Röntgendiffrakció, tömegspektrometria, infravörös spektrometria.

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Röntgendiffrakció, tömegspektrometria, infravörös spektrometria."

Orsolya Biró
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 A biomolekuláris szerkezet és dinamika vizsgálómódszerei: Röntgendiffrakció, tömegspektrometria, infravörös spektrometria. Smeller László A molekuláris szerkezet és dinamika vizsgáló módszereinek áttekintése Szerkezet Röntgenkrisztallográfia NMR spektroszkópia Tömegspektrometria Infravörös spektroszkópia Lumineszcencia spektr. Dinamika Fluoreszcencia élettartam Dinamikus fényszórás ESR (EPR) spektroszkópia FCS (Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia Miért fontos a szerkezet ismerete? Szerkezet - dinamika Kis molekulák dokkolása Forrás:

Tömegspektrometria Infravörös spektroszkópia Lumineszcencia spektr.

2 Röntgendiffrakció Röntgendiffrakció Mit (Milyen információt ad)? Molekulák térbeli szerkezete. Minden (nehéz) atom x,y,z koordinátáját. Miért érdekes/hasznos az orvostudományban? Biológiai folyamatok megértése pl. DNS transzkripció, enzimműködés, molekuláris felismerés, mutációk hatása Gyógyszermolekulák tervezése (kötődés, dokkolás) Hogyan? 5 6 Emlékezetőül: fényelhajlás Röntgendiffrakció Fényelhajlás (diffrakció) optikai rácson: Milyen rács illik a röntgensugárzáshoz? Rácsállandó: sinα k kλ d α k λ Rtg 0 00 pm H 00 pm Pl. Cu Kα vonal: λ54 pm α k t mérjük, λ ismert d meghatározható Atomgi er nλ d sinθ 7 NaCl rácsállandó: 564 pm 8

DNS transzkripció, enzimműködés, molekuláris felismerés, mutációk hatása Gyógyszermolekulák tervezése (kötődés, dokkolás) Hogyan?

3 A Röntgendiffrakciós készülék elvi vázlata Röntgencső 0-40 kv Makromolekulák szerkezetvizsgálata röntgendiffrakcióval Nobel díj 96 Globuláris fehérjék szerkezetvizsgálata M. F. Perutz, J. C. Kendrew mioglobin:~00 atom Kristály ólomkollimator 0-ad rendű sugár (nem térül el) Nobel díj 96 DNS szerkezete Francis Crick James Watson Maurice Wilkins Elhajlott sugarak Fluoreszcens lemez v. félvezető detektor 9 Rosalind Franklin 0 Makromolekulák szerkezetvizsgálata röntgendiffrakcióval Nobel Díj 003 Roderick MacKinnon Fehérjekristályok Nobel díj 009 Riboszóma szerkezetvizsgálata V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, A. E. Yonath 30S alegység: ~35000 atom, 50S alegység:~64000 atom

Kendrew mioglobin:~00 atom Kristály ólomkollimator 0-ad rendű sugár (nem térül el) Nobel díj 96 DNS szerkezete Francis Crick James Watson Maurice Wilkins Elhajlott

4 Fehérjeszerkezet meghatározása röntgendiffrakcióval Fehérje oldat Kristály ~ mm Diffrakciós mintázat Elektronsűrűségi térkép Elsődleges szerkezet atomi pozíciók 3 Egykristály előállítása szükséges Stabil konformációjú fehérjék vizsgálhatók (globuláris fehérjék) A kristálybeli elektronsűrűség térbeli és időbeli átlagát kapjuk meg Fehérjeszerkezet meghatározása röntgendiffrakcióval rtg kriszt. 399 NMR 06 Május 3 án 880 struktura! Lizozim 5 6

szükséges Stabil konformációjú fehérjék vizsgálhatók (globuláris fehérjék) A kristálybeli elektronsűrűség térbeli

5 Fehérje adatbázisok PDB Protein Data Bank 3D szerkezetek (>00 ezer) Röntgenkrisztallográfiai ill. NMR mérésekből Swiss prot Szekvenciák Proteomikai segédprogramok, Szerkezet becslés (homológia modellezés) Kémiai paraméterek becslése (pl. izoelektromos pont ) Szekvenciák hasonlósága Krisztallográfia NMR Avagy tényleg ugyanolyan a fehérje szerkezete fiziológiás oldatban mint a kristályban? 7 mioglobin 8 Tömegspektrometria Tömegspektrometria Mit (Milyen információt ad)? A minta molekuláit (ill. annak fragmentumait) tömeg (pontosabban m/z*) alapján szétválasztja, azonosítja a fragmentumokat ill. a molekulákat. Miért érdekes/hasznos az orvostudományban? proteomika, diagnosztika, szűrés, intraoperatív szövettan Hogyan? 9 *z: a töltés elemi töltés egységekben 0

izoelektromos pont ) Szekvenciák hasonlósága Krisztallográfia NMR Avagy tényleg ugyanolyan a fehérje szerkezete fiziológiás oldatban mint a kristályban?

