Komplex egyszerű Aktin alapú mikrofilamentum rsz. Hogyan vizsgálhatunk folyamatokat? Komplex egyszerű S E J T

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Komplex egyszerű Aktin alapú mikrofilamentum rsz. Hogyan vizsgálhatunk folyamatokat? Komplex egyszerű S E J T"

Éva Pintérné
5 évvel ezelőtt
Látták:

Biofizikai módszerek a citoszkeleton vizsgálatára I.

Április Aktin citoszkeleton Mikrotubulusok Intermedier filamentumok Komplex egyszerű Aktin alapú mikrofilamentum rsz.

com/nature/journal/v422/n6933/fig_tab/nature1598_f1.html Abszorpció és Emisszió atomoknál 1.

emisszió állapot: alapállapot gerjesztett állapot állapot: gerjesztett állapot alapállapot E abs = hn E em = hn folyamat: (foton)

1 Biofizikai módszerek a citoszkeleton vizsgálatára I. Kinetikai, steady-state módszerek, spektroszkópiai vizsgálatok Komplex egyszerű S E J T A citoszkeletális rendszer Orbán József, 213 Április Aktin citoszkeleton Mikrotubulusok Intermedier filamentumok Komplex egyszerű Aktin alapú mikrofilamentum rsz. Hogyan vizsgálhatunk folyamatokat? * in vivo / in vitro * szabad szemmel / spektroszkópiával Abszorpció és Emisszió atomoknál 1. abszorpció Abszorpció és Emisszió atomoknál 2. emisszió állapot: alapállapot gerjesztett állapot állapot: gerjesztett állapot alapállapot E abs = hn E em = hn folyamat: (foton) Abszorpció (elektron) Excitáció (gerjesztés) A foton abszorpciója és az elektron gerjesztése egyszerre zajlik le! folyamat: (elektron) De-excitáció (visszagerjesztés) (foton) Emisszió Az elektron alapálla-potba visszatérése és a foton emissziója egyszerre zajlik le! Az abszorbált és az emittált foton energiája azonos és megegyezik az alapállapota és a gerjesztett állapota közötti energiakülönbséggel! 1

2 filamentum Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer működésének elméleti sémája Hogyan mérünk az fluoreszcenciát? Egy fluoriméter működésének elméleti sémája fényforrás monokromátor (rács v. prizma) Minta Detektor 1 fényforrás gerjesztési monokromátor Minta Referencia csatorna Referencia (blank) Detektor 2 emissziós monokromátor Fény Elektromos jel Kiértékelés (PC) Fény Elektromos jel detektor Kiértékelés (PC) A mérés során hullámhosszonként határozzuk meg az abszorbancia értékét egy széles (spektrális) tartományban. A mérés során hullámhosszonként határozzuk meg az abszorbancia értékét egy széles (spektrális) tartományban. Milyen paraméterek mérhetők? aktin Mire következtethetünk az eredményekből? TÉR: molekula szerkezet (változás) IDŐ: kölcsönhatás dinamika monomer pozitív / szakállas vég Komplex egyszerű AKTIN FILAMENTUM 1. nukleáció 2. elongáció 3. dinamikus egyensúly pozitív / szakállas vég Funkciók 1. aktív nukleáció 2. elongáció 3. dinamikus egyensúly negatív / hegyes vég negatív / hegyes vég (assembly) nucleation factor capping (sapkázás)? 2

filamentum pozitív / szakállas vég negatív / hegyes vég Funkciók (aktív) nukleáció capping (sapkázás) severing (elvágás) szekvesztrálás (elvonás/megkötés) profilin (-szerű aktin kötés) Treadmilling :

3 filamentum pozitív / szakállas vég negatív / hegyes vég Funkciók (aktív) nukleáció capping (sapkázás) severing (elvágás) szekvesztrálás (elvonás/megkötés) profilin (-szerű aktin kötés) Treadmilling : taposómalom - Capping Barbed-end () growth ATP ADP profilin assembly factor nucleator CP ATP Pointed-end (-) depolymerization ADF ADP Tb Sequestration 1. Spontaneous assembly 2. Facilitated assembly Arp2/3 complex machinery: autocatalytic branching Formins: nucleation and processive elongation WH2-domain nucleators Severing ADF Profilin CP Tβ - adapted from Renault L. Bugyi B. Carlier MF. Trends in CB Az aktin kötő profilin molekula Röntgen diffrakciós 3D szerkezet. biokémiai bizonyítékok! Aktin kötő WH2-szerű Tb4 molekula Röntgen diffrakciós 3D szerkezet. biokémiai bizonyítékok! Profilin kötés esetén: csökkent polimerizációs sebesség a profilin-aktin komplex csak a filamentum szakállas () végéhez tud kötni Tb4 kötés esetén: gátolt polimerizáció az aktin monomer (komplex) állapotban marad (= szekvesztrált) Irobi, EMBO J., Sep. 24 Reaction kinetics k A B AB k és k - az összekapcsolódás és szétválás sebességi állandója egy kétirányú, egyensúlyi reakcióban Aktin jelölési helyek gln 41 K D k - A B AB A sebesség függ: A molekulák kémiai tulajdonságaitól koncentrációktól hőmérséklettől katalizator / inhibitor jelenlététől K D, disszociációs állandó d a szabad (A, B) és a komplex (AB) molekulák koncentrációja alapján számolható. staedy state dinamikus egyensúly! monomer cys 374 3

