Fluoreszcencia spektroszkópia

Átírás

1 Fluoreszcencia spektroszkópia A fény: elektromágneses hullám Huber Tamás Biofizika szeminárium PTE ÁOK Biofizikai Intézet február

2 Elektromágneses spektrum Lumineszcencia: gerjesztett állapotú rendszer fény kibocsátása. Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük. 2

3 A lumineszcencia típusai Kemilumineszcencia - Fotolumineszcencia 1. Kemilumineszcencia olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott kémiai reakció során felszabaduló energiából adódik pl.: foszfor (P) oxidáció útján való világítása alkalmas anyagcsere folyamatok vizsgálatára kis intenzitású fiziológiás viszonyoktól függő 3

4 Biolumineszcencia: a kemilumineszcencia egyik típusa, amikor a gerjesztő energiát biztosító kémiai reakció élő organizmusban játszódik le. pl.: szentjánosbogár, mélytengeri halak, medúzák, polipok, baktériumok, planktonok 2. Fotolumineszcencia olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott hullámhosszú (frekvenciájú, energiájú) fény besugárzásából adódik alkalmas molekuláris rendszerek vizsgálatára, mert jelentős információt hordoz a molekula tulajdonságairól, kölcsönhatásairól, környezetével való kapcsolatáról 1. A luciferáz katalizálja a luciferin oxidációját. 2. Inaktív oxyluciferin és fény (h ) keletkezik. 3. A további luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik. Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek két típusa: fluoreszcencia, foszforeszcencia 4

5 Jablonski-féle termséma Kasha-szabály bizonyítéka: Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik. Alap és gerjesztett állapot természetétől függően: Fluoreszcencia: a molekula szingulett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba Foszforeszcencia: a molekula triplett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba Megkülönböztetésük: - spektrumuk alakja, - gerjesztett állapot időtartama szerint. 5

6 Az S 1 -S 0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában: a. Fluoreszcencia Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba Lecsengése: s nagyságrendű b. Foszforeszcencia S 1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T 1 triplett állapotba kerül ebből sugárzási energia kibocsátásával kerül S 0 alapállapotba (tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínűséggel) Lecsengése: s c. Késleltetett fluoreszcencia T 1 állapotból termikus gerjesztéssel S 1 állapotba, majd onnan S 0 - ba ( magas hőmérsékletű foszforeszcencia ) A lumineszkáló anyagot jellemzi: Abszorpciós spektruma, valamint fluoreszcencia, foszforeszcencia gerjesztési és emissziós spektruma Sugárzás kvantumhatásfoka Gerjesztett állapot élettartama Emisszió polarizációfoka (anizotrópiája) 6

7 A fluoreszcencia mérésének alapelvei Legfontosabb probléma: a gerjesztő fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése. A gerjesztési és észlelési irányok célszerű megválasztása 1. Az észlelés iránya merőleges a gerjesztés irányára. 2. Az gerjesztés és az észlelés iránya párhuzamos. A minta elülső oldaláról kilépő fluoreszcenciát érzékeljük. Három elrendezési lehetőség 3. A minta gerjesztésével szemközti oldalon, azaz lineárisan detektálunk.!! Fényszűrők, monokromátorok!! 7

8 Hogyan mérünk fluoreszcenciát? A gerjesztési spektrum fényforrás ( steady-state eset) hullámhossz választás minta Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk. Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik. hullámhossz választás Gerjesztés detektor Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok Sir George Gabriel Stokes, 1 st Baronet ( ) 8

9 Az emissziós spektrum Az első szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjéről az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik. Kémiai denaturáció hatása a gerjesztési és emissziós spektrumra Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszeréről. GuHCl 9

10 Foszforeszcencia emissziós spektrum Fluoreszcencia élettartam Az az időtartam, amely alatt a gerjesztett állapotban található molekulák száma e-ad részére csökken. = 1 / (k f + k össz ) f : fluoreszcencia össz : f + vibr. + rot. (azaz f + non-radiatív) Az első triplett gerjesztett állapotból a szinglett állapotba való átalakuláskor. Szobahőmérsékleten csak kristályos anyagokon. (oldatban: kioltók pl. O 2 ) A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltolódott. 10

11 Kvantumhatásfok fluoreszcencia során kibocsátott és elnyelt fotonok számának hányadosa. Fluoreszcencia élettartam mérése idő-függő mérés /time domain measurement/ Q= N emitt / N absz < 1 - kifejezhető a sebességi állandók hányadosaként is: Q = k f / (k f + k össz ) rövid gerjesztő impulzusok (~ fs) Fotonok detektálása időablakokban Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz. 11

