Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek"

Virág Pataki
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek

Fotonok és molekulák ütközése Fény (foton) ütközése a

-Az elnyelt energia átalakul: - Hő - Fluoreszcencia -

2 Fotonok és molekulák ütközése Fény (foton) ütközése a molekulákkal fényszóródás abszorpció E=hν Fényelnyelés: -Egy foton energiája -> molekula energiája ( E = h / ). -Az elnyelt energia átalakul: - Hő - Fluoreszcencia - Foszforeszcencia Jablonski diagramm - Fluoreszcencia kioltás és fluoreszcencia rezonancia energia transzfer

3 A gerjesztett állapotú elektron lecsengési lehetőségei Gerjesztés Fluoreszcencia 10-9 s Foszforeszcencia 10-3 s k f k ph s Alap állapot Relaxáció Gerjesztett állapot k q k ic Kioltás vagy Energia transzfer Internal conversion (HŐ)

4 Fluoreszcencia alapfogalmak Intenzitás: az időegység alatt emittált fotonok számával arányos. Kvantumhatásfok: Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra. A kibocsátott fotonok száma, osztva az elnyelt fotonok számával. Q f k f k f k nr Élettartam: az az időtartam ami alatt az intenzitás az részére csökken le. e-ed 1 k f k nr

5 Minta Gerjesztési monokromátor Fényforrás Emissziós monokromátor Detektor A detektálás a gerjesztés síkjára merőlegesen történik!!!

6 Fluoreszcencia Anizotrópia Izotróp rendszer: Irányultság szempontjából homogén rendszer. Anizotróp rendszer: olyan rendszer, melyben vannak kitüntetett irányok. Polarizált fény: Elektromos térerősség vektor síkja a fény terjedése során nem változik. Fluoreszcencia anizotrópia: Polarizált fény segítségével az izotróp fluorofór populációt anizotróppá alakítjuk át.

7 Polarizált fény Nem polarizált fény Polarizátor Polarizált fény Polarizált fény: Elektromos térerősség vektor egy jól definiált síkban rezeg.

8 Polarizált fény abszorpciója Abszorpciós vektor: meghatározza a polarizált fény abszorpciójának valószínűségét.

9 Fotoszelekció Csak a megfelelő orientáltságú abszorpciós momentummal rendelkező fluorofórok gerjesztődnek a mintában! A fotoszelekciónak megfelelően, a gerjesztett állapotú fluorofórok a z tengely köré rajzolható igen kis kúpszögű (ϑ) forgás-kúpon belül helyezkednek el.

10 Anizotrópia meghatározás A vertikális és horizontális síkban mért intenzitások segítségével lehet meghatározni az anizotrópiát! r I I vv vv I 2I vh vh

amely alatt az emissziós vektor elfordul.

11 Perrin egyenlet (Francis Perrin-1926) Az anizotrópia mértéke függ a rotációs diffúziótól és az élettartamtól, amely alatt az emissziós vektor elfordul. Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúziós képességéről ad információt!

12 Anizotrópia A fluoreszcencia anizotrópia a tér három irányába emittáló fluorofórt jellemzi, vagyis az emissziós polarizáció mértéke, mellyel a molekulák rotációját lehet kimutatni. Ha a fluorofór x irányba terjedő, x-z síkban vertikálisan polarizált fénnyel világítjuk meg, a fotoszelekció következtében a vertikálisan elhelyezkedő fluorofór molekulák gerjesztődnek, és a gerjesztett állapotú fluorofórok a rotációjuk következtében a z tengely köré rajzolható forgáskúpon belül helyezkednek el. dimenziónélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja additív!!! Normál érték: -0,2 és 0,4 között van. Ha ettől eltérőt mérünk az valami műtermék, hiba (pl.: fényszórásból).

13 Akalmazás Molekulák rotációs diffúziójának meghatározása Molekulák közti interakciók detektálása Konformácós változások észlelése Membránok fluiditásának meghatározása

14 Fluoreszcencia kioltás A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében, melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő fluorofórral ütközve annak gerjesztési energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják (például hő). Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió. Fluoreszcencia intenzitás lecsökken!

