Infravörös és CD spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgálatában

Átírás

1 Infravörös és C spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgáatában Mi történhet, ha egy mintát fénnye viágítunk meg? megviágító fény (enyet fény) minta átjutott fény Abszorpció UV-VIS, IR, C spektr. Smeer Lászó kibocsátott fény Lumineszcencia (Fuoreszcencia és Foszforeszcencia) szórt fény Raman és Rayeigh szórás Abszorpciós és emissziós spektroszkópia Az átjutott vagy kibocsátott fény anaizáása a huámhossz függvényében. Információ: atomok, moekuák azonosítása, moekuáris szintű szerkezetvátozások (konformációvátozások) detektáása, koncentráció meghatározás Miért nye e i. bocsát ki fényt egy atom v. moekua? Energiaátmenet: d. abonski diagram Gerjesztett eektron- és vibrációs áapot* Gerjesztett eektronáapot Vibrációsan gerjesztett á.* Aapáapot S S 0 E *csak moekuákná!

2 E Miért nye e i. bocsát ki fényt egy atom v. moekua? S S 0 UV-VIS IR abszorpció Raman Fuoreszcencia Foszforeszcencia T ΔEhfhc/λ 0 0 Abszorpciós spektroszkópia Abszorpciós törvény x dx x +d d d dx d μdx d μdx d μdx n μx + const 0 e μx Abszorpciós spektroszkópia Lambert-Beer törvény Evi aapja: abszorpciós törvény: 0 e -μx aho μ(anyag,c,λ) Lambert-Beer törvény: A g 0 ε ( λ) cx spektrum: A(λ) mérés: spektrofotométer referencia odat ( 0 ) információ: azonosítás koncentráció. Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ800 nm - mm közép infra tartomány:,5-50 μm abszorpciós spektroszkópia az enyet infravörös sugárzás moekuarezgéseket ket érzékeny a moekuaszerkezetre speciáis detektáás: FT spektrométer (FTIR spektroszkópia)

3 Az infravörös spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer fényforrás tk 6.7 ábra tk 6.8 ábra FTIR eve részetesen Fourier transzformáció x/ xretardáció E i const (-cos(πx/λ)) C +const cos(πx/λ) AC 0 n 0 i cos(πx/ λ i d 0( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ ) n Ai sin( ωit) E A sin(ωt) E 0 da sin( ωt) dω dω Egy f(t) függvény Fourier transzformátja a g(x) fügvény: F( f ( t)) F πiνt f ( t) e dt g( ν ) A Fourier transzformáció inverze: πiνt ( g( ν )) g( x) e dν f ( t)

4 A Fourier transzformáció szemétetése Fourier transzformáció inverz Fourier transzformáció A spektrum számoása a Fourier transzformációs spektrométerben Az interferométeren keresztüjutott sugárzás: 0 d 0( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ éppen a d ( 0 λ) mennyiség cosinus transzformátja dλ d A spektrum a ( 0 λ) -nek a mintán vaó dλ áthaadása után megmaradt részének és a d ( 0 λ) dλ -nak a hányadosa (transzmissziós spektrum) Micheson interferométer áó tükör féigáteresztő tükör apertúra fényforrás mozgó tükör FT mintatér fényforrás detektor minta

5 Moekuarezgések Az eektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az eektronok nem befoyásoják. A kasszikus fizikai eírásban az atommagok közti kötést, egy rugóva vesszük figyeembe. Moekuarezgések: kétatomos moekua a középiskoábó ismert: m f π m Δ Δ m m Δ Δ + + m m m Δ F F F / /

6 m + m tehát:, amit az m f π m egyenetbe heyettesítve a rezgési frekvencia: ( m + m) f π mm az m mm mennyiséget redukát redukát m + m tömegnek is nevezik, ezze a frekvencia: f π m redukát A huámhossz: c mredukát λ πc f Az infravörös spektroszkópiában a λ reciprokát, a huámszámot (ν) hasznáják: ν ν: hány huám fér e egységnyi hosszúságon? [cm - ] λ πc m redukát Péda: CO A mért rezgési huámszám: ν 43 cm - λ4,67μm f 6, Hz m C 0-6 kg, m O, N/m kg Ha ν ismert, számoható ha ismert, ν számoható Kvantummechanikai eírás Kasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsoata Kasszikus kép Energianívók E ψ n3 E ψ n3 n n n n0 x E hf ( n + ) n n 0,,. f π m redukát rezonancia az f frekvenciájú fénnye ΔE u.a.!!! ΔEhf n n0 x

