Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET)"

Irma Török
6 évvel ezelőtt
Látták:

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Biofizika szeminárium PTE ÁOK Biofizikai Intézet Huber Tamás 2014. 02. 11-13.

1 Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Biofizika szeminárium PTE ÁOK Biofizikai Intézet Huber Tamás A gerjesztett állapotú elektron lecsengési lehetőségei Gerjesztés Fluoreszcencia 10-9 s k f Foszforeszcencia 10-3 s k ph s Alap állapot Relaxáció Gerjesztett állapot k q k k ic t Kioltás vagy Energia transzfer Internal conversion (HŐ) 1

Intenzitás: az időegység alatt emittált fotonok számával arányos Kvantumhatásfok: Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra.

1 Q f k f k f k nr e-ad k f k nr Fluoreszcencia kioltás A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében, melyek elektronszerkezete megfelelő

2 Intenzitás: az időegység alatt emittált fotonok számával arányos Kvantumhatásfok: Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra. A kibocsátott fotonok száma, osztva az elnyelt fotonok számával. Élettartam: az az időtartam, ami alatt az intenzitás az részére csökken le. 1 Q f k f k f k nr e-ad k f k nr Fluoreszcencia kioltás A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében, melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő fluorofórral ütközve annak gerjesztési energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják (például hő). Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió. Fluoreszcencia intenzitás lecsökken! 2

3 Kinint kioltjuk klorid ionnal. Nem fog fluoreszkálni a minta. Kinin fluoreszcenciája kéken világít 1. Statikus kioltás A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy komplexet (sötét komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt emittálni. Diffúzió által nem befolyásolt! Fluoreszcencia élettartam nem érzékeny rá! + : Nincs emisszió Fluorofór Kioltó Sötét komplex (a gerjesztés előtt jön létre) Gerjesztés 3

2. Dinamikus kioltás A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok révén

fluorofór átadja az energiáját a kioltónak.

Fluorofór F 0 /F= 0 / + : + Kioltó h*υ Gerjesztés Ütközési komplex (a gerjesztés után

4 2. Dinamikus kioltás A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok révén egymás közelébe kerülnek, ütközési komplexet hoznak létre, majd a gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak. Diffúzió által befolyásolt Fluoreszcencia élettartamot csökkenti! Fluorofór F 0 /F= 0 / + : + Kioltó h*υ Gerjesztés Ütközési komplex (a gerjesztés után jön létre) Fluorofór Kioltó Max Volmer ( ) Otto Stern ( ) Fizikai Nobel díj (1943) Az egyenes meredeksége megadja a Stern-Volmer állandót (K SV )! 4

Ha a fluorofór élettartamát vizsgáljuk a kioltó koncentrációjának a függvényében, akkor lineáris összefüggést kapunk: 0 1 k 0 q 1 KSV q τ 0 kioltó távollétében az élettartam τ kioltó jelenlétében

5 Ha a fluorofór élettartamát vizsgáljuk a kioltó koncentrációjának a függvényében, akkor lineáris összefüggést kapunk: 0 1 k 0 q 1 KSV q τ 0 kioltó távollétében az élettartam τ kioltó jelenlétében mért élettartam k + - állandó, mely jellemzi a fluorofór és a kioltó transzportját valamint a hozzáférhetőséget. K sv egyenes meredeksége, Stern-Volmer állandó F 0 : fluoreszcencia intenzitás a kioltó hiányában F : fluoreszcencia intenzitás a kioltó jelenlétében K sv : Stern-Volmer állandó [Q] : kioltó koncentrációja F 0 1 K [ Q sv ] F 5

6 A fluorofór hozzáférhetőségéről ad információt! Dinamikus kioltás K sv =k q * τ 0 k q : bimolekuláris sebességi állandó, ami a fluorofór és a kioltó diffúziós képességével, illetve a fluorofór hozzáférhetőségével áll összefüggésben A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén! α: a kioltó által hozzáférhető fluorofór aránya 6

7 Dinamikus kioltás Statikus kioltás Kioltók típusai 1. Semleges kioltók: akrilamid, nitroxidok sztérikus viszonyok feltérképezése 2. Töltéssel rendelkező kioltók: jodid, cézium, kobalt töltés viszonyok meghatározása 7

8 Triptofán fluoreszcenciájának kioltása akrilamiddal Fehérjék konformációs állapotának és töltés viszonyainak feltérképezése Membránok permeabilitása Diffúziós állandók meghatározása 8

9 Izotróp rendszer: Irányultság szempontjából homogén rendszer. Anizotróp rendszer: olyan rendszer, melyben vannak kitüntetett irányok. Polarizált fény: Elektromos térerősség vektor síkja a fény terjedése során nem változik. Fluoreszcencia anizotrópia: Polarizált fény segítségével az izotróp fluorofór populációt anizotróppá alakítjuk át. Polarizált fény Nem polarizált fény Polarizátor Polarizált fény Polarizált fény: Elektromos térerősség vektor egy jól definiált síkban rezeg. 9

