Az áramlási citometria - fogalmak. Áramlási citometria. TörténeZ há]ér 5/21/12. Az áramlási citometria alapjai. alkalmazhatósága.

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Az áramlási citometria - fogalmak. Áramlási citometria. TörténeZ há]ér 5/21/12. Az áramlási citometria alapjai. alkalmazhatósága."

Hunor Pásztor
5 évvel ezelőtt
Látták:

Az áramlási citometria - fogalmak Áramlási citometria (ﬂow cytometry) Áramlási citometria Visegrády Balázs Bioﬁzika

biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék (sejtek) elkülönítése Nagyszámú, 105-106 számú részecske mérése

sejtek, kromoszómák egyedi tulajdonságait ﬁzikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit mérik Sejt sor6ng vagy FACS:

há]ér Áramlási citométer baktériumok detektálására aeroszolban (1947) Wallace Coulter - Coulter oriﬁce (1953), az

ﬂuorescenciájának mérése SorZng : egyedi részecskék elkülönítése Az áramlási citometria fejlődése Az áramlási

1 Az áramlási citometria - fogalmak Áramlási citometria (flow cytometry) Áramlási citometria Visegrády Balázs Biofizika előadás Az áramlási citometria alkalmazhatósága Részecskék (sejtek) számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék (sejtek) elkülönítése Nagyszámú, számú részecske mérése percenként Eljárás, amellyel folyadékáramban lévő mikroszkópikus részecskék, pl. sejtek, kromoszómák egyedi tulajdonságait fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit mérik Sejt sor6ng vagy FACS: Fluorescence- Ac6vated Cell Sor6ng Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint TörténeZ há]ér Áramlási citométer baktériumok detektálására aeroszolban (1947) Wallace Coulter - Coulter orifice (1953), az elektromos vezetőképesség változásait detektálta Kamentsky sorter (1965) Részecskék fényszórásának és/vagy fluorescenciájának mérése SorZng : egyedi részecskék elkülönítése Az áramlási citometria fejlődése Az áramlási citometria alapjai Hidrodinamikai fókuszálás Fényszórás - lézer vagy Hg- gőz lámpával Fluoreszcencia detektálás ElektrosztaZkus részecske szétválasztás, vagy sorzng Többváltozós adat analizálás 1

Áramlási citométer - felépítés Fényforrás Áramlási rendszer (hidrodinamikai rendszer)

cella Dichroikus tükrök PMT 2 PMT 3 Adatgyűjtés, adatanalízis SorZng Fényszórás detektor

áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek a lézerfény

rendszer Lézerek (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion,

rendszer Fotoeletron- sokszorozó (PMTs) Előre- és oldalirányú fényszórás Előre irányuló

2 Áramlási citométer - felépítés Fényforrás Áramlási rendszer (hidrodinamikai rendszer) Áramlási citométer - felépítés PMT 5 PMT 4 OpZkai rendszer Detektáló rendszer Minta Áramlási cella Dichroikus tükrök PMT 2 PMT 3 Adatgyűjtés, adatanalízis SorZng Fényszórás detektor Sávátersztő szűrők PMT 1 Laser Jel detektálás A hidrodinamikai rendszer Hidrodinamikai fókuszálás A köpenyfolyadék (diam.: 200 μm) veszi körül a mintafolyadékot (20 μm) (lamináris áramlás) A mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek a lézerfény útjába való lokalizálása OpZkai felépítés, adatgyűjtés Fényforrás: gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek ( , 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany- gőz, Hg- Xenon (megfelelő vonalak) Detektáló rendszer Fotoeletron- sokszorozó (PMTs) Előre- és oldalirányú fényszórás Előre irányuló fényszórás, FSC Fényszórás Előre irányuló fényszórás detektálása Fotodiódák Az előre irányuló szórás (Forward sca]er, FSC) mérése (gyakoribb) Oldal irányú fényszórás (side sca]er, SSC) mérése 2

3 Oldalirányú fényszórás Fényszórás alkalmazása Az oldalirányú fényszórás, SSC a sejtek granuláltságától függő jel Az előre irányuló fényszórás, FSC a sejtmére]el arányos jel Fluoreszcens jel detektálás A gerjesztés hatására emi]ált fényt 90 - os szögben detektálják Több fluoreszcens jel egyidejű detektálása Több fluorofór együ]esen, vagy térben elkülönítve kerül gerjesztésre Az emissziós jeleket a dichroikus tükrök és sávszűrők beiktatásával választják szét OpZkai rendszer A műszer felépítése Az emi]ált fény a fluoreszcens spektrum több régiójának jelét tartalmazza Hullámhossz alapján történő szétválasztás szükséges Dichroikus tükrök Sávszűrők 3

