Lumineszcencia spektroszkópia

Átírás

1 Lumineszcencia spektroszkópia Elektron+vibrációs+rotációs-spektroszkópia alapjai 213. február Fizika-Biofizika II. szemeszter Orbán József PTE ÁOK Biofizikai Intézet Definíciók, törvények SPEKTROSZKÓPIAI ALAPOK ISMÉTLÉS - Spektrum típusok (abszorbciós/emissziós és vonalas/sávos/folytonos) - Fehér fény, spektrum, intenzitás frekvencia-függése - Abszorbancia (optikai denzitás, extinkció), transzmittancia, extinkciós koefficiens - Atomok szintje, foton rezonancia feltétel, LUMINESZCENCIA - Lumineszcencia típusok gerjesztés szerint / emisszió mechanizmusa szerint - Fluoreszcencia és foszforeszcencia, szinglet/triplet állapot, energetika - Időbeliség, koherencia, polarizáltság - Irányfüggés (divergencia), fotoszelekció - Sávos színkép és magyarázata, molekuláris rendszer Jablonsky termséma - Tükörszimmetria, Stokes-féle eltolódás - Élettartam, kvantum hatásfok Definíciók, törvények Lumineszcencia FLUORIMÉTER - DETEKTÁLÁS - Fluoriméter felépítése: ok (gerjesztési, emissziós), merőleges elrendezés, PMT Alkalmazások - Belső / külső fluorofórok - Molekulák vizsgálata; dinamikai, statikai szempontból - Kölcsönhatások vizsgálata További alkalmazások, módszerek - következő előadások anyaga: - Anizotrópia lecsengés, FRET, fluoreszcencia kioltás, - fluoreszcens mikroszkópia tulajdonságok Szinglet/triplet állapot Energetika Időbeliség, koherencia Irány (divergencia) Polarizáltság Szinglet és triplet állapot (molekulák) Ene ergia s = S =? h Multiplicitás: = 2 S+1 S = M = 1 S = 1 M = 3 S Abszorpció T 1 Hidrogén H 2 1 p +, 1 e - 1s H atom H gáz (H 2 ) s = S =? H atom Pauli elvnek megfelel engedélyezett átmenet Pauli elvnek ellentmond tiltott átmenet : kötő molekula pálya *: lazító molekula pálya 1

2 Hélium He 2 2 e - 1s He atom He molekula (He 2 ) s = S =? He atom Oxo-/karbonil csoport >C=O C atom C, O kettős kötés s = S = Multiplicitás: M = 2S+1 n O atom A lumineszcencia típusai A gerjesztés módja szerint: C atom Nincs eredő spin változás! n n n O atom LUMO: Lowest unoccupied MO (legalacsonyabb betöltetlen MO) HOMO: Highest occupied MO (legmagasabb betöltött MO) EM sugárzás elnyelése fotolumineszcencia kémiai reakció kemi-, biolumineszcencia termikusan aktivált ion rekombináció termolumineszcencia töltés által indukált elektrolumineszcencia nagy energiájú részecske v. sugárzás á radiolumineszcencia i i mechanikai (súrlódás) tribolumineszcencia hanghullámok sonolumineszcencia A gerjesztett állapot szerint: szinglet állapot triplet állapot fluoreszcencia foszforeszcencia A termolumineszcencia nem azonos a (fekete test) hősugárzással! Milyen időskálán zajlanak a folyamatok? Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszerre gerjesztés alapállapot 1-15 s relaxáció Fluoreszcencia 1-9 s fluoreszcencia kioltás, FRET gerjesztett állapot Foszforeszcencia 1-3 s Belső átalakulás (Internal conversion, hő) a Energia h S 2 Abszorpció Emisszió h 1. Excitáció (gerjesztés) Abszorpció (elnyelés) Energiafelvétel közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont nyel el a rendszer. 2. De-excitáció Emisszió (kibocsátás) Energialeadás közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont bocsát ki a rendszer. SPONTÁN EMISSZIÓ! 2