7 A rezgési frekvencia függése a tömegtő és a kötéserősségtő Sokatomos moekuák rezgései Tömeg: Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 400 A-H 750 C-H 3000 Si-H 50 Ge-H 070 N-H 3400 P-H 350 As-H 50 O-H 3600 S-H 570 Se-H 300 F-H 4000 C-H 890 Br-H 650 Kötéserősség: C-N: 00 cm -, CN: 660 cm -, C N: 0 cm -. N atomos moekua: 3N szabadsági fok, 3-3 a tejes moekua transzációja i. rotációja 3N-6 rezgési szabadsági fok (ineáris moekuákná csak 3N-5) normárezgések normákoordináták Víz (O-H): 3600 > nehézvíz: 600 cm - Normákoordináták A kétatomos moekua pédáján bemutatva: x c x O x O Normárezgések Minden atom ugyanazza a frekvenciáva, fázissa, de küönböző ampitúdóva és irányban rezeg. P. víz: m C m O x C Átaános esetben 3N dimenziós koordinátarendszer forgatása Lineáris transzformáció (mátrixműveet) A normá módusok nem hatnak köcsön egymássa.

8 A víz normárezgései Néhány tipikus rezgési frekvencia Ezek nem rezgések, hanem gátot forgások (ibráció) Péda: Formadehid Anaitikai akamazások szintézis: közti és végtermék azonosítás szerkezet bizonyítás metaboit kimutatás gyógyszereenőrzés (tisztaság vizsgáat) Megj.: Lambert-Beer tv. itt is igaz, koncentráció meghatározás is ehetséges. forrás:

9 Moekua azonosítás moekua azonosítás C 4 H 8 O Fingerprint (ujjenyomat) tartomány forrás: Makromoekuák rezgései Az N-metiacetamid mint a fehérjeánc gerincének modeje Gobáis rezgések (bonyoutak) Lokaizát rezgések, p: CH rezgések a ipidekben amid rezgések a fehérjékben (acetamid rezgések)

10 Fehérjék rezgési spektroszkópiája A víz abszorpciós spektruma Gerinc: amid rezgések konformáció (másodagos szerkezet) H/ csere, (harmadagos szerkezet) Odaáncok köcsönhatások más moekuákka p Ca + kötés Fontos technikai megj.: nehézvíz ( O) Víz és nehézvíz spektrumok A fehérjék amid rezgései Bandekar BBA 0 (99) 3

11 A fehérjék amid rezgései Az amid I vibráció és a másodagos szerkezet amid I CO rezgés H-híd miatt konformációérzékeny amid II N-H nyújtási rezgés H- cserére érzékeny Szerkezet kompaktsága (harmadagos szerk.) β emez α heix A másodagos szerkezeti eemekhez tartozó jeegzetes amid I je Intramoekuáris szerkezet β-emez rendezeten α-héix Intermoekuáris kücsönhatás Intermoekuáris antiparae β-emez ν cm ν cm -

12 Az amid I sáv átapoó komponensek összege: dekovoúció Akamazások ipid fázisátaakuás fehérjedenaturáció A A ν ν Fourier öndekonvoúció Vonaak szétváasztása vonakeskenyítésse Meersman és mtsai. Biophys. BPTI bovine pancreatic trypsin inhibitor aggregáció Miogobin (Nyomáscikus)

13 Ca + kötés Parvabumin aggregáció Absorbance 8 C 43.8 C 67.5 C 80.7 C 90 C 30 C Wavenumber (cm - ) 50 C Cirkuáris dikroizmus spektroszkópia Síkban poáros: Poáros fény Cirkuárisan poáros

14 in. po jobbra+ bara cirk. po. A jobbra és bara forgó cirkuárisan poarizát fénysugarakka a kiráis moekuák küönbözőképpen hatnak köcsön: ΔAA L -A R Δε c x Δεε L -ε R Eipticitás: θ tg θ b/a b a θ.303 ( A ) 80 L AR 4 π Lambert-Beer tv.: θ c θm (θ m : moáris eipticitás) [deg] A C spektrométer vázata C és a fehérjeszerkezet Figure 4 The far-uv C spectra associated with various types of secondary structure eements in proteins. Red: α-heix; bue: antiparae β-sheet; green: type I β-turn; orange: irreguar structure. (ata taken from the Encycopedia of Life Sciences)

15 A) triosephosphate isomerase B) hen egg ysozyme C) myogobin ) chymotrypsin red:heix. green:strand, yeow:other. The Structure and C spectrum of Subtiisin heix sheet coi Vége