FSC SSC FITC APC A fotodiódákról/pmt- ről származó jelet analóg- digitális átalakítók (ADC) számokká alakítják Analóg jelek Digitális jelek Lézer késleltetés A számok konvertálása paraméterekké A

sűrűsége Terület a teljes fluorofór mennyiség Nincs holzdő Sejtszeparálás sorzng A piezoelektromos kristály rezgése (30-40 MHz) cseppekre bontja a folyadékoszlopot ( break poin t).

4 FSC SSC FITC APC A fotodiódákról/pmt- ről származó jelet analóg- digitális átalakítók (ADC) számokká alakítják Analóg jelek Digitális jelek Lézer késleltetés A számok konvertálása paraméterekké A fotodiódákról/pmt- ről származó jelet analóg- digitális átalakítók (ADC) számokká alakítják Jelszélesség "adatok száma (sebességtől függ) Csúcsmagasság fluorofór max. sűrűsége Terület a teljes fluorofór mennyiség Nincs holzdő Sejtszeparálás sorzng A piezoelektromos kristály rezgése (30-40 MHz) cseppekre bontja a folyadékoszlopot ( break poin t). A cseppek vagy egy sejtet tartalmaznak vagy nem tartalmaznak semmit. A cseppek (sejteket) a mért fényszórás vagy fluoreszcencia jelek alapján kiválaszták ( gazng ) A cseppeetk pozivv vagy negavv töltéssel látják el. Ezután stazkus elektrosztazkus térben a cseppek mozgására merőlegesen erő hat, mellyel a szétválasztás történik A sorzng általábana sejtkultúrák pozivv populációjának elválasztására szolgál, további sej]enyészetekhez. Fluoreszcens jelölés - immunofluoreszcencia A sejtek (pl. leukociták) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén, ami függ a sejtek.. típusától differenciálódási stádiumától akzvációs állapotától egyéb funkcionális állapotától, kóros elváltozásától, differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális anztestekkel történik, amik a sejyelszíni anzgénekhez jötődnek Áramlási citometriás célra az anztesteket fluoreszcencensen jelölik direkt vagy indirek módon Immunofluoreszcens jelölés (direkt) Immunofluoreszcens jelölés (direkt vs. indirekt) sejt Fuoreszcens festékkel jelölt anztestek sejt sejt 4

Fluoreszcens festékekkel szemben támaszto] követelmények: Fluoreszcencia kompenzáció Emi]áljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia FITC PE PE- TR PE- CY5 Az emissziós spektrum a

Aspecifikus kötődés kimértékű Olcsó, egyszerű eljárás Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait Két vagy több fluorofór egyidejű használatával a fluoreszcencia emissziós jelek egybe

5 Fluoreszcens festékekkel szemben támaszto] követelmények: Fluoreszcencia kompenzáció Emi]áljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia FITC PE PE- TR PE- CY5 Az emissziós spektrum a lehető legkisebb áyedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció) Kvantumhatásfok, abszorpciós együ]ható legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység) Aspecifikus kötődés kimértékű Olcsó, egyszerű eljárás Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait Két vagy több fluorofór egyidejű használatával a fluoreszcencia emissziós jelek egybe eshetnek A fluoreszcencia kompenzáció alkalmazásával az adatanalízis során a nemkívánatos jeláyedéseket lehet kompenzálni Az adatok tárolása, adayeldolgozás Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file- ban történik, ahol minden sejtről az összes mért adat elmentésre kerül Adatanalízis - egyparaméteres hisztogram Események száma Események száma Jelintenzitás (pl. fluoreszcencia) Jelintenzitás a megvilágítás időtartama néhány μs opzmálisan db/s a mérés sebessége Fényszórás Kapuzás Forward Scatter Neutrophils Monocytes Az összes lemért FL4 eloszlása. Lymphocytes Degree Scatter Humán fehérvérsejt Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása. 5

Kapuzási lehetőségek Az adatok megjelenítése Kétdimenziós ábrázolási módok: 1.

FLUORESCENCE IMAGE G M L 2. Density plot: az ábrán a pontok színe a sejtek számát jelenz 3.