6 Lépések: A tömegspektrométer elve. A minta gázállapotba hozása. Ionizácó 3. Fragmentálás (molekulatöredékek keltése) 4. Elválasztás 5. Detektálás 6. Kiértékelés Gázállapotba hozás, ionizáció Leggyakrabban alkalmazott módszerek: ESI (electrospray ionisation) Elektron ionizáció Laser deszorpció MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation) Elektrospray ionizáció elve Elektron ionizáció oldószer párolgás kisebb csepp nagyobb felületi töltés Coulomb taszítás felrobbannak a cseppek ionizált gyorsított molekulák Elektronsugárral ütköztetjük a már gázállapotú mintát. Ionizál és fragmentál is. izzókatód minta töltött molekulák Lézer deszorpció U elektronokgyorsításhoz U Gyorsítófeszültség 3 4

desorption ionisation) Elektrospray ionizáció elve Elektron ionizáció oldószer párolgás kisebb csepp nagyobb felületi töltés Coulomb taszítás felrobbannak a cseppek ionizált

7 MALDI matrix assisted laser desorption ionisation Analízis A lézersugárzást a mátrix atomjai (molekulái) abszorbeálják. Nagy molekulák vizsgálatához ideális. Mágneses Kvadrupol TOF 5 6 Mágneses tömeganalizátor Kvadrupol tömeganalizátor B B R R m m Detektor F v Manapság nem használják, mert a mágnes nagy és nehéz. Kiválaszt egy szűk m/z tartományt, ami a ráadott feszültségekkel állítható be. 7 8

Mágneses Kvadrupol TOF 5 6 Mágneses tömeganalizátor Kvadrupol tömeganalizátor B B R R m m Detektor

8 Time of Flight elve Time of flight MS gyorsítás elektromos térben repülés elektromos tér mentes l d úton A repülési idő számolása: minta detektor ionok ebből az m/z arány: U n repülési időt mérjük m/z-t számoljuk m/z 9 Pillanatszerű mintabevitel kell (lp. lézeres deszorpció) 30 Alkalmazások: proteomika Alkalmazások: diagnosztika 3 C-urea kilégzési teszt Helicobacter pylori kimutatására 3 C-urea tabletta 30 perc múlva a kilégezett levegőben a 3 CO mennyiségének növekedése a (Helicobacter pylori által termelt) ureáz enzim jelenlétére utal. A 3 CO mennyiségét tömegspektrometriával határozzák meg a kilélegzett levegőből. 3 3

lézeres deszorpció) 30 Alkalmazások: proteomika Alkalmazások: diagnosztika 3 C-urea kilégzési teszt Helicobacter pylori kimutatására 3 C-urea tabletta 30

9 Alkalmazások: szűrés Alkalmazások: rákdiagnosztika Anyagcsere betegségek szűrése csecsemőknél egy csepp vérből. 33 Takeda és mtsai: Innovations in Analytical Oncology - Status quo of Mass Spectrometry-Based Diagnostics for Malignant Tumor Journal of Analytical Oncology, 0,, Alkalmazások: intraoperativ MS Itt egy szép ház állhatott Itt pedig egy kalyiba 35 36

33 Takeda és mtsai: Innovations in Analytical Oncology - Status quo of Mass

10 Infravörös spektroszkópia IR spektroszkópia Mit (Milyen információt ad)? Molekulák rezgési frekvenciája, térszerkezete Miért érdekes/hasznos az orvostudományban? molekulák azonosítása molekulaszerkezet változások követése diagnosztika Hogyan? Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ800 nm mm közép infra tartomány:,5 50 μm abszorpciós spektroszkópia az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt érzékeny a molekulaszerkezetre speciális detektálás: FT spektrométer Molekularezgések Az elektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az elektronok nem befolyásolják. A klasszikus fizikai leírásban az atommagok közti kötést, egy rugóval vesszük figyelembe