12 Fluoreszcencia intenzitás (cps) Intenzitás Időkorrelált egy-foton számlálás /TCSPC/ 1000 PEVK11 IAEDANS Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) PEVK21 IAEDANS Modulált gerjesztés (frekvencia ~20 / 80 MHz) Eltelt idő 10 Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz Idő (ns) 12

13 Intenzitás Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) Demoduláció (modulációs mélység) Fáziskülönbség Fluoreszcens festékek natív vagy intrinsic fluorofórok: Triptofán, tirozin, fenilalanin Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét. Emisszió rövid élettartamé (pl. 1 ns) Emisszió hosszú élettartamé (pl. 10 ns) Modulált gerjesztés (50 MHz) Eltelt idő 13

14 Extrinsic (külső) fluorofórok Direkt jelölés festékekkel: Danzil Rodamin IAEDANS IAF FITC Fluoreszcensen jelölt toxinokkal: Falloidin B-skorpiótoxin A-bungarotoxin Makrofágok Aktin jelölve falloidin- Alexa 568-cal (Piros) Magok: DAPI (Kék) Streptococcus aureus (Zöld) 14

15 A fehérjék fluoreszcens jelölése - A jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - Így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell. Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémiai jelölés) Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert molekula felszínéhez (epitóp) Monoklonális és poliklonális antitestek Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve Indirekt jelölés: az elődleges antitest jelöletlen, a másodlagos antitest van megjelölve 15

16 Foszforeszcencia mérése A foszforoszkóp A gerjesztő fény a foszforeszcencia fénytől időben elkülönüljön Az intenzitás időbeli változása is mérhető legyen Mindig alacsony hőmérsékleten kell mérni Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyővel eltakarjuk, ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény. A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztő fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik függ: a forgási sebességtől a nyílások számától Gyakorlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű Negyedfordulat után a gerjesztő fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén 16

17 A minta Általában oldat (fehérje, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió) A küvetta anyaga ne fluoreszkáljon! Üvegküvetta (látható tartomány) Speciális üvegküvetta (λ > 300 nm) Műanyag küvetta Speciális kvarcküvetta (fluoreszcencia mérésre) Küvetta tartó berendezések: Temperálható (több féle módon) Több (ált. 4) minta, forgatható Gerjesztő fényforrások A mesterséges fényforrások által kibocsátott fény lehet: Folytonos-, (magas hőmérsékletre hevített anyag) Halogéntöltésű izzószálas lámpák. Nagy nyomású gázokkal töltött lámpák. Vonalas-, (atomok) Intenzív, monokromatikus fény állítható elő. Alacsony nyomású higanygőzzel töltött gázkisülési cső. Stb. 17

18 Optikai szűrők Szelektivitás bizonyos hullámhosszúságú fényre Abszorpciós filterek Általában üvegből készülnek. Szerves vagy szervetlen összetevőket tartalmaznak, emiatt bizonyos hullámhosszúságú fénysugarakat átengednek, míg másokat nem. Műanyag (olcsóbb, könnyebb) Dikroikus tükrök Optikai szűrők Ultraibolya (UV) filterek: Az ultraibolya-fényt nem engedik át, de hosszabb hullámhosszúakat igen. Neutrális szűrők: Transzmissziójuk széles színképtartományban a hullámhosszúságtól független. A gerjesztő fény intenzitásától függő fotokémiai, fotobiológiai folyamatok tanulmányozhatók. Interferencia szűrők: Akkor használjuk, ha a folytonos színképű fényből viszonylag keskeny sávot akarunk kiválasztani. Vonalas színképű gerjesztő fényből meghatározott hullámhosszúságnál fellépő vonalat kell elkülönítenünk. Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ. 18

19 Optikai szűrők Longpass-filterek (Felüláteresztő szűrők) Optikai szűrők Magasabb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Általában éles csúcs jellemzi őket. Fluoreszcens mikroszkópiában a dikroikus tükrök emissziós filterekként használatosak. Shortpass filterek (Aluláteresztő szűrők) Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek. Rövidebb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Dikroikus tükrök excitációs filterek-ként használatosak. Bandpass filterek (Sáv szűrők) Előző kettő kombinációja. Általában alacsonyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél. A kiválasztott intervallumon kívül teljesen blokkol minden más hullámhosszú fényt. 19

20 Monokromátorok A detektor Fotoelektron-sokszorozó cső (Photomultiplier tube) A: Fényforrás B: Rés C: Kollimátor D: Prizma vagy rács E: Tükör F: Excitációs rés G: Minta Nagyon szenzitív érzékelők az ultraibolyától a közeli infravörös tartományig. A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei: - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluoreszcencia érzékeny a környezetre 20

21 Köszönöm a figyelmet! 21