ALKALOIDOK MEGHATÁROZÁSAMÁKGUBÓBAN

Átírás

1 ALKALOIDOK MEGHATÁROZÁSAMÁKGUBÓBAN DISZPERZIÓS ÉS FOURIER-TRANSZFORMÁCIÓS KÖZELI INFRAVÖRÖS SPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREKKEL 1 Izsó Eszter -Dr. Gergely Szilveszter

2 A MÁK A mák egyéves, lágyszárú, 5-15 cm magas növény B 1 -, B 6 -, és B 2 -vitamin, illetve niacinforrás, emellett kálciumot, cinket, mangánt, rezet, vasat, foszfort, káliumot és magnéziumot tartalmaz Fő alkaloidjai: morfin, kodein, tebain, papaverin Gyógyászatban alkalmazzák leginkább Alkaloidok Máktokban lévő mennyiségük (%) morfin,4-1,5 narkotin,3-1, papaverin,3-1, kodein, tebain,3-,5 2

3 AZ ALKALOIDOK KÉMIAI SZERKEZETE Morfin Kodein Papaverin Tebain 3

4 A KÖZELI INFRAVÖRÖS SPEKTROSZKÓPIA Sir William Herschelé volt az első kísérleti leírás az IR sugárzásról (18) W. W. Coblentz majd száz évvel később készített egy IR spektrométert Nincs két vegyület, amelynek egyforma lenne az IR spektruma, ha még ugyanazokból az atomokból állnak is pl. etil-alkohol vs. dimetil-éter: C 2 H 6 O, de CH 3 CH 2 OH vs. H 3 C O CH 3 A hasonló kémiai csoportok elnyelési sávjai is hasonlóak NIR méréstartomány (8-25 nm) elterjedése a gyakorlatban a 6-as évek közepétől (Karl Norris) Kereskedelmi forgalomba kerülő spektrofotométerek 7-es évek második felétől: diszperziós 9-es évek elejétőltől: Fourier-transzformációs Diszperziós NIR spektrofotométer FOSS NIRSystems 65 + Rapid Content Analyzer FT-NIR spektrofotométer Perkin-Elmer Spectrum 4 + Near-infrared Reflectance Accessory 4

5 CÉLKITŰZÉSEK A vizsgált máktok őrlemény minták segítségével különböző infravörös spektrométerek adatfeldolgozásának optimálása az analóg módon feldolgozott spektrumok alapján Évjárat hatás megfigyelése (28, 29, 21) A vizsgált minták spektrumainak minőségi értékelése, többváltozós adatelemző módszerekkel Az egyes alkaloidok mennyiségi értékelése a legkisebb négyzetek (partial least squares=pls) módszerével, illetve spektrumkönyvtár felvételével 5

6 .25 KEZELETLEN SPEKTRUMOK ÉRTÉKELÉSE PC 2 (.51 %).5. PC 2 (.51 %) PC 1 (99.44 %) PC 3 (.3 %) Főkomponens elemzés (PCA) Diszperziós készülék esetén Beterhelt minták PC 3 (.3 %) = 28 r = 29 = 21évekből származó minták PC 1 (99.44 %)

7 .4 KEZELETLEN SPEKTRUMOK ÉRTÉKELÉSE PC 2 (1.78 %).1. PC 2 (1.78 %) PC 1 (98.8 %) PC 3 (.9 %) Főkomponens elemzés (PCA) FT-NIR készülék esetén Beterhelt minták PC 3 (.9 %) = 28 r = 29 = 21évekből származó minták PC 1 (98.8 %)

