /F m : max. PSII kvantumhatásfok PQ: fotokémiai kioltás (nyitott/ összes centrum) 23

24 Fotoszintézis növények Klorofill fluoreszcencia kioltás: F 0 : minimális fluoreszcencia, PSII nyitott (sötétadaptált) F' 0 : minimális fluoreszcencia (fényadaptált, PSI gerjesztett) F m : maximális fluoreszcencia, PSII zárt (sötétadaptált) F' m : maximális fluoreszcencia (fényadaptált) F s : állandósult fluoreszcencia (fényadaptált) 24

25 Fotoszintézis Halobacterium O 2 jelenlétében ATP termelés oxidatív foszforilációval. Kevés O 2 : átkapcsol fotoszintetézisre. Fényenergiával hajtott protonpumpa által felépített gradiens hajtja az ATP-ázt az ATP szintézishez (Mitchell kemiozmozis). Ha nincs BR, nincs fényválasz O 2 nélkül nem áll vissza az ATP szint.» Danon, Stoeckenius, Photophosphorylation in Halobacterium halobium, PNAS Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71, (1974) 25

26 Fotoszintézis Halobacterium Respirációs/foszforilációs elektrontraszport-lánc gátlása nem befolyásolja a fényválaszt. Membrán proton-permeabilitás növelése mind a fény-, mind az O 2 választ gátolja. A bíbormembrán egyetlen fehérjealkotója a BR, mely sűrű pakolással épül be (csak 25% lipid), szabályos 2D hexagonális rácsba (6 nm-enkénti rácspontok körül 3 BR). Termelt ATP mennyisége ~ bíbormembrán frakció (és nem a teljes sejt) abszorpciójával. 26

27 Retinál Bakteriorodopszin (BR): 248 aminosav + transz-retinál (440 nm abszorpció) C=N kovalens kötés opszinhoz (560 nm abszorpció) Protonpumpa (Halobacterium): Fényadaptált BR: transz-retinál h 13-cisz-retinál fotociklus proton szállítás extracelluláris térbe ATP-szintézis. 27

28 Retinál BR fotociklus» Mak-Jurkauskas et al, Energy transformations early in the bacterio-rhodopsin photocycle revealed by DNP-enhanced solid-state NMR, PNAS, (2008) VIS fényimpulzussal megvilágítva a bíbormembrán abszorpciója 410 nm-re tolódik, majd visszatér a hosszú állapotába ciklikus protonfelvétel / -leadással. Folyamatos megvilágításra a BR oszcillál a 2 állapot között. Membránba ágyazva a proton transzlokáció irányítottá válik (kifelé). Fotokémiai elágazás: OP Q, mely stabil, de legerjeszthető (memória) retinál fehérjéről leválik, de a kötőhelynél marad 28

29 Retinál Látás: 11-cisz-retinál h transz-retinál disszociál opszin enzimatikus aktiválódása. transzducin-gdp transzducin-gtp cgmp 5 -GMP hidrolízis. cgmp-függő Na + csatornák bezáródása hiperpolarizáció gátlás csökken akciós potenciál. 29

30 ChR2 csatorna-rodopszin A membránpotenciál optikai változtatása: ChR2: nem-szelektív kationpumpa HR: halorodopszin kloridpumpa» Pastrana, Optogenetics: controlling cell function with light, Nature Methods,8, (2011) 30

31 Fluoreszcencia-detektálás és alkalmazása Fluoreszcencia jelenségéből analitikai eszköz oka: egy-foton detektálási érzékenység Jelentősége a biológiai tudományokban a legnagyobb fluoreszcenciát a fiziológiai folyamatokra közvetlenül jellemző idő- és méretskálák befolyásolják (pl. fehérjék, látás, fotoszintézis, DNS, sejtek és membránok vizsgálata) Aromás molekulák fluoreszcenciája = {, kvantumhatásfok, I, t d, polarizáció, pozíció} Fluoreszcencia alkalmazások 4 csoportja: spektroszkópia lecsengési idő (élettartam) mérés mikroszkópia szenzorok» Birch, Fluorescence detections and directions, Meas. Sci. Technol., 22, , (2011) 31

32 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Spektroszkópia fluorimetria: Szoftver forradalom automatikus vezérlés és gyors online adatelemzés Hardver oldal keveset változott: gázkisüléses lámpa + monokromátor (MC) + mintatartó + kimenő MC + PMT 32

33 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Lecsengési idő fluorometria: Másik 3 alkalmazási csoportban látványos fejlődés molekuláris területen közvetve / közvetlenül a lecsengési idő mérésén keresztül Korai fluorofór mérések: kvantumhatásfok és lecsengési idő alapján felállított mérlegegyenletekkel abszolút kvantumhatásfok (emittált/elnyelt fotonszám meghatározás nehéz) relatív kvantumhatásfok (spektrális korrekciók szükségesek) n f n emittált absz n N emittált gerj k r kr k nr Jelen irány: pontosan mérhető abszolút lecsengési időből meghatározni mindent, amit lehet (lecsengés nem feltétlenül multi-exponenciális: ps-ns komponensek) idő-korrelált fluoreszcens spektroszkópia N gerj r r 1 k nr nr, r 0 r 0,gerj ( k k r nr ( k k ) t N( t) N e k 1 k f gerj 0 ) t 33

