Lumineszcencia spektrometria összefoglaló

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Lumineszcencia spektrometria összefoglaló"

Andrea Boros
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Lumineszcencia spektrometria összefoglaló Ismétlés: fény (elektromágneses sugárzás) elnyelés: abszorpció elektron gerjesztés: excitáció alap és gerjesztett állapot atomi energiaszintek, energiaszintek energia különbsége, foton energia, rezonancia feltétel elektromos, vibrációs, rotációs energiaszintek és azok függetlensége Jablonsky diagram (termséma) szinglet és triplet állapot, multiplicitás Lumineszcencia jelensége: lumineszcencia típusok gerjesztés típusa szerint fluorofór = fluoreszcens molekula / jelölő jelenségek összekapcsolása: abszorpció emisszió, gerjesztés visszagerjesztés (excitáció deexcitáció), foton és elektron kölcsönhatása gerjesztés és emisszió jelenségének értelmezése a Jablonsky diagram segítségével, spontán emisszió tulajdonságai időbeliség, koherencia irány, divergencia hullámhossz polarizáltság Lumineszcencia típusok triplet és szinglet állapotok szerint: fluoreszcencia és foszforeszcencia összehasonlítása S 1 S 0 és T 1 S 0 átmenet, spinátfordulás, tiltott és engedélyezett átmenetek időbeliség, átlagos élettartam foton energia, emissziós spektrumok az elektromágneses spektrumon

2 Lumineszcencia típusok értelmezése a Jablonski diagram segítségével Kasha szabály sugárzásos és nem sugárzásos átmenetek tükör szimmetria, Stokes féle eltolódás (vörös eltolódás) fluoreszcencia átlagélettartam, kvantumhatásfok polarizáció, polarizált fény, abszorpciós és elektromos vektor, fotoszelekció jelensége Fluorofórok: intrinsic és extrinsic fluorofórok fluoreszcencia (és fluorofórok) alkalmazási lehetőségei Lumineszcencia spektroszkópia fluoriméter: egységek és geometria: fényforrás, monokromátor(ok), minta, detektor (PMT), adatgyűjtő és kiértékelő egység (PC) működési elv: merőleges elrendezés, gerjesztési és emissziós ág

február Orbán József PTE ÁOK Biofizikai Intézet Kengurupatkány vese

3 Lumineszcencia spektroszkópia Elektron+vibrációs+rotációs-spektroszkópia alapjai Biofizika II. szemeszter február Orbán József PTE ÁOK Biofizikai Intézet Kengurupatkány vese epitéliumsejt mitotikus osztódása DNS Mikrotubulus Mitokondrium forrás: 1

4 Lumineszcencia tulajdonságok Szinglet/triplet állapot Energetika Időbeliség, koherencia Irány (divergencia) Polarizáltság A lumineszcencia típusai A gerjesztés módja szerint: EM sugárzás elnyelése (bio)kémiai reakció termikusan aktivált elektromos töltés által indukált nagy energiájú részecske v. sugárzás mechanikai (súrlódás) hanghullámok A gerjesztett tt állapot szerint: szinglet szinglet átmenet triplet szinglet átmenet A termolumineszcencia nem azonos sem a hő-, sem a fekete test sugárzással! fotolumineszcencia kemi-, biolumineszcencia termolumineszcencia elektrolumineszcencia radiolumineszcencia tribolumineszcencia sonolumineszcencia fluoreszcencia foszforeszcencia 2

5 0 Szinglet és triplet állapot (molekulák) Eredő spin? s =S=? = Multiplicitás: =2S+1 2 S+1 Energia h S = 0 M = 1 S = 1 M = 3 S 1 T 1 Abszorpció S 0 Pauli elvnek megfelel engedélyezett átmenet S 0 Pauli elvnek ellentmond tiltott átmenet 0 Energia h Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszerre abszorpció ideje: s S 2 S 1 Abszorpció Emisszió h S 0 1. Excitáció (gerjesztés) Abszorpció (elnyelés) Energiafelvétel közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont nyel el a rendszer. 2. De-excitáció Emisszió (kibocsátás) Energialeadás közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont bocsát ki a rendszer. Kasha szabály (fluoreszcencia) Minden sugárzásos átmenet az első gerjesztett (S 1 ) állapot legalsó vibrációs energiaszintjéről indul. 3

