Infravörös és CD spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában

Átírás

1 Infravörös és CD spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában Mi történhet, ha egy mintát fénnyel világítunk meg? megvilágító fény (elnyelt fény) minta átjutott fény Abszorpció UV-VIS, IR, CD spektr. Smeller László kibocsátott fény Lumineszcencia (Fluoreszcencia és Foszforeszcencia) szórt fény Raman és Rayleigh szórás Abszorpciós és emissziós spektroszkópia Az átjutott vagy kibocsátott fény analizálása a hullámhossz függvényében. Információ: atomok, molekulák azonosítása, molekuláris szintű szerkezetváltozások (konformációváltozások) detektálása, koncentráció meghatározás Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? Energiaátmenet: ld. ablonski diagram Gerjesztett elektron- és vibrációs állapot* Gerjesztett elektronállapot Vibrációsan gerjesztett áll.* Alapállapot S S 0 E *csak molekuláknál!

2 E Miért nyel el ill. bocsát ki fényt egy atom v. molekula? S S 0 UV-VIS IR abszorpció Raman Fluoreszcencia Foszforeszcencia T ΔEhfhc/λ 0 0 Abszorpciós spektroszkópia Abszorpciós törvény x dx x +d d d dx d μdx d μdx d μdx ln μx + const 0 e μx Abszorpciós spektroszkópia Lambert-Beer törvény Elvi alapja: abszorpciós törvény: 0 e -μx ahol μ(anyag,c,λ) Lambert-Beer törvény: A lg 0 ε ( λ) cx spektrum: A(λ) mérés: spektrofotométer referencia oldat ( 0 ) információ: azonosítás koncentráció. Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ800 nm - mm közép infra tartomány:,5-50 μm abszorpciós spektroszkópia az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt érzékeny a molekulaszerkezetre speciális detektálás: FT spektrométer (FTIR spektroszkópia)

3 Az infravörös spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer fényforrás tk 6.7 ábra tk 6.8 ábra FTIR elve részletesen Fourier transzformáció x/ xretardáció E i const (-cos(πx/λ)) DC +const cos(πx/λ) AC 0 n 0 i cos(πx/ λ i d 0( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ ) n Ai sin( ωit) E A sin(ωt) E 0 da sin( ωt) dω dω Egy f(t) függvény Fourier transzformáltja a g(x) fügvény: F( f ( t)) F πiνt f ( t) e dt g( ν ) A Fourier transzformáció inverze: πiνt ( g( ν )) g( x) e dν f ( t)

4 A Fourier transzformáció szemléltetése Fourier transzformáció inverz Fourier transzformáció A spektrum számolása a Fourier transzformációs spektrométerben Az interferométeren keresztüljutott sugárzás: 0 d 0( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ éppen a d ( 0 λ) mennyiség cosinus transzformáltja dλ d A spektrum a ( 0 λ) -nek a mintán való dλ áthaladása után megmaradt részének és a d ( 0 λ) -nak a hányadosa (transzmissziós spektrum) dλ Molekularezgések fényforrás Az elektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az elektronok nem befolyásolják. FT A klasszikus fizikai leírásban az atommagok közti kötést, egy rugóval vesszük figyelembe.

5 Molekularezgések: kétatomos molekula a középiskolából ismert: f π D m m m l l m l Δl l Δl m + m m l + l l l l Δl Δl F DΔl / D F / D F D D m + m D tehát:, amit az m D f π D m egyenletbe helyettesítve a rezgési frekvencia: D( m + m) f π mm az m mm mennyiséget redukált redukált m + m tömegnek is nevezik, ezzel a frekvencia: f π D m redukált A hullámhossz: c mredukált λ πc f D Az infravörös spektroszkópiában a λ reciprokát, a hullámszámot (ν) használják: ν D ν: hány hullám fér el egységnyi hosszúságon? [cm - ] λ πc m redukált Példa: CO A mért rezgési hullámszám: ν 43 cm - λ4,67μm f 6, Hz m C 0-6 kg, m O,7 0-6 kg D875 N/m Ha ν ismert, D számolható ha D ismert, ν számolható