3 ia Energi Miért sávos a molekulák színképe? molekuláris rendszer S 2 rotációs szintek vibrációs szintek vibrációs szintek a Energia h Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszerre szinglet IC: internal conversion S Belső átrendeződés 2 VR: vibrációs relaxáció Termikus relaxáció ISC: intersystem crossing Rendszerek közti átmenet Abszorpció Emisszió h T 1 triplet elektromos szintek:,, S 2 fluoreszcencia foszforeszcencia FLUORESZCENCIA Gerjesztés Termikus relaxáció (Kasha-szabály) Emisszió - átmenet: szinglet-szinglet nincs spinátfordulás t = 1-9 s (ns) FOSZFORESZCENCIA Reakcióséma + h + h fluor Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes féle eltolódás () Int. f : s p : s Gerjesztés Termikus relaxáció Intersystem crossing (S-T) Termikus relaxáció Emisszió T 1 - átmenet: triplet-szinglet spinátfordulással (!) t = s (µs s) + h T 1 T 1 + h foszf absz. gerj. fluor. foszfor. Tükörszimmetria oka Hogyan mérjük a lumineszcenciát? Egy fluoriméter működésének elméleti sémája fényforrás gerjesztési Minta Az átmenetek mindkét esetben azonos szintről indulnak és különböző vibrációs szinteken végződnek. Fény (gerjesztés) Fény (emisszió) Elektromos jel emissziós Detektor Merőleges gerjesztési- emissziós elrendezés! Kiértékelés (PC) Source: 3

4 Fluoreszcencia mérése spektrofluoriméter steady state Fényforrás Detektor Lámpa lézer Fluoreszcencia élettartam () A molekula gerjesztett állapotból fotonemisszióval kerül vissza alapállapotba. A fluoreszcencia-élettartam az az idő, amely alatt a gerjesztett állapotban levő molekulák száma az e-ed részére csökken. τ= 1 / (k f + k ic + k isc )= 1 / (kf + knr ) ns-os tartomány Polarizátorok / Szűrők ahol k nr = k ic + k isc Gerjesztési (λ gerjesztési ) Minta küvetta Emissziós (λ emissziós ) kf - a fluoreszcencia-átmenet valószínűsége ic - internal conversion (belső konverzió) isc - intersystem crossing (rendszerek közti átmenet) nr - nonradiativ (sugárzás nélküli átmenet) Fluoreszcencia kvantumhatásfok Q = N emit. / N abs. < 1 Q = k f / (k f + k ic + k isc )= k f Polarizált fény, abszorpciós vektor, elektromos vektor Elektromos dipolmomentum Elektromágneses hullám elektromos térerősség vektora, rezgési sík Síkban ill. lineárisan polarizált fény Az alábbi animáció egy vízszintes síkban polarizált hullámot mutat be. Az animáció egy függőleges síkban polarizált hullámot mutat be. A metszősíkot szemből nézve az alábbi kép tárul elénk: Ha az elektromos térerősség vektora a tér valamely, a fénysugár vonalában lévő, rögzített pontjában egy egyenes mentén rezeg, akkor síkban vagy lineárisan polarizált hullámról beszélünk. A metszősíkot szemből nézve 4

5 Elektromos és abszorbciós vektorok Elektromos térerősség vektor Abszorbciós vektor meghatározza az abszorbció valószínűségét A kúpon belüli abszorpciós vektor esetén a fluorofor gerjesztésének valőszínűsége nagyobb, mint 5%. (függőleges polariáció esetén) forgáskúp!!! Abszorpció maximális, ha az abszorpciós vektor és a fény elektromos térerősség vektora párhuzamos. Abszorpció képessége függ cos 2 θ-tól (θ az absz. vektor és a fény elektromos térerősség vektora közötti szög). Fotoszelekció fluoroforok random orientációjú populációja izotróp: irányfüggetlen Minden irányban azonos. polarizálatlan fény vertikálisan polarizált fény Véletlenszerű, izotróp eloszlás Anizotróp eloszlás fotoszelekció = rendezett orientációjú szubpopuláció szelektálódik Ismétlés: Fehérjék abszorpciója - aminosavak Fluorofórok A három fontos aminosav, amelyek UV-ban abszorbeálnak, azaz gerjeszthetők. ció extinkc hullámhossz Fluorofórok fluoreszcenciára alkalmas kémiai anyagok 1. Intrinsic, natív (belső) fluorofórok Fehérjékben: aromás aminosavak Előny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszert. Élő sejtek saját fluoreszcenciája Aequorea victoria GFP (green fluorescent protein) szalagdiagrammja 5