8 NIR,1 PCA-BETERHELT VS. KIEXTRAHÁLT MINTÁK ESETÉN,1,8,8,8,6,6,6,4,4,4,2 PC 2 (.18 %),2, PC 2 (.18 %),2, PC 3 (.4 %), -,2 -,2 -,2 -,4 -,4 -,4 -,6 -,6 -,145 -,14 -,135 -,13 -,125 -,12 -,115 -,11 -,15 -,1 PC 1 (99.77 %) -,6 -,8 -,6 -,4 -,2,,2,4,6,8 PC 3 (.4 %) -,8 -,145 -,14 -,135 -,13 -,125 -,12 -,115 -,11 -,15 -,1 PC 1 (99.77 %) FT-NIR = beterhelt minták = kiextrahált minták (29) PC 2 (.52 %),1,8,6,4,2, -,2 -,4 -,6 -,8 -,1 -,12 -,14 -,13 -,125 -,12 -,115 -,11 -,15 -,1 -,95 -,9 -,85 -,8 -,75 PC 1 (99.42 %) PC 2 (.52 %),1,8,6,4,2, -,2 -,4 -,6 -,8 -,1 -,12 -,14 -,6 -,4 -,2,,2,4,6,8 PC 3 (.5 %) PC 3 (.5 %),8,6,4,2, -,2 -,4 -,6 -,13 -,125 -,12 -,115 -,11 -,15 -,1 -,95 -,9 -,85 -,8 -,75 PC 1 (99.42 %) 8

9 ELSŐ ÉS MÁSODIK DERIVÁLT SPEKTRUMOK NIR Az első és második deriváltak képzése a kezeletlen spektrumokból más-más beállításokkal történik: Diszperziós NIR esetén: 2, 4, 8, 12, 16, 2 nm-es (1, 3, 5, 7, 9, 11 pontos) kapu FT-NIR esetén: 5, 9, 13, 19, 25, 37, 49, 149 pontos kapu 1. derivált log (1/R) [2 nm] 1. derivált log (1/R) [2 nm],225, derivált,125,75,25 -,25 2 nm -, hullámhossz (nm),12,1 1. derivált,8,6,4,2, -,2 2 nm -, hullámhossz (nm) 9

10 Beállítások hatása a diszperziós és FT-NIR spektrumok zajosabb szakaszaira a második deriválás során NIR FT-NIR 2. derivált log (1/R) [2 nm],45,35 2. derivált,25,15,5 -,5 -,15 -,25 -,35 2 nm -, hullámhossz (nm) 2. derivált log (1/R) [5 pont] 6,E-5 4,E-5 2. derivált 2,E-5,E+ -2,E-5-4,E-5-6,E-5-8,E-5-1,E-4 5 pont -1,2E hullámhossz (nm) 2. derivált log (1/R) [2 nm],9,7,5,3,1 -,1 -,3 -,5 -,7 -,9 2. derivált 2 nm hullámhossz (nm) 2. derivált log (1/R) [49 pont] 3,E-5 2,E-5 2. derivált 1,E-5,E+ -1,E-5-2,E-5 49 pont -3,E hullámhossz (nm) 1

11 ASSZIGNÁLÁS (CSÚCSAZONOSÍTÁS) 2. derivált log (1/R) [8 nm],1,8,6,4,2, -,2 -,4 -,6 -,8 -,1 2. felhangok -, hullámhossz (nm) 2. derivált log (1/R) [8 nm],3,2,1, -,1 -,2 1. felhangok -, hullámhossz (nm),15 2. derivált log (1/R) [8 nm],1,5, -,5 -,1 -,15 -,2 kombinációk -, hullámhossz (nm) második felhangok nm első felhangok nm kombinációs sávok 2-25 nm 11

12 Hullámhossz Struktúra Kötés 1192 CH 3 C H 2. felhang 1356 CH 3 C H kombináció 1426 ArOH O H 1. felhang 1478 CONHR N H vegyértékrezgés, 1. felhang 1536 keményítő O H vegyértékrezgés, 1. felhang 1574 CONH N H vegyértékrezgés, 1. felhang C H vegyértékrezgés, CH 2 felhang C H vegyértékrezgés, CH 2 felhang 1912 P OH O H vegyértékrezgés, 1. felhang 1966 keményítő O H vegyértékrezgés 254 fehérje 214 keményítő vagy cellulóz 12