15 Kinint kioltjuk klorid ionnal. Nem fog fluoreszkálni a minta. Kinin fluoreszcenciája kéken világít

16 1. Statikus kioltás Kioltás típusai A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy komplexet (sötét komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt emittálni. Diffúzió által nem befolyásolt! Fluoreszcencia élettartam nem érzékeny rá! + : Nincs emisszió Fluorofór Kioltó Sötét komplex (a gerjesztés előtt jön létre) Gerjesztés

17 2. Dinamikus kioltás A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok révén egymás közelébe kerülnek, egy ütközési komplexet hoznak létre, majd a gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak. Diffúzió által befolyásolt Fluoreszcencia élettartamot csökkenti! Fluorofór F 0 /F= 0 / + : + Kioltó h*υ Gerjesztés Ütközési komplex (a gerjesztés után jön létre) Fluorofór Kioltó

18 Stern-Volmer egyenlet ( a kioltás mértékének kvantifikálása) Max Volmer ( ) Otto Stern ( ) Fizikai Nobel díj (1943)

19 Stern-Volmer egyenlet Ha a fluorofór élettartamát vizsgáljuk a kioltó koncentrációjának a függvényében, akkor lineáris összefüggést kapunk: 0 D 1 k q 1 K q 0 SV τ 0 kioltó távollétében az élettartam τ D kioltó jelenlétében mért élettartam K + - állandó, mely jellemzi a fluorofór és a kioltó transzportját valamint a hozzáférhetőséget. K sv egyenes meredeksége, Stern-Volmer állandó

20 Stern-Volmer egyenlet F0 1 K [ Q] sv F F 0 : fluoreszcencia intenzitás a kioltó hiányában F : fluoreszcencia intenzitás a kioltó jelenlétében K sv : Stern-Volmer állandó *Q+ : kioltó koncentrációja

21 Stern-Volmer állandó(k sv ) A fluorofór hozzáférhetőségéről ad információt! Dinamikus kioltás K sv =k q * τ 0 k q : bimolekuláris sebességi állandó, ami a fluorofór és a kioltó diffúziós képességével, illetve a fluorofór hozzáférhetőségével áll összefüggésben k q = 1x10 10 M -1 s -1 k q < 1x10 10 M -1 s -1 k q > 1x10 10 M -1 s -1 diffúzió kontrollált sztérikus lefedettség kötés

22 Módosított Stern-Volmer egyenlet (Lehrer-egyenlet) A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén!

23 Hogyan dönthető el milyen típusú kioltásról van szó? Dinamikus kioltás Statikus kioltás

24 Kioltók típusai 1. Semleges kioltók: akrilamid, nitroxidok sztérikus viszonyok feltérképezése 2. Töltéssel rendelkező kioltók: jodid, cézium, kobalt Töltés viszonyok meghatározása

25 Alkalmazás Fehérjék folding -jának vizsgálata Fehérjék konformációs állapotának és töltés viszonyainak feltérképezése Membránok permeabilitása Diffúziós állandók meghatározása Ld: később

26 Triptofán fluoreszcenciájának kioltása akrilamiddal

követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli

27 Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET) - Theodor Förster, 1948 A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula emissziója révén valósul meg! k t ~1/R 6 E R

28 A FRET feltételei Fluoreszcens donor és akceptor molekula. A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm! Megfelelő orientáció Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között.

29 A FRET molekuláris mechanizmusa

30 Hogyan határozható meg a transzfer hatásfok? τ DA : élettartam az akceptor jelenlétében τ D : élettartam az akceptor hiányában F DA : fluoreszcens intenzitás az akceptor jelenlétében F D : fluoreszcens intenzitás az akceptor hiányában Donor emissziója csökken! Akceptor emissziója nő!

31 Energia transzfer hatásfok a donorakceptor távolság függvényében E R 6 0 R 6 0 R 6 Förster féle kritikus távolság (R 0 ): Az a donorakceptor távolság, aminél a transzfer hatásfok 0.5

32 Förster féle kritikus távolság donor-akceptor pároknál

33 Energia transzfer típusai Heterotranszfer: különböző fluorofórok között jön létre. Homotranszfer: azonos fluorofórok között jön létre, melyeket kis Stokes eltolódás jellemez. Homotranszfer Heterotranszfer

34 Összefoglalás FRET távolságok meghatározására alkalmas megfelelő donor akceptor párok esetén. Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása. Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.

35 FRET alkalmazások Fehérjék interakciója Makromolekulák asszociációs vizsgálata (pl. DNS) Távolság mérés (molekuláris mérőszalag) Fehérjék konformációs vizsgálat

36 Gyakorlati alkalmazások Aktin monomer Milyen a nukleotid kötő zsebben található fluorofór hozzáférhetősége? Nukleotidkötő-zseb ε-atp ε-atp Cofilin Profilin

37 Gyakorlati alkalmazások FRET Fehérjék konformációs változása

38 Fehérjék interakciója Gyakorlati alkalmazások FRET

Hasonló dokumentumok

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Biofizika szeminárium PTE ÁOK Biofizikai Intézet Huber Tamás 2014. 02. 11-13. A gerjesztett állapotú elektron lecsengési lehetőségei Gerjesztés Fluoreszcencia