6 Kémiai módosításokkal egy alapvegyület abszorpciója és emissziója hangolható! Extrinsic (külső) fluorofórok - fluoreszcens festékek A jelölő kémiai anyagok minősége és elhelyezkedése tervezhető. A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez köthetjük. (pl.: cisztein, glutamin, lizin) A fehérje aktivitását tesztelni kell. IAF IAEDANS PIRÉN példák: IAEDANS-IAF: FRET donor-akceptor pár Pirén: aktin polimerizáció fluoreszcein, dansyl, rhodamine száramzékok... Aktin monomer szalagdiagramja Kémiai háttér Könnyű gerjeszteni az elektronokat, ha Aromás gyűrűben, vagy Konjugált kettős kötésű rendszerben találhatók. R Külső (extrinsic) fluorofór alkalmazásakor: makromolekula fluorofór A kromofór (fluorofór) lokális mozgása elkülöníthető a molekula egészének mozgásától. Minél több kettős kötés van a molekulában, annál kisebb kell a gerjesztéshez! Hangolható, tervezhető! Térszerkezeti változás a makromolekulában hat a kromofór mozgására is. Ez a változás mérhető. Fluoreszcencia alkalmazási lehetőségei Jól detektálható jel (alacsony koncentrációjú minták esetén is). A fluoreszcencia paraméterek érzékenyek a környezeti tényezők megváltozására. A molekuláris szintű vizsgálatok fontos eszköze Szerkezeti és dinamikai információt ad a vizsgált rendszerről. Biológiai rendszerek vizsgálata (nem károsítjuk a vizsgálandó rendszert). Molekulák közötti és molekulán belüli kölcsönhatások tanulmányozása. Molekuláris mozgások vizsgálata (polarizáció, anizotrópia). Molekuláris szintű távolságmérés (FRET). Molekulák rugalmasságának jellemzése (FRET). Molekula szerkezeti részleteinek, és az egyes csoportok elérhetőségének feltérképezése (quenching). További alkalmazások: Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata Fehérje denaturáció nyomonkövetése Protein-ligand kapcsolat vizsgálata Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (ph, ionok) változásának függvényében Dinamikus tulajdonságok vizsgálata Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról 6

7 A fluoreszcencia élettartam KIEGÉSZÍTÉS Fluoreszcencia lecsengési görbe A fluorofórok sajátsága, jele: Fény-anyag kölcsönhatás: hullámhossz - szintek Emisszió típusok tulajdonságai Indukált A beérkező fotonnal Egy időben (azonnal) koherens Egyező irányban (kis divergencia) Azonos hullámhossz monokromatikus LASER Spontán (a foton abszorpcióhoz képest) Időben késleltetve nem koherens Minden irányban (3D) nem azonos nem monokrom. Kisebb energiájú LUMINESZCENCIA I Az emisszió gerjesztési hullámhossztól való függése Ha a megvilágító fény λ 2 (optimális gerjesztési hullámhossz), akkor nagy mennyiségű gerjesztett elektront kapunk a sok elnyelt foton következtében. Ennek hatására nagy intenzitású emissziót kapunk ( széles spektrális tartományban. Ha a fény λ 1 (nem optimális gerjesztési) hullámosszúságú, akkor kevesebb abszorbeált foton, kevesebb gerjesztett elektront eredményez. Így alacsonyabb lesz az emisszió intenzitása.. DE! Az emisszió spektrálid eloszlása nem változik. magyarázat: valószínűség, Kasha szabály λ 1 λ 2 λ (nm) 7