Stokes-féle eltolódási törvény

Átírás

1 mléketető: fluorescencia spektrumok Fluorescencia polariáció, aniotrópia FRT Definíció! a. missiós spektrum b. Gerjestési spektrum (ld. absorpciós sp.) Stokes-féle eltolódási törvén A emissiós spektrum maimuma eltolódik a nagobb hullámhossak iránába (energiavesteség!). Gerjestett-állapot Jablonski diagram; hol les a emissiós spektruma? S1 Vibrációs relaáció (10-12s) S1 T1: rendserek köötti átmenet ( s) T1 gerjestés (10-15s) S0 S1 T1 S0 ( hν Alap-állapot S vibrációs sintek 5 Fosforescencia Fluorescens folamatok időtartama átmenet elneveés sebességi állandójele időtartam (s) S(0) S(1)(Sn) gerjestés S(n) S(1) belsőátalakulás k(ic) S(1) S(1) vibrációs relaáció k(vibr.) S(1) S(0) fluorescencia k(f) S(1) T(1) S(1) S(0) rendserek kööttiátmenet sugárásmentes átmenet k(interss.crossing) k(q) T(1) S(0) fosforescencia k(p) T(1) S(0) sugárásmentes átmenet k(qp)

2 SPKTROFLUOROMÉTR SMATIKUS RAJZA F M S 90o Tükör A fluorescencia alkalmaásának előnei - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluorescencia éréken a körneetre M D 90 -os (nem lineáris) elrendeés!!! A fluorescencia alapvető paraméterei Fluorescencia spektrum Intenitás Kvantumhatásfok Élettartam Polariáció A kvantum fiikában a legkisebb adag, amivel eg mérhető menniség növelhető. A energia kvantuma például a foton, eg adod frekvenciájú hullámserű csomag. A elektromágneses sugárás ilen csomagokban érkeik. Kvantumhatásfok (Q) Milen hatásfokkal fordítódik a elnelt energia fénkibocsátásra. emittált fotonoksáma Q = absorbeált fotonoksáma A fluorescencia alapvető paraméterei Fluorescencia spektrum Intenitás Kvantumhatásfok Élettartam Polariáció F0 0.4 F0 Fluorescencia élettartam (τ) A gerjestett állapot élettartama: Időtartam, mel alatt a gerjestett molekulák sáma e-ad résére csökken F = F0e (kt +knr )t t τ = F0e e τ t 2

3 A fluorescencia alapvető paraméterei Fluorescencia spektrum Intenitás Kvantumhatásfok Élettartam Polariáció Polariátor működésének elve Polariáció fogalma A elektromágneses sugárás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatároott görbe mentén moog (térbeli iránultság!). Síkban polariált fén Ha a görbe egenes: lineáris v. sík polariáció Ha a görbe kör: cirkuláris polariáció (Ha a görbe elipsis: elliptikus polariáció) A polariálatlan fénben a polariációs síkok keverednek. A polariált fénben a polariációs síkok össhangban vannak (aonosak). A polariátor Definíció: A polariátor eg olan eskö mel képes a polariálatlan elektromágneses sugárást (fén) olan sugárássá alakítani, melben csak egféle polariációs sík van jelen. Hol találkotunk már polariátorral? 3

4 Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Polariáció, intenitások Optikai aktivitás: poláros fén síkját elforgatják Fénforrás t α = αλ lc Θ polariátor Intenitás eg adott iránban: 2 Ι =Ιma cos Θ Polariátor Párhuamos állás: Mintatartó Θ = 0, I = Ima Merőleges állás: Analiátor Θ = 90, I = 0 Megfigelő királis molekulák nem kell gerjesteni! Polariméter A absorpciós vektor fogalma Fotoselekció MA = absorpciós vektor θa Nincs absorpció (θ= 90o) gerjestés Maimális absorpció (θ= 0o) θa Absorpció ~ cos2θa (ma=1) absorpciós vektor: megsabja a foton absorpciójának valósínűségét. A fotoselekció eredméne Mi történik a fotoselekciót követően? " " Mogás: - transláció; - rotáció. 4

5 Hogan jellemehető e a rotációs mogás? A emissiós vektor M = emissiós vektor IZ θ gerjestés Detektor emissiós vektor: megsabja a foton emissiójának valósínűségét. Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a komponens! SPKTROFLUOROMÉTR SMATIKUS RAJZA F M P S IZ θ IZ vs. Isum = IZ + + Vag vertikálisan, vag horiontálisan heleük el a polariátorokat: 90o P M IVV IVH (A teljes intenitásho tudjuk visonítani.) IHV IHH D Polariátorokat alkalmaunk!!! Íg a teljes intenitás: Isum = IZ + + Fluorescencia polariáció Isum = IVV + IVH + IVH IZ θ Isum = IVV + 2IVH 5

