2.3. Az abszorpciós spektrum és mérése

Átírás

1 2.3. Az abszorpciós spektrum és mérése Beer-Lambert törvény 0 k 0 x d k dx 0 e k x E log T 0 % c l x 0 10 cx Beer-Lambert törvény A(), E(), OD() c OD () () OD c (nm) c (mol/dm 3 ) Az abszorpciós spektrum mérése Egysugaras spekrofotométer L Mo Mi, R D < C Kétsugaras spekrofotométer L Mo Mi D < C R

2 Kinetikai spektrofotométer L Mo F 2 Mi, R D < C F 1 L 2 Pump-probe készülék Variable delay pump probe cuvette Main laser bean water bath F probe pump detectors reference

3 A biológiai rendszerek abszorpciós spektrumának sajátosságai n vivo abszorpciós spektrum OD aceton in vivo árpa-klorofill abszorpciós spektruma 18 nm 29 nm (nm) BChl - a absorpciós maximuma (S 0 S 1 átmenet): CCl 4 : 781 nm; éter: 770 nm Chl - a : Met-OH: 665,2 nm Et-OH: 664,2 aceton (80%): 663,2 aceton (100%): 661,6 Fehérjekörnyezet hatása

4 Fényszórásra való korrigálás 1. Mérés során - közeli mérőhelyzetben való mérés - integráló gömb alkalmazása - a mintával megegyező törésmutatójú közegben való mérés - a minta levegőtartalmának csökkentése (infiltrálás, pl. levelek esetén) 2. Mérés utáni korrekciók - a minta kifakítása (pl. erős fénnyel, kémiai anyaggal (pl. H 2 O 2 -dal)) E() valódi = E() minta, teljes - E() minta, kifakított - korrekció a spektrum vörös végére - Rayleigh-szórásra való korrekció E() 1/ 4 E() - szűrőhatás (sieve-effektus) E() (nm oldatban A festékek egyenetlen eloszlása (pl. kloroplasztiszban, vörösvértestben) miatti ellaposodás. szuszpenzióban (nm

5 Kinetikai abszorpciós spektrofotometria - Fény, kémiai anyagok, mágneses tér stb. a mintában időben is követhető abszorpcióváltozást okozhat. () OD() impulzus-gerjesztés Pl.: enzimaktivitás meghatározása t (s) t=0 Elsőrendű reakciók esetén: t (s) E = ()cl Az időegység alatt átalakított szubsztrát mennyisége: N t N 0 e t c E l t

6 2.4. Lumineszcenciaspektroszkópia Lumineszcencia: minden olyan fénykisugárzás, amelyet valamely atom, molekula a termikus sugárzáson kívül kibocsát Lumineszcenciajellemzők 1) abszorpciós spektrum 2) lumineszcenciaspektrum K' c l Q f 0 kvantumhatásfok készülékre jellemző állandó gerjesztési - emissziós ( abszorpció fluoreszcencia foszforeszcencia 3) kvantumhatásfok (nm) q N N f a 4) energiahatásfok E f e mivel E a h c e a E h e q q a e 5) élettartam N t kt N 0 e N t N 0 e k k k f ic isc t k f 1 k k ic isc

7 Q = k f 6) polarizációfok anizotrópia p vv vv vh vh r vv vv vh 2 vh 1 p r Perrin egyenlet: 1 r 1 r 0 k T 1 V r = anizotrópia r 0 = határanizotrópia (mozdulatlan kromofor) k = Boltzmann- állandó T = abszolút hőmérséklet V = a rotációs diffúziós mozgást végző rendszer térfogata = viszkozitás = fluoreszcencia-élettartam - membránok mikroviszkozitásásnak - makromolekulák konformációs mozgásainak meghatározása A fluoreszcencia mérése 1) spektrofluoriméter 2) fluoreszcenciaindukció 3) késleltetett lumineszcencia A fluoreszcenciaspektroszkópia néhány alkalmazása 1) Vegyületek kimutatása, kvantitatív meghatározása (porfirinek, szabad kalcium, katekolaminok, kortizol, hormonok stb. kvantitatív meghatározása) 2) Fehérjék fluoreszcenciás vizsgálata 3) mmunfluoreszcencia

8 4) Fluoreszcenciaaktivált sejtanalízis (FACS, Flow cytometry, sejtszeparálás) Counting T and B cells by flow cytometry. A sample of normal human blood was treated with a fluorescent monoclonal antibody specific for the T cell surface antigen CD3 and a monoclonal antibody conjugated to a different fluorescent dye and specific for the B cell surface antigen designated CD19. Fluorescence intensity (logarithmic) is plotted on the x axis; cell number on the y axis. Note that the number of B cells is substantially less than that of T cells.

9 5) Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) (egér hyppocampus neuron zöld fluorescence protein-nel jelölve)

10 Enzyme-Linked mmunosorbent Assay (ELSA) Biolumineszcencia Dubois (1887) - világító fúrókagyló (Pholas dactylus) - luciferin luciferáz rendszer Jellemzői - a kemilumineszcencia speciális esete (biokémiai folyamat eredménye) - spektruma kevéssé struktúrált - hatásfoka 1% - időben változik Mechanizmusa Általában n,* vagy,* átmenetek

11 . Nukleotid-rendszer - piridinnukleotid (NAD + /NADH+H +, FMN/FMNH 2 ) - adenninnukleotid (ATP) - baktériumok, gombák - szentjánosbogár, levélkorall. Egyszereű enzim-szubsztrát rendszer Rákok (Cypridae); Halak (Apogon); Kagylók (Pholas). Peroxidációs rendszer gyűrűsférgek V. Töltésrekombináció Protozoa, üvegmedúza V. Egyéb Chaetopterus Octochaetus Hoplophorus

12 A fényt kemolumineszcenciával létrehozó folyamatok a világítósejtek citoplazmájában lévõ, kifejezetten e célra szakosodott sejtszervecskékben, a luciferint, luciferázt és ATP-t tartalmazó peroxiszómákban mennek végbe. A luciferáz oxigén jelenlétében a luciferint az ATP közremûködésével peroxi- luciferinné alakítja, amely hamarosan oxi-luciferinné bomlik le - ezt a folyamatot kíséri a fénykibocsátás. Luciferin-ox. + XH 2 Luciferin-red. + X Luciferin-red. + E +ATP Luciferin-red.-E-AMP +PP i Luciferin-red.-E-AMP +O 2 Luciferin-ox. + E + H 2 O + AMP + h Gyakorlati jelentősége 1) ATP-analízis 1 foton 1 ATP 2) szennyvizek ellenőrzése A Photobacterium phosphoreum általi fénykibocsátás szennyvíz okozta gátlásának meghatározása" (a Photobacterium phosphoreum a Vibrio fischeri régebbi elnevezése)