6 0 Energia h Jabłonsky-féle termséma S 2 S 1 Abszorpció Emisszió h S 0 IC: internal conversion Belső konverzió VR: vibrációs relaxáció (termikus relaxáció) ISC: intersystem crossing Rendszerek közti átmenet h Sugárzás nélküli átmenetek (nonradiativ) T 1 Sugárzásos átmenetek (radiativ) fluoreszcencia ( s) foszforeszcencia ( s) SPONTÁN EMISSZIÓ! Emisszió típusok tulajdonságai Indukált A beérkező fotonnal Egy időben (azonnal) koherens Egyező irányban (kis divergencia) Azonos hullámhossz monokromatikus Spontán (a foton abszorpcióhoz képest) Időben késleltetve nem koherens Minden irányban (3D) nem azonos nem monokrom. Kisebb energiájú 4

7 Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes féle eltolódás ( ) Int. f : s p : s absz. gerj. fluor. foszfor. Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes féle eltolódás 5

Tükörszimmetria oka Source: http://www.olympusfluoview.com/theory/fluoroexciteemit.

8 Tükörszimmetria oka Source: A fluoreszcencia élettartam Fluoreszcencia lecsengési görbe I ( t) I 0 e kt k: sebességi állandó A fluorofórok karakterisztikus tulajdonsága, jele: (tau) Átlagos élettartam 6

hő) Fluoreszcencia élettartam ( ) A molekula gerjesztett állapotból fotonemisszióval kerül vissza alapállapotba.

9 Milyen időskálán zajlanak a folyamatok? gerjesztés Fluoreszcencia 10-9 s Foszforeszcencia 10-3 s s alapállapot relaxáció gerjesztett állapot fluoreszcencia kioltás, FRET Belső átalakulás (Internal conversion, hő) Fluoreszcencia élettartam ( ) A molekula gerjesztett állapotból fotonemisszióval kerül vissza alapállapotba. A fluoreszcencia-élettartam az az idő, amely alatt a gerjesztett állapotban levő molekulák száma az e-ed részére csökken. k f 1 k ic k isc k f 1 k nr ns-os tartomány ahol k nr = k ic + k isc kf - a fluoreszcencia-átmenet valószínűsége ic - internal conversion (belső konverzió) isc - intersystem crossing (rendszerek közti átmenet) nr - nonradiativ (sugárzás nélküli átmenet) 7

10 Fluoreszcencia kvantumhatásfok N emit emit Q < 1 N abs k f 1 k k ic isc Q k f k k f ic k isc k f N emit és N abs nem, vagy csak nehezen mérhető, ellenben k f és mérhetők! Polarizált fény, abszorpciós vektor, elektromos vektor Elektromos dipolmomentum Elektromágneses hullám elektromos térerősség vektora, rezgési sík 8

A metszősíkot szemből nézve az alábbi kép tárul elénk: Ha az elektromos térerősség vektora a

síkban vagy lineárisan polarizált hullámról beszélünk. http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.

11 Síkban ill. lineárisan polarizált fény Az animáció egy függőleges síkban polarizált hullámot mutat be. A metszősíkot szemből nézve az alábbi kép tárul elénk: Ha az elektromos térerősség vektora a tér valamely, a fénysugár vonalában lévő, rögzített pontjában egy egyenes mentén rezeg, akkor síkban vagy lineárisan polarizált hullámról beszélünk. Síkban ill. lineárisan polarizált fény Az alábbi animáció egy vízszintes síkban polarizált hullámot mutat be. A metszősíkot szemből nézve 9

12 Elektromos és abszorbciós vektorok forgáskúp!!! Elektromos térerősség vektor Abszorbciós vektor meghatározza az abszorbció valószínűségét A kúpon belüli abszorpciós vektor esetén a fluorofor gerjesztésének valőszínűsége nagyobb, mint 50%. (függőleges polariáció esetén) Abszorpció maximális, ha az abszorpciós vektor és a fény elektromos térerősség vektora párhuzamos. Abszorpció képessége függ cos 2 θ-tól (θ az absz. vektor és a fény elektromos térerősség vektora közötti szög). Fotoszelekció Véletlenszerű, izotróp eloszlás polarizálatlan fény Anizotróp eloszlás fluoroforok random orientációjú populációja izotróp: irányfüggetlen Minden irányban azonos. vertikálisan polarizált fény fotoszelekció = rendezett orientációjú szubpopuláció szelektálódik 10