B Pyrene N-(1-Pyrene) iodoacetamide FITC Fluorescein isothiocyanate (De)Polimerizációs folyamat IAEDANS

folyamat: quenching (struktúra) folyamat: FRET (struktúra) Alexa Fluor 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl

egyensúly) Fss ( M),8,6,4,2 [actin] 1,,5,25, 5 1 15 2 25 3 VopF concentration (nm) depolymerization by

depolymerization change in critical concentration 3 WH2 domains barbed end binding?

1 M AEDANS actin Data 1 DI/DI max 1,8,6,4,2,5 1 1,5 2 2,5 3 A [VopF] K d =.

4 B Pyrene N-(1-Pyrene) iodoacetamide FITC Fluorescein isothiocyanate (De)Polimerizációs folyamat IAEDANS 5-({2-[(iodoacetyl)amino]ethyl}diamino)naphthalene-1-sulfonic acid folyamat: kötés (esszé) vagy anizotrópia folyamat: quenching (struktúra) folyamat: FRET (struktúra) Alexa Fluor 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester (De)Polimerizációs folyamat 1, szekvesztrálás (VopF) steady state Steady state mérések (dinamikus egyensúly) Fss ( M),8,6,4,2 [actin] 1,,5,25, VopF concentration (nm) depolymerization by [VopF] plateau reached at G- actin level slight increase at low [VopF] sequestration of G-actin max. depolymerization change in critical concentration 3 WH2 domains barbed end binding? G-aktin kötés AEDANS jelölt G-aktin, fluoreszcencia intenzitás 1,2 1.1 M AEDANS actin Data 1 DI/DI max 1,8,6,4,2,5 1 1,5 2 2,5 3 A [VopF] K d =.3 M % -nyi intenzitás kioltás (quenching) az AEDANS fluoreszcencia intenzitásából 1:2 VopF:actin ratio high affinity 3 WH2 domains! Folyamatok - kinetika 1.1/2.2 M 9% AEDANS labeled actin, varied VopF, in G buffer, ph7.8 4

Polimerizációs esszé 2 M 1% pirén jelölt aktin (változó VopF koncentráció, Vibrio cholerae fehérje) Nukleáció vagy elongációs sebesség

AEDANS intensity (au) AEDANS aktin VopF kötési kinetika stopped flow 1, [VopF V] 9,75 ( M) 9,5.2.4 9,25.6 9,.8 1.5 8,75 1. 8,5 2.

Stopped flow (megállított áramlás) Klasszikus kémia Quench flow Stopped flow 1 1-3 1-6 1-9 1-12 s ms s ns ps József Orbán Flash

kinetikai módszerek előnyei Biológiai folyamatok időbelisége (sec nap év) Biokémiai reakció kinetika gyors: ms- s tartomány

5 Polimerizációs esszé 2 M 1% pirén jelölt aktin (változó VopF koncentráció, Vibrio cholerae fehérje) Nukleáció vagy elongációs sebesség növekedés? -1 nm polimerizáció seb. állandó plató szint 1 - nm polimerizáció seb. steady state szint aktin szekvesztrálás! AEDANS intensity (au) AEDANS aktin VopF kötési kinetika stopped flow 1, [VopF V] 9,75 ( M) 9, ,25.6 9, , ,5 2. 8, ,,,5 1, 1,5 2, time (s) Time scale of fast-kinetic methods Gyors kinetikai módszerek pl. Stopped flow (megállított áramlás) Klasszikus kémia Quench flow Stopped flow s ms s ns ps József Orbán Flash photolysis Surface plasmon resonance Single photon counting Institute of Biophysics Példa: aktin miozin kölcsönhatási ciklus A gyors kinetikai módszerek előnyei Biológiai folyamatok időbelisége (sec nap év) Biokémiai reakció kinetika gyors: ms- s tartomány protein-protein és enzim-ligand asszociációs- és disszociációs kinetika K D : disszociációs konstans, K: asszociációs konstans, A: affinitás meghatározás Aktin polimerizációs / depolimerizációs kinetika 5

6 Aktuális koncentráció Initial rate Stopped flow 3. STOPPING the flow Kezdeti koncentráció,8 kezdeti sebesség STOP! DRIVER,6,4 B A,2,4 absorption t = o fluorescence, scattering Mixer Light source Idő,3 v max,2,1 K m Initial concentration 6

Hasonló dokumentumok

Sejt. Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég 1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly

Sejt. Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég 1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly Biofizikai módszerek a citoszkeleton vizsgálatára I: Kinetikai és steady-state spektroszkópiai módszerek Sejt Citoszkeletális rendszerek Orbán József, 2014 április Institute of Biophysics Citoszkeleton: