Makromolekulák szerkezetvizsgálati módszerei: IR, CD

Átírás

1 Makromolekulák szerkezetvizsgálati módszerei: IR, CD Mi történhet, ha egy mintát fénnyel világítunk meg? megvilágító fény (elnyelt fény) minta átjutott fény Abszorpció UV-VIS, IR, CD spektr. Smeller László 07 kibocsátott fény Lumineszcencia (Fluoreszcencia és Foszforeszcencia) szórt fény Raman és Rayleigh szórás Abszorpciós és emissziós spektroszkópia Az átjutott vagy kibocsátott fény analizálása a hullámhossz függvényében. Információ: atomok, molekulák azonosítása, molekuláris szintű szerkezetváltozások (konformációváltozások) detektálása, koncentráció meghatározás Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? Energiaátmenet: ld. ablonski diagram Gerjesztett elektron- és vibrációs állapot* Gerjesztett elektronállapot Vibrációsan gerjesztett áll.* Alapállapot S S 0 E *csak molekuláknál!

2 E Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? S S 0 UV-VIS IR abszorpció Raman Fluoreszcencia Foszforeszcencia T E=hf=hc/ 0 0 Abszorpciós spektroszkópia Abszorpciós törvény x dx x +d d d dx d dx d dx d dx ln x const 0 e x Abszorpciós spektroszkópia Lambert-Beer törvény Elvi alapja: abszorpciós törvény: = 0 e -x ahol (anyag,c,) Lambert-Beer törvény: spektrum: A() mérés: spektrofotométer referencia oldat ( 0 ) információ: azonosítás koncentráció. A lg 0 ( ) cx UV-VIS abszorpciós spektroszkópia Mi abszorbeál a fehérjékben? Molekularész λ max (nm) ε(l/cm mol) Trp Tyr Phe Diszulfid híd Peptidkötés Fehérje koncentráció meghatározás: 80 (L mol - cm - )=5500 n Trp n Tyr + 5 n SS (Pace et al 995. Prot. Sci. 4, 4-4)

3 Rnase T Infravörös spektroszkópia Moláris extinkciós koefficiens (L/(mol cm) Hullámhossz (nm) Hullámhossz (nm) Fehérje koncentráció meghatározás: 80 (L mol - cm - )=5500 n Trp n Tyr + 5 n SS (Pace et al 995. Prot. Sci. 4, 4-4) Infravörös fény: =800 nm - mm közép infra tartomány:,5-50 m abszorpciós spektroszkópia az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt érzékeny a molekulaszerkezetre speciális detektálás: FT spektrométer (FTIR spektroszkópia) Az infravörös spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer fényforrás tk 6.7 ábra tk 6.8 ábra

4 FTIR elve részletesen Fourier transzformáció x/ x=retardáció E i = const (-cos(x/)) = DC +const cos(x/ AC 0 n 0 i cos( x/ i d0( ) AC cos( x/ d d n Ai sin( t) i E = A sin(t) E 0 da sin( t) d d Egy f(t) függvény Fourier transzformáltja a g(x) fügvény: F( f ( t)) F it f ( t) e dt g( ) A Fourier transzformáció inverze: it ( g( )) g( x) e d f ( t) A Fourier transzformáció szemléltetése Fourier transzformáció inverz Fourier transzformáció A spektrum számolása a Fourier transzformációs spektrométerben Az interferométeren keresztüljutott sugárzás: 0 d0( ) AC cos( x/ d d éppen a d 0( ) mennyiség cosinus transzformáltja d d A spektrum a 0( ) -nek a mintán való d áthaladása után megmaradt részének és a d 0( ) d -nak a hányadosa (transzmissziós spektrum)

5 Michelson interferométer álló tükör féligáteresztő tükör apertúra fényforrás mozgó tükör FT mintatér fényforrás detektor minta Molekularezgések Az elektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az elektronok nem befolyásolják. A klasszikus fizikai leírásban az atommagok közti kötést, egy rugóval vesszük figyelembe.

6 Molekularezgések: kétatomos molekula a középiskolából ismert: f D m m m m l l m m m F D / D F / D F D D m m D tehát:, amit az m D f D m egyenletbe helyettesítve a rezgési frekvencia: D( m m) f mm mm az m redukált mennyiséget redukált m m tömegnek is nevezik, ezzel a frekvencia: f D m redukált A hullámhossz: c mredukált c f D Az infravörös spektroszkópiában a reciprokát, a hullámszámot () használják: c D m redukált : hány hullám fér el egységnyi hosszúságon? [cm - ] Példa: CO A mért rezgési hullámszám: = 43 cm - =4,67m f =6, Hz m C = 0-6 kg, m O =,7 0-6 D=875 N/m kg Ha ismert, D számolható ha D ismert, számolható