34 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Lecsengési idő fluorometria: Kapuzásos (direkt) időmérés: nagy fotonszám esetén (analóg mintavétel) periodikus gerjesztés léptetéssel gyors t: időfelbontás / integrálási idő (érzékenység) kompromisszum Fázisfluorometria: f ( t ) e j2π F ( ) több időállandós lecsengés több gerjesztési frekvenciával mérni 34

35 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás TCSPC Time-Correlated Single Photon Counting: Feladat: időfüggő intenzitásprofil felvétele. Egyetlen gerjesztési ciklus alatt a lecsengés rögzítése problémás: 1. Lecsengési idő rövid (~100 ps ~100 ns). Pl. 500 ps élettartamot elfogadható 10 pontos rögzítéséhez 50 ps időfelbontás kell. 2. Intenzitás túl kicsi analóg mintavételezéshez (néhány foton / emisszió diszkrét jel). 3. Gerjesztési intenzitás növelése fakuláshoz vezethet.» Wahl, Tech Note TCSPC 1.2, PicoQuant GmbH, (2000) TCSPC: periodikus gerjesztés adatgyűjtés több cikluson át egyciklusú profil rekonstrukció egy-fotonos eseményekből. 35

36 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás TCSPC Time-Correlated Single Photon Counting: Start/stop számlálás alapelve CFD = Constant Fraction Discriminator TAC = Time-to-Amplitude Converter 36

37 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás TCSPC Time-Correlated Single Photon Counting: Blokkvázlat Fordított Start/stop (ne legyen várakozás, ha nincs foton) 37

38 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia: (Hagyományos fluoreszcens) Konfokális 2-fotonos Időfelbontásos FLIM fluorescent lifetime imaging 38

39 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia: Hagyományos: párhuzamos képalkotás egyidejűleg nagy látótér és felbontás Abbé-elv: x ~ / NA lat Pásztázó: pontdetektorral képsík letapogatása pontforrással tárgy letapogatása egyetlen tárgypontot kell leképezni kép elektronikus formában Konfokális: szimmetrikus: mindkét oldalon leképző lencse szinkron pásztázás mélységi felbontás: z ~ / NA 39

40 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia konfokális: reflexiós elrendezés (szinkron pásztázás automatikusan) NA nsin» Radiance Confocal Imaging Systems, Bio-Rad, (2005) 40

41 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia konfokális:» Puskár Z., SOTE Anatómiai Intézet 41

42 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia 2-fotonos: I f ~ I g 2 nagy (lokalizált) fotonsűrűség szükséges (térbeli fókusz) egy időben (időbeli fókusz) f < g Miért IR? Nincs rövid pulzus rövidebb esetén. 42

43 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia 2-fotonos:» Radiance2100 MP - Multi-photon Imaging Systems, Bio-Rad, (2005) 43

44 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia 2-fotonos (kontra konfokális): Nagyobb : behatolási mélység nagyobb: max m (konfokális ~40 m) optikai károsodás (fakulás) kisebb UV fluorofórok / élő szövet vizsgálata UV károsodás nélkül auto-fluoreszcencia vizsgálat (gerjesztés / emisszió nem fed át) 2 v. több fluorofór egyidejű detektálása (pl. kék / zöld emisszió) (konfokális: több gerjesztés + utólagos képösszerakás korrekcióval) 3D diffrakció-limitált gerjesztés: detektor pásztázás (tűlyuk) nem kell direkt detektor sejtjelölő indikátorokból származó szóródó fotonok is detektálhatók gerjesztett térfogaton kívüli háttér kisebb (~nincs) FRET analízis Időfókusz : 4D vizsgálatok (pl. FCS / FLIM) 3-fotonos gerjesztéssel több fluorofór, pl. 930 nm 465 (2P) / 310 nm (3P) 44

45 Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Időfelbontásos mikroszkópia: FLIM fluorescent lifetime imaging» Suhling et al, Time-resolved fluorescence microscopy, Photochem. Photobiol. Sci., 4, (2005) 45

46 Optikai csipesz Optikai csapda: geometriai optikai leírás (d > ) Fresnel-formulák elektromágneses leírás (d < ) Biológiai mintához: 46

47 Optikai csipesz Optikai csipesz alkalmazások: mikromanipulátor erőmérő deformáció vizsgálat Molekuláris motorok teljesítményviszonyai: normál fiziológia: G C 20 k B T = 83 pn nm /s ATP-szintetáz aktivitás: r 20 ATP/s P C 400 k B T/s motor sebesség: 800 nm/s F stop 2 pn 47

48 Optikai csipesz DVD-pickup mint optikai manipulátor:» Kasukurti et al, Single-cell isolation using a DVD optical pickup, Optics Express, 19, (2011) 48

49 BME Atomfizika Tanszék IFS Intelligens FluoroSzenzor:» Barócsi: SPICY Smart tools for Predicting of Crop Yield, KBBE211347,

50 BME Atomfizika Tanszék 2-fotonos mikroszkóp idegsejtek fiziológiás vizsgálatára: Ti:sapphyre laser X drift compensation Material dispersion precompensation Y drift compensation Angular dispersion precompensation Beam expander Drift compens. unit Y scanner AO scanner unit X scanner Angular dispersion compensation 50% ΔF/F 500ms Aspheric surface PMT 20µm Sample» Maák P., BME & Femtonics Ltd., Hungary 50