3D plot (surface,felszín): a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritka) Előkészítés: mintavétel (vérsejt),

Kapuzás kiválasztása Kívánt mennyiségű adat gyűjtése az ado] kapun belül illetve sorzng Adayeldolgozás bármely

jelet adnak további teszt szükséges (pl.

6 Kapuzási lehetőségek Az adatok megjelenítése Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg SCATTER FLUORESCENCE IMAGE G M L 2. Density plot: az ábrán a pontok színe a sejtek számát jelenz 3. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal közk össze. 4. 3D plot (surface,felszín): a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritka) Előkészítés: mintavétel (vérsejt), sejtkultúra, sejtkezelés, sejtek fixálása, fluoreszcens jelölés Tesztadatok felvéte, kontollok alkalmazása Kapuzás kiválasztása Kívánt mennyiségű adat gyűjtése az ado] kapun belül illetve sorzng Adayeldolgozás bármely későbbi időpontban A mérések menete A módszerben rejlő hibalehetőségek Asszimmetrikus sejtek orientációfüggő jelet adnak további teszt szükséges (pl. vvt) A kontrollok hiánya fals pozivv/ negavv eredményt adhat A centrási dogma ellenőrzése a fluoreszcens jel mindig arányos a kötö] fluorofór mennyiségével? ImmunZpizálás áramlási citometriával Leukémia diagnózisa AIDS diagnoszzka (CD4+ T sejt szám alapján) Az áramlási citométer diagnoszzkai alkalmazásai 6

Sejtciklus és DNS tartalom analízis 1. A sejtek fixálása, permeabilizálása, hogy a DNS festékkel való jelölés 2. A DNS festék (pl.

Alkalmazási terület: Daganatos sejtek elkülönítése, amik a normálisnál magasabb DNS tartalommal magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek ApoptóZkus sejtek elkülönítése Sejtszám apoptózkus sejt

filamentum/monomer arány meghatározása sejtekben A F/G- akzn arány eltolódása funkcionális zavart okoz miopázás betegségekben AkZn miopázás betegségekben fellelhető mutációt hoztunk létre

A F/G- akzn arány relavv változása akzn miopázás betegségekben Visegrády B, Machesky L. 2010.

7 Sejtciklus és DNS tartalom analízis 1. A sejtek fixálása, permeabilizálása, hogy a DNS festékkel való jelölés 2. A DNS festék (pl. propidium jodid; DAPI; 7- AAD, stb) a sejtmagban sztöichiometrikusan kötődik a DNS- hez 3. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával. Alkalmazási terület: Daganatos sejtek elkülönítése, amik a normálisnál magasabb DNS tartalommal magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek ApoptóZkus sejtek elkülönítése Sejtszám apoptózkus sejt Normális G0/G1 sejtek PI - Fluoreszcencia Kromoszóma analízis DiagnoszZkai alkalmazási területek, összegzés A legtöbb humán kromoszóma áramlási citometriával elkülöníthető AkZn filamentum/monomer arány meghatározása sejtekben A F/G- akzn arány eltolódása funkcionális zavart okoz miopázás betegségekben AkZn miopázás betegségekben fellelhető mutációt hoztunk létre sejtmodellben A mutáns akznt kék (Marina- Blue- conjugated secondary anzbody), G- akznt zöld (Alexa Fluor 488- conjugated DNaseI) és F- akznt piros (Texas- Red- conjugated phalloidin). A F/G- akzn arány relavv változása akzn miopázás betegségekben Visegrády B, Machesky L Összefoglalás Áramlási citometria, FACS Hidrodinamikai fókuszálás Fényszórás, fluoreszcens jel detektálás Nagyszámú sejt többszempontú vizsgálata DiagnoszZkai, kutatási alkalmazások széles köre Felhasznált irodalom: Damjanovich S. Fidy J. Szöllősi J. (szerk.), Orvosi biofizika, Medicina Kiadó, 2006 Howard M. Shapiro: PracZcal Flow Cytometry, 4th EdiZon, ISBN: J.Paul Robinson, lecture,

8 Köszönöm a figyelmet! 8

Hasonló dokumentumok

Röntgendiffrakció. Grama László május

Röntgendiffrakció. Grama László május Röntgendiffrakció Grama László 2012. május Áramlási citometria Visegrády Balázs Biofizika előadás - 2012 Az áramlási citometria - fogalmak Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás, amellyel