7 Kvantummechanikai leírás Klasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsolata Klasszikus kép Energianívók E n=3 E n=3 n= n= n= n=0 x E hf ( n ) n n = 0,,. f D m redukált rezonancia az f frekvenciájú fénnyel E u.a.!!! E=hf n= n=0 x A rezgési frekvencia függése a tömegtől és a kötéserősségtől Tömeg: Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 400 Al-H 750 C-H 3000 Si-H 50 Ge-H 070 N-H 3400 P-H 350 As-H 50 O-H 3600 S-H 570 Se-H 300 F-H 4000 Cl-H 890 Br-H 650 Kötéserősség: C-N: 00 cm -, C=N: 660 cm -, C N: 0 cm -. Sokatomos molekulák rezgései N atomos molekula: 3N szabadsági fok, 3-3 a teljes molekula transzlációja ill. rotációja 3N-6 rezgési szabadsági fok (lineáris molekuláknál csak 3N-5) normálrezgések normálkoordináták Víz (O-H): 3600 => nehézvíz: 600 cm -

8 Normálkoordináták A kétatomos molekula példáján bemutatva: x c x O x O Normálrezgések Minden atom ugyanazzal a frekvenciával, fázissal, de különböző amplitúdóval és irányban rezeg. Pl. víz: m C m O x C Általános esetben 3N dimenziós koordinátarendszer forgatása Lineáris transzformáció (mátrixművelet) A normál módusok nem hatnak kölcsön egymással. A víz normálrezgései Benzol Ezek nem rezgések, hanem gátolt forgások (libráció)

9 Néhány tipikus rezgési frekvencia Példa: Formaldehid Analitikai alkalmazások szintézis: közti és végtermék azonosítás szerkezet bizonyítás metabolit kimutatás gyógyszerellenőrzés (tisztaság vizsgálat) Megj.: Lambert-Beer tv. itt is igaz, koncentráció meghatározás is lehetséges. forrás:

10 Molekula azonosítás molekula azonosítás C 4 H 8 O Fingerprint (ujjlenyomat) tartomány forrás: Makromolekulák rezgései Globális rezgések (bonyolultak) Lokalizált rezgések, pl: CH rezgések a lipidekben A biológiai makromolekulák tipikus infravörös spektrumai amid rezgések a fehérjékben (acetamid rezgések)

11 A sejt infravörös spektruma Fehérjék: Az N-metilacetamid mint a fehérjelánc gerincének modellje Fehérjék rezgési spektroszkópiája A víz abszorpciós spektruma Gerinc: amid rezgések konformáció (másodlagos szerkezet) H/D csere, (harmadlagos szerkezet) Oldalláncok kölcsönhatások más molekulákkal pl Ca + kötés Fontos technikai megj.: nehézvíz (D O)

12 Víz és nehézvíz spektrumok A fehérjék amid rezgései amid I C=O rezgés H-híd miatt konformációérzékeny amid II N-H deformációs rezgés (síkbeli hajlítás) H-D cserére érzékeny Szerkezet kompaktsága (harmadlagos szerk.) Az amid I vibráció és a másodlagos szerkezet lemez helix A másodlagos szerkezeti elemekhez tartozó jellegzetes amid I jel Intramolekuláris szerkezet -lemez rendezetlen -hélix Intermolekuláris kölcsönhatás Intermolekuáris antiparallel -lemez cm cm -

13 Alkalmazások: Fehérjedenaturáció fehérjedenaturáció Absorbance Meersman és mtsai. Biophys. Lipidek infravörös spektroszkópiája Fejcsoport Alkalmazások: lipid fázisátalakulás Zsírsavlán c

14 Nukleinsavak DNS Foszfát Bázisok (H híd) Foszfát csop. (PO - ) Cukor Bázisok Cukorfoszfát gerinc DNA, RNA A és B szerkezetek Nukleinsavak: ssdna ssrna dsdna dsdna

15 Speciális IR módszerek: IR Mikroszkóp Hordozható FTIR spektrométer dermal fibroblasts imagined at 4 cm -

16 ATR technika (Attenuated Total Reflection) CD Minta Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia ATR Kristály Poláros fény Síkban poláros: lin. pol = jobbra+ balra cirk. pol. Cirkulárisan poláros mozgó animációk:

17 A CD spektrométer vázlata A jobbra és balra forgó cirkulárisan polarizált fénysugarakkal a királis molekulák különbözőképpen hatnak kölcsön: A=A L -A R = c x = L - R Ellipticitás: tg = b/a b a.303 ( A ) 80 L AR 4 Lambert-Beer tv.: ( m : moláris ellipticitás) cl m [deg] CD és a fehérjeszerkezet A) triosephosphate isomerase B) hen egg lysozyme C) myoglobin D) chymotrypsin red:helix. green:strand, yellow:other. Figure 4 The far-uv CD spectra associated with various types of secondary structure elements in proteins. Red: -helix; blue: antiparallel -sheet; green: type I -turn; orange: irregular structure. (Data taken from the Encyclopedia of Life Sciences)

18 The Structure and CD spectrum of Subtilisin Vége helix sheet coil