13 Fluorofórok Fehérjék abszorpciója - aminosavak A három fontos aminosav, amelyek UV-ban abszorbálnak, azaz gerjeszthetők. extinkció hullámhossz 11

14 Fluorofórok fluoreszcenciára alkalmas kémiai anyagok 1. Intrinsic, natív (belső) fluorofórok Fehérjékben: aromás aminosavak Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszert. Élő sejtek saját fluoreszcenciája Aequorea victoria GFP (green fluorescent protein) szalagdiagrammja 12

2. Extrinsic (külső) fluorofórok - fluoreszcens festékek A jelölő

A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez köthetjük. (pl.

IAF IAEDANS PIRÉN példák: IAEDANS-IAF: FRET donor-akceptor pár

15 2. Extrinsic (külső) fluorofórok - fluoreszcens festékek A jelölő kémiai anyagok minősége és elhelyezkedése tervezhető. A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez köthetjük. (pl.: cisztein, glutamin, lizin) A fehérje aktivitását tesztelni kell. IAF IAEDANS PIRÉN példák: IAEDANS-IAF: FRET donor-akceptor pár Pirén: aktin polimerizáció fluoreszcein, dansyl, rhodamine száramzékok... Aktin monomer szalagdiagramja 13

Külső (extrinsic) fluorofór alkalmazásakor: makromolekula fluorofór A kromofór (fluorofór) lokális mozgása elkülöníthető a molekula egészének mozgásától.

16 Külső (extrinsic) fluorofór alkalmazásakor: makromolekula fluorofór A kromofór (fluorofór) lokális mozgása elkülöníthető a molekula egészének mozgásától. Térszerkezeti változás a makromolekulában hat a kromofór mozgására is. Ez a változás mérhető. Kovalensen kötött fluorofórok. Jelölt antitestek. Egyéb kémiai módosulások. Fluoreszcencia alkalmazási lehetőségei Előnyös tulajdonságai Jól detektálható jel (alacsony koncentrációjú minták esetén is). A fluoreszcencia paraméterek érzékenyek a környezeti tényezők megváltozására. A molekuláris szintű vizsgálatok fontos eszköze Szerkezeti és dinamikai információt ad a vizsgált rendszerről. Biológiai rendszerek vizsgálata. Molekulák közötti és molekulán belüli kölcsönhatások tanulmányozása. Molekuláris mozgások vizsgálata (polarizáció, anizotrópia). Molekuláris szintű távolságmérés (FRET). Molekulák rugalmasságának jellemzése (FRET). Molekula szerkezeti részleteinek, és az egyes csoportok elérhetőségének feltérképezése (quenching). 14

További alkalmazások: Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata

vizsgálata Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (ph,

vizsgálata Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája

Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a

17 További alkalmazások: Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata Fehérje denaturáció nyomonkövetése Protein-ligand kapcsolat vizsgálata Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (ph, ionok) változásának függvényében Dinamikus tulajdonságok vizsgálata Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról Mikroszkópia fluoreszcens jelöléssel Aktin filamentum Mikrotubulus DNS 15

18 Hogyan mérjük a fluoreszcenciát? Egy fluoriméter működésének elméleti sémája fényforrás gerjesztési monokromátor Minta Fény y(gerjesztés) Fény (emisszió) Elektromos jel emissziós monokromátor Detektor Kiértékelés (PC) A fluoreszcencia élettartam Fluoreszcencia lecsengési görbe A fluorofórok sajátsága, jele: 16

19 Fény-anyag kölcsönhatás: hullámhossz - energiaszintek 17

Hasonló dokumentumok

Lumineszcencia spektrometria összefoglaló

Lumineszcencia spektrometria összefoglaló Ismétlés: fény (elektromágneses sugárzás) elnyelés: abszorpció elektron gerjesztés: excitáció alap és gerjesztett állapot atomi energiaszintek, energiaszintek