10 Polarizált fény abszorpciója Abszorpciós vektor: meghatározza a polarizált fény abszorpciójának valószínűségét. Fotoszelekció Csak a megfelelő orientáltságú abszorpciós momentummal rendelkező fluorofórok gerjesztődnek a mintában! A fotoszelekciónak megfelelően, a gerjesztett állapotú fluorofórok a z tengely köré rajzolható igen kis kúpszögű (ϑ) forgás-kúpon belül helyezkednek el. 10

11 A vertikális és horizontális síkban mért intenzitások segítségével lehet meghatározni az anizotrópiát! r I I vv vv I 2I vh vh Perrin egyenlet (Francis Perrin ) Az anizotrópia mértéke függ a rotációs diffúziótól és az élettartamtól, amely alatt az emissziós vektor elfordul. Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúziós képességéről ad információt! 11

Anizotrópia A fluoreszcencia anizotrópia a tér három irányába emittáló fluorofórt jellemzi, vagyis az emissziós polarizáció mértéke, mellyel a molekulák rotációját lehet kimutatni.

12 Anizotrópia A fluoreszcencia anizotrópia a tér három irányába emittáló fluorofórt jellemzi, vagyis az emissziós polarizáció mértéke, mellyel a molekulák rotációját lehet kimutatni. Ha kialakul egy komplex, akkor annak lassabb lesz a mozgása, növekszik az anizotrópia értéke. dimenziónélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja additív!!! Normál érték: -0,2 és 0,4 között van. Ha ettől eltérőt mérünk az valami műtermék, hiba (pl.: fényszórásból). Molekulák rotációs diffúziójának meghatározása Molekulák közti interakciók detektálása Konformációs változások észlelése Membránok fluiditásának meghatározása 12

13 Förster típusú Rezonancia Energia Transzfer FRET - Theodor Förster, 1948 A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula emissziója révén valósul meg! A FRET feltételei Fluoreszcens donor és akceptor molekula. A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm! Megfelelő orientáció Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között. k t = konst. * J(λ) n -4 k f R -6 κ 2 13

14 A FRET molekuláris mechanizmusa Donor Akceptor k ex k nf k f k t k f τ DA : élettartam az akceptor jelenlétében τ D : élettartam az akceptor hiányában F DA : fluoreszcencia intenzitás az akceptor jelenlétében F D : fluoreszcencia intenzitás az akceptor hiányában Donor emissziója csökken! Akceptor emissziója nő! 14

15 E R 6 0 R 6 0 R 6 Förster féle kritikus távolság (R 0 ): Az a donor-akceptor távolság, aminél a transzfer hatásfok 0,5. 15

16 Heterotranszfer: különböző fluorofórok között jön létre Homotranszfer: azonos fluorofórok között jön létre, melyeket kis Stokes-eltolódás jellemez Homotranszfer Heterotranszfer FRET alkalmazások Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása Makromolekulák asszociációs vizsgálata (pl. DNS) Távolság mérés (molekuláris mérőszalag) Fehérjék konformációs vizsgálata 16

zsebben található fluorofór hozzáférhetősége?

17 Gyakorlati alkalmazások Gyakorlati alkalmazások Fluoreszcencia Kioltás Milyen a nukleotid kötő zsebben található fluorofór hozzáférhetősége? Nukleotidkötő-zseb Nukleotidkötő-zseb ε-atp ε-atp Cofilin Profilin 17

F 0 / F 07.05.2014 3,00 2,75 Ksv profilin = 1.02 M -1 2,50 2,25 2,00 1,75 Ksv 1 = 0.

6 M -1 (free -ATP) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Acrylamide (M) Profilin jelenlétében a fluorofór

18 F 0 / F ,00 2,75 Ksv profilin = 1.02 M -1 2,50 2,25 2,00 1,75 Ksv 1 = 0.28 M -1 Ksv cofilin = 0.09 M -1 1,50 = 20% (bound -ATP) 1,25 1,00 Ksv 2 = 53.6 M -1 (free -ATP) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Acrylamide (M) Profilin jelenlétében a fluorofór hozzáférhetősége nagyobb! Cofilin jelenlétében a fluorofór hozzáférhetősége kisebb! Gyakorlati alkalmazások FRET Fehérjék konformációs változása 18

Intensity (cps) 07.05.2014 Gyakorlati alkalmazások FRET Fehérjék interakciója 1.

19 Intensity (cps) Gyakorlati alkalmazások FRET Fehérjék interakciója 1. Donor élettartam Intensity IRF Fit Time Domain Time (ns) 19

20 Intensity (cps) Intensity IRF Fit Time Domain Time (ns) τ D =2,959 ns τ DA =1,191 ns E = 1 (τ DA / τ D ) E=59,8% 20

22 E = 1 (F DA / F D ) F DA = F D = E=55,88% Köszönöm a figyelmet! 22

Hasonló dokumentumok

Fluoreszcencia 2. (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Fluoreszcencia 2. (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Gerjesztés A gerjesztett állapotú elektron lecsengési lehetőségei Fluoreszcencia 10-9 s k f Foszforeszcencia 10-3 s k ph 10-15 s Fizika-Biofizika 2. Huber