Modern Biofizikai Kutatási Módszerek Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry)

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "2011.11.25. Modern Biofizikai Kutatási Módszerek 2011.11.03. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry)"

Benjámin Katona
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 Modern Biofizikai Kutatási Módszerek Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék, pl. biológiai sejtek egyedi tulajdonságait fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit - tudjuk lemérni Flow Sorting Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják (Valójában helytelenül). 1

2 Áramlási citométer baktériumok detektálására aeroszolban A fejlesztés a II. Világháború idején történ, 1947-ben publikálták A cél a levegőben terjedő baktériumok gyors detektálása volt, a biológiai fegyverek kimutatására Készülék: Egy sötét-látóteres mikroszkóp cellájában áramoltatták a szűrt levegőt. A lámpa a Ford autógyár reflektor-lámpája volt, detektálásra PMT-t használtak ban szabadalmaztatott technika Az elektromos vezetőképesség (ellenállás) változásait detektálta miközben a sóoldatban (pufferben) szuszpendált sejtek áthaladnak egy vékony nyíláson. Az első sejt szorter. A fényszórást HeNe lézerrel mérte. A fluoreszcenciát detektáló modell elődje. Photo by J.Paul Robinson Photo by J.Paul Robinson A szabadalmi bejelentés kézirata Az első kereskedelmi forgalomba került számláló (Coulter Counter) 2

áramoltatták a szűrt levegőt. A lámpa a Ford autógyár reflektor-lámpája volt, detektálásra PMT-t használtak.

3 A sejtek elválasztása térfogatuk alapján történ, a Coulter counter elv szerint. A kiválasztott sejtek elkülönítése elektrosztatikus eltérítéssel történt (a nagysebességű szorting alapja ma is ez). A felhasznált elv: Tintasugaras nyomtató (Richard Sweet, Stanford, 1965). Neutrofil sejteket és limfocitákat tudtak elválasztani vérből. Részecskék sejtek - számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék, sejtek elkülönítése számú részecske mérése 1 percen belül Részecskék fényszórásának és/vagy belső fluorescenciájának mérése Sorting: egyedi részecskék elkülönítése A részecskék egy hidrodinamikailag fókuszált folyadékáramban haladnak át egy gerjesztő fénynyalábon (lézer, Hg-gőz lámpa, stb.) Fény szórásjelek detektálása Specifikus fluoreszcencia detektálása Multiparaméteres adat analízis Electrosztatikus vagy mechanikus részecske szeparálás: szorting Fényforrás Áramlási rendszer (folyadék) Optikai rendszer Detektáló rendszer Adatgyűjtés Adat analízis Szorting 3

Részecskék sejtek - számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék, sejtek elkülönítése 10 5-10 6 számú részecske mérése 1 percen belül Részecskék

4 A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak,ahol a lézer megvilágítja őket. 4

Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére

5 A piezoelektromos kristály rezgése cseppekre bontja a folyadékoszlopot. A cseppeket a mért fényszórás és fluoreszcencia jelek alapján töltik fel pozitív vagy negatív töltéssel. Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek ( , 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak Detektáló rendszer Fotomultiplier csövek (PMTs) Régebben 1-2 cső Jelenleg akár db. Fotodiódák Többnyire az előre irányuló szórás (FSC) mérésére 5

Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe,

6 6

7 SSC=Oldalszórás (sejtgranuláltság) FSC=Előreszórás (sejtméret) 7

8 FSC SSC FITC Lézer késleltetés APC Jelszélesség: Csúcsmagasság: számérték Terület: Mintavételek száma A legnagyobb A számok összege Nincs holtidő!!! 8

elváltozásoktól,differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik Áramlási citometriás célra az

9 A leukociták és (más sejtek) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén,ami függ A sejtek típusától A sejtek differenciálódási stádiumától A sejtek aktivációjától, inaktivációjától A sejtek egyéb funkcionális állapotától A kóros elváltozásoktól,differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik Áramlási citometriás célra az antitesteket fluoreszcencen jelöljük: direkt, indirekt Single fluoreszcens festékkel Önálló (Single) festékek Tandem festékek Tandem festékkel Akceptor Donor Akceptor Donor 9

10 Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb átfedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció) Kvantumhatásfokuk, abszorpciós együtthatójuk legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység) Aspecifikus kötődésük legyen kicsi Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file 10

kötődésük legyen kicsi Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula

11 Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg 2. Density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti. Az összes lemért FL4 eloszlása. 3. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze. 4. 3D (surface,felszín) ábra: a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott) Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása. 11

Density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti. Az összes lemért FL4 eloszlása. 3.

12 1. A sejteket fixáljuk és permeabilizáljul, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez. 2. A DNS festék (pl. propidium jodid; DAPI; 7-AAD stb) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez 3. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával. Alkalmazási terület: Daganatos sejtek A normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek Magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek 12

propidium jodid; DAPI; 7-AAD stb) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez 3.

Hasonló dokumentumok

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek 1 Fogalmak