13 R 2 (C) and R 2 (CV) raw spectra 9 9 D1OD 2/ nm D1OD 4/ nm 1 1 D1OD 8/ nm D1OD 12/ nm MENNYISÉGI ELEMZÉS PLS KALIBRÁCIÓK-MORFIN NIR D2OD 2/ nm D2OD 16/ nm D2OD 12/ nm D2OD 8/ nm D2OD 4/ nm D2OD 2/ nm D1OD 2/ nm D1OD 16/ nm Factor R 2 (C) and R 2 (CV) FT-NIR D2OD 19 pt D2OD 13 pt D2OD 9 pt D2OD 5 pt D1OD 149 pt D1OD 49 pt D1OD 37 pt D1OD 25 pt D1OD 19 pt D1OD 13 pt D1OD 9 pt D1OD 5 pt raw spectra D2OD 149 pt D2OD 49 pt D2OD 37 pt D2OD 25 pt Factor RMSE(C) and RMSE(CV) * Factor RMSE(C) and RMSE(CV) * Factor raw spectra D1OD 2/ nm D1OD 4/ nm D1OD 8/ nm D1OD 12/ nm D1OD 16/ nm D1OD 2/ nm D2OD 2/ nm D2OD 4/ nm D2OD 8/ nm D2OD 12/ nm D2OD 16/ nm D2OD 2/ nm raw spectra D1OD 5 pt D1OD 9 pt D1OD 13 pt D1OD 19 pt D1OD 25 pt D1OD 37 pt D1OD 49 pt D1OD 149 pt D2OD 5 pt D2OD 9 pt D2OD 13 pt D2OD 19 pt D2OD 25 pt D2OD 37 pt D2OD 49 pt D2OD 149 pt 13

14 A TÖBBI ALKALOIDRA KAPOTT PLS KALIBRÁCIÓ Diszperziós készülék esetén: A kodeinnél az alapspektrum kalibráció 15 faktoros, és egyedül a második deriváltak 2 nm-es kapuértéknél megfelelő: 1 f Az RMSE értékek sem kielégítőek: RMSE (C) <<< RMSE (P) Tebainnál az alapspektrum magas faktor értékű, hibaértékek között nagy különbségek vannak, ezen modellek túlillesztettek: f f max Narkotin, papaverin: RMSE (C) <<< RMSE (P) FT-NIR esetén: A kodein, tebain, narkotin esetén megfelelő a faktorszám, de alacsonyabbak az R 2 értékek is, és az RMSE sem megfelelő 14

15 SPEKTRUM KÖNYVTÁR Beterhelt és kiextrahált minták között Első ill. második deriváltak és szórás korrekciók SNV ( standard normal variate), MSC (multiplicative scatter correction) és alapvonal korrekció (derivált, offset, slope, curve) Távolság: a két populáció elválásának mértéke Elfogadási arány Elutasítási arány 15

16 MENNYISÉGI ELEMZÉS-távolság 12 Inter material distance S SNV MSC Offset SNV + Offset MSC + Offset Slope SNV + Slope MSC + Slope Curve SNV + Curve MSC + Curve D1 5 D1 9 D1 13 D1 19 D1 25 D1 37 D1 49 D1 149 SNV + D1 19 MSC + D1 19 D2 5 D2 9 D2 13 D2 19 D2 25 D2 37 D2 49 D2 149 SNV + D2 19 MSC + D

17 MENNYISÉGI ELEMZÉSelfogadási arány % Recognition rate S SNV MSC Offset SNV + Offset MSC + Offset Slope SNV + Slope MSC + Slope Curve SNV + Curve MSC + Curve D1 5 D1 9 D1 13 D1 19 D1 25 D1 37 D1 49 D1 149 SNV + D1 19 MSC + D1 19 D2 5 D2 9 D2 13 D2 19 D2 25 D2 37 D2 49 D2 149 SNV + D2 19 MSC + D

18 MENNYISÉGI ELEMZÉSelutasítási arány % Rejection rate S SNV MSC Offset SNV + Offset MSC + Offset Slope SNV + Slope MSC + Slope Curve SNV + Curve MSC + Curve D1 5 D1 9 D1 13 D1 19 D1 25 D1 37 D1 49 D1 149 SNV + D1 19 MSC + D1 19 D2 5 D2 9 D2 13 D2 19 D2 25 D2 37 D2 49 D2 149 SNV + D2 19 MSC + D

19 ÖSSZEFOGLALÁS Minőségi vizsgálatok: Nyers adatok: főkomponens elemzése, populációk elválása Beterhelt vs. kiextrahált minták (PCA) Második derivált spektrumok képzése ill. csúcsazonosítás Mennyiségi vizsgálatok: A PLS kalibráció során a műszerek képességéről kapott adatok: diszperziós NIR a megfelelőbb erre a mintaseregre Jobb az RMSE és az R 2 is Spektrum könyvtár 19

20 2 KÖSZÖNÖM AFIGYELMET!