37 38 Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ800 nm mm közép infra tartomány:,5 50 μm abszorpciós spektroszkópia az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt

11 Molekularezgések: kétatomos molekula m a középiskolából ismert: f π m m D m l l l l D D F / D F / D Δl Δl l l F DΔl l + l l l l + m m + m + m m 4 4 tehát: m + m D, amit az D f m D π m egyenletbe helyettesítve a rezgési frekvencia: π Redukált tömeg: m mm redukált m m ezzel a frekvencia: + D f π f m redukált D( m m m + m) 43 Ilyen frekvenciájú fény hullámhossza: c mredukált λ πc f D hullámszáma hullámhossz reciproka (ν): ν λ πc D m redukált ν [cm ]: hány hullám fér el egységnyi hosszúságon? Példa: CO A mért rezgési hullámszám: ν 43 cm λ4,67μm f 6, Hz D875 N/m m C 0 6 kg, m O,7 0 6 kg Ha ν ismert, D számolható ha D ismert, ν számolható 44

43 Ilyen frekvenciájú fény hullámhossza: c mredukált λ πc f D hullámszáma hullámhossz reciproka (ν): ν λ πc D m redukált ν [cm ]: hány hullám fér el egységnyi

12 Klasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsolata Klasszikus kép Energianívók A rezgési frekvencia függése a tömegtől és a kötéserősségtől Tömeg: Kötéserősség: S Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 400 C-H 3000 N-H 3400 O-H 3600 F-H 4000 C N: 00 cm, CN: 660 cm, C N: 0 cm. f π D m redukált S 0 ΔE Al-H 750 Si-H 50 Ge-H 070 P-H 350 As-H 50 S-H 570 Se-H 300 Cl-H 890 Br-H 650 rezonancia az f frekvenciájú fénnyel ΔEhf u.a.!!! 45 Víz (O-H): 3600 > nehézvíz: 600 cm - 46 Sokatomos molekulák rezgései N atomos molekula: 3N szabadsági fok, 3 3 a teljes molekula transzlációja ill. rotációja 3N 6 rezgési szabadsági fok (lineáris molekuláknál csak 3N 5) normálrezgések Normálrezgések Minden atom ugyanazzal a frekvenciával, de különböző amplitúdóval és irányban rezeg. Pl. víz: antiszimmetrikus 47 48

f π D m redukált S 0 ΔE Al-H 750 Si-H 50 Ge-H 070 P-H 350 As-H 50 S-H 570 Se-H 300 Cl-H 890 Br-H 650 rezonan

13 A víz normálrezgései Néhány tipikus rezgési frekvencia Nem rezgés, hanem gátolt forgás Példa: Formaldehid Illusztrációként: különféle molekularezgések 5 5

Illusztrációként: különféle molekularezgések http://www.

14 Flavin Makromolekulák rezgései Globális rezgések (bonyolultak) Lokalizált rezgések (csoportrezgések) a rezgő csoport környezetéről adnak információt pl: CH rezgések a lipidekben Fehérjék infravörös spektroszkópiája Konformációérzékeny rezgés 55

csoport környezetéről adnak információt pl: CH rezgések a

15 Fehérje rezgések Amid rezgések a fehérjékben A spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer (FTIR) Konformációra érzékenyek: másodlagos és harmadlagos szerkezetre 57 tk 6.7 ábra 58 Alkalmazások lipid kettősréteg fázisátalakulása fényforrás hő-sokk fehérjék kölcsönhatása a lipidréteggel FT tk 6.8 ábra 59 60

16 fehérjedenaturáció Alkalmazások Molekula azonosítás C 4 H 8 O Meersman és mtsai. Biophys 6 J. 6 Infravörös mikroszkópia Infravörös mikroszkópia 64x64 detektor ν ν ν 3 ν 4 minden képpontban megmérjük az egész spektrumot Abszorbancia ν ν ν 3 ν 4 hullámszám 63 64

edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/infrared/infrared.

17 Vesekövek osztályozása IR mikrospektroszkópiával Amid I rezgés (fehérje) Számítógépes analízis (6 osztály) hisztológiai kép Számítógépes analízis (5 osztály) colonic mucosa 66 vége 67

Hasonló dokumentumok

1. Atomspektroszkópia

1. Atomspektroszkópia 1.1. Bevezetés Az atomspektroszkópia az optikai spektroszkópiai módszerek csoportjába tartozó olyan analitikai eljárás, mellyel az anyagok elemi összetételét határozhatjuk meg. Az