6 Kvantummechanikai leírás Klasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsolata Klasszikus kép Energianívók E ψ n3 E ψ n3 n n n n0 x E hf ( n + ) n n 0,,. f π D m redukált rezonancia az f frekvenciájú fénnyel ΔE u.a.!!! ΔEhf n n0 x A rezgési frekvencia függése a tömegtől és a kötéserősségtől Tömeg: Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 400 Al-H 750 C-H 3000 Si-H 50 Ge-H 070 N-H 3400 P-H 350 As-H 50 O-H 3600 S-H 570 Se-H 300 F-H 4000 Cl-H 890 Br-H 650 Kötéserősség: C-N: 00 cm -, CN: 660 cm -, C N: 0 cm -. Sokatomos molekulák rezgései N atomos molekula: 3N szabadsági fok, 3-3 a teljes molekula transzlációja ill. rotációja 3N-6 rezgési szabadsági fok (lineáris molekuláknál csak 3N-5) normálrezgések normálkoordináták Víz (O-H): 3600 > nehézvíz: 600 cm -

7 Normálkoordináták A kétatomos molekula példáján bemutatva: x c x O m C m O x TKP x O x ν Normálrezgések Minden atom ugyanazzal a frekvenciával, fázissal, de különböző amplitúdóval és irányban rezeg. Pl. víz: x C Általános esetben 3N dimenziós koordinátarendszer forgatása Lineáris transzformáció (mátrixművelet) A normál módusok nem hatnak kölcsön egymással. A víz normálrezgései Néhány tipikus rezgési frekvencia Ezek nem rezgések, hanem gátolt forgások (libráció)

8 Példa: Formaldehid Analitikai alkalmazások szintézis: közti és végtermék azonosítás szerkezet bizonyítás metabolit kimutatás gyógyszerellenőrzés (tisztaság vizsgálat) Megj.: Lambert-Beer tv. itt is igaz, koncentráció meghatározás is lehetséges. forrás: Molekula azonosítás molekula azonosítás C 4 H 8 O Fingerprint (ujjlenyomat) tartomány forrás:

9 Makromolekulák rezgései Az N-metilacetamid mint a fehérjelánc gerincének modellje Globális rezgések (bonyolultak) Lokalizált rezgések, pl: CH rezgések a lipidekben amid rezgések a fehérjékben (acetamid rezgések) Fehérjék rezgési spektroszkópiája A víz abszorpciós spektruma Gerinc: amid rezgések konformáció (másodlagos szerkezet) H/D csere, (harmadlagos szerkezet) Oldalláncok kölcsönhatások más molekulákkal plca + kötés Fontos technikai megj.: nehézvíz (D O)

10 Víz és nehézvíz spektrumok A fehérjék amid rezgései Bandekar BBA 0 (99) 3 A fehérjék amid rezgései Az amid I vibráció és a másodlagos szerkezet amid I CO rezgés H-híd miatt konformációérzékeny amid II N-H nyújtási rezgés H-D cserére érzékeny Szerkezet kompaktsága (harmadlagos szerk.) β lemez α helix

11 A másodlagos szerkezeti elemekhez tartozó jellegzetes amid I jel Intramolekuláris szerkezet β-lemez rendezetlen α-hélix Intermolekuláris külcsönhatás Intermolekuáris antiparallel β-lemez ν cm ν cm - Az amid I sáv átlapoló komponensek összege: dekovolúció A A ν ν Fourier öndekonvolúció Vonalak szétválasztása vonalkeskenyítéssel

12 Alkalmazások lipid fázisátalakulás fehérjedenaturáció BPTI bovine pancreatic trypsin inhibitor Meersman és mtsai. Biophys. aggregáció Mioglobin (Nyomásciklus) aggregáció

13 Ca + kötés CD 8 C Parvalbumin Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia Absorbance 43.8 C 67.5 C Wavenumber (cm - ) C 90 C 30 C Poláros fény Síkban poláros: lin. pol jobbra+ balra cirk. pol. Cirkulárisan poláros mozgó animációk:

14 A CD spektrométer vázlata A jobbra és balra forgó cirkulárisan polarizált fénysugarakkal a királis molekulák különbözőképpen hatnak kölcsön: ΔAA L -A R Δε c x Δεε L -ε R Ellipticitás: θ tg θ b/a b a θ.303 ( A ) 80 L AR 4 π Lambert-Beer tv.: θ c l θm (θ m : moláris ellipticitás) [deg] CD és a fehérjeszerkezet A) triosephosphate isomerase B) hen egg lysozyme C) myoglobin D) chymotrypsin red:helix. green:strand, yellow:other. Figure 4 The far-uv CD spectra associated with various types of secondary structure elements in proteins. Red: α-helix; blue: antiparallel β-sheet; green: type I β-turn; orange: irregular structure. (Data taken from the Encyclopedia of Life Sciences)

15 The Structure and CD spectrum of Subtilisin Vége helix sheet coil