6 Fluorescencia polariáció p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) Ha τ = 0 lenne: IVV ma., IVH = 0, tehát p = 1. dimenió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja nem additív!!! értéke 0-tól 1-ig váltohat (ld. követkeő dia). G = IHV / IHH Ha τ nagon hossú lenne: IVV = IVH, tehát p = 0. De nem additív!!! missiós aniotrópia Fluorescencia aniotrópia r = (IVV - GIVH) / (IVV + 2GIVH) dimenió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától G = IHV / IHH a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja additív!!! Isum = IZ + + Isum = IVV + IVH + IVH Isum = IVV + 2IVH Mint láttuk, rotációs mogást ír le! A aniotrópia jelentése és alkalmaásai Polariált fén IZ θ τ IZ θ Résben polariált fén Rotációs diffúió 6

7 A aniotrópia időfüggése Határérték aniotrópia (r0) A teljes modulatlan, fagott fluorofór aniotrópiája. r I(t) = I0ep-t/τ r0 = 2 3cos2 β Absorpciós vektor β missiós vektor r(t) = r 0 ai ep( t/θ) β: a absorpciós és emissiós vektor által beárt sög. t β r Mire emléketet a időfüggés? Alkalmaások Mitől függ a aniotrópia értéke? - A rotációs mogás gorsaságától; rotációs diffúió; - A rendelkeésre álló időtől; fluorescencia élettartam! Serkeeti tulajdonságok visgálata Fehérje denaturáció nomonkövetése Protein-ligand kölcsönhatás visgálata Serkeet visgálata a körneeti paraméterek (ph, ionok) váltoásának függvénében Dinamikus tulajdonságok visgálata Membránho kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viskoitásról Fehérjékhe kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a fehérjemátri fleibilitásáról Fluorescencia Reonancia nergia Transfer (FRT) - Theodor Förster, 1948 A FRT Feltételei A Förster Rpusú energiatransfer a gerjested állapotban lévő fluoreskáló molekula (donor), valamint eg megfelelő spektroskópiás követelméneket kielégítő molekula (akceptor) kööd dipól- dipól kölcsönhatás révén, sugárás nélküli energiaátadás formájában jön létre. A gerjested donor relaációja a akceptor molekula emissiója révén valósul meg.! Fluorescens donor és akceptor molekula. A donor és akceptor molekula köö^ távolság 2-10 nm.! Ábedés a donor emissiós spektruma és a akceptor absorpciós spektruma kööd. k t~1/r 6 R 7

8 Spektrális ÁAedés Fluorescencia Reonancia nergia Transfer k t ~1/R 6 R k t = konst. * J(λ) n - 4 k f R - 6 κ 2 J(λ): ábedési integrál, n: törésmutató ( ), k f : a fluorescencia emissiójának sebességi állandója, R: a donor és a akceptor molekula köö^ távolság, κ: orientációs faktor (2/3) k t = (1/τ D ) * (R 0 /R) 6 k t : a energia transfer sebességi állandója, τ D : a donor molekula fluorescencia éledartama a akceptor hiánában, R: a donor és a akceptor molekula köö^ távolság, R 0 : Förster távolság a donor és a akceptor molekula kööd. KriCkus Förster Távolság (1) KriCkus Förster Távolság (2) A a távolság melen a FRT hatásfok felére csökken (transferhatásfok 0.5). FRT hatásfok R 0 = [η -4 Q 0 κ 2 J(λ)] 1/6 κ 2 (κ-néget) = orientációs faktor, a donor emissiós vektorának és a akceptor absorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít várható érték 0 4 köött általában a k 2 = 2/3 (gors mogások miatti átlagolódás követketében) η = a köeg törésmutatója ( ) Q 0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiánában J(λ) = átfedési integrál nergia Transfer Hatásfoka Távolságmérés FRT Segítségével (Molekuláris Mérősalag) FRT hatásfok 1: stead- state mérések = 1 (F DA / F D ) 2: időfüggő mérések (fluorescencia éle?artam) = 1 (τ DA / τ D ) 8

9 A donor intenitáscsökkenése a akceptor jelenlétében Össefoglalás 1: stead- state mérések = 1 (F DA / F D ) FRT távolságok meghatároására alkalmas megfelelő donor-akceptor párok esetén Molekulák köötti kölcsönhatások tanulmánoása Molekulákon belüli serkeeti váltoások tanulmánoása 9