Antigén szervezetbe bejutó mindazon corpuscularis vagy solubilis idegen struktúra, amely immunreakciót vált ki Antitest az antigénekkel szemben az

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Antigén szervezetbe bejutó mindazon corpuscularis vagy solubilis idegen struktúra, amely immunreakciót vált ki Antitest az antigénekkel szemben az"

Ödön Veres
8 évvel ezelőtt
Látták:

2 Antigén szervezetbe bejutó mindazon corpuscularis vagy solubilis idegen struktúra, amely immunreakciót vált ki Antitest az antigénekkel szemben az immunválasz során termelődött fehérjék (immunglobulinok) Humorális immunválasz antigénekkel szemben immunglobulinok képződnek

antigénekkel szemben az immunválasz során termelődött fehérjék

3 Cél: a kórokozó (testidegen mikroorganizmus) eltávolítása Immunválasz a felismert antigén eliminálására (semlegesítésére és/vagy lebontására) szerveződik

4 A kórokozók felismerése Az immunválasz kialakításában részt vevő komponensek mozgósítása Tényleges eltávolítás folyamata

5 Az antigénre nem specifikus sejtes elemek: - különböző típusú fagocitáló sejtek - természetes ölő (NK) sejtek Az antigénre nem specifikus humorális faktorok: - citokinek - komplement rendszer

6 Az antigénre specifikus sejtes elem a lymphocyta, mely a felszínén az antigén felismerésére alkalmas receptorkészletet hordoz Az antigénre specifikus humorális faktorok az immunglobolinok

7 Antigén kötőhely Könnyűlánc Nehézlánc

8 ASPECIFIKUS (VELESZÜLETETT) IMMUNITÁS SPECIFIKUS (SZERZETT) IMMUNITÁS Antigén-independens Antigén-dependens Azonnali válasz Késleltett válasz NINCS immunológiai memória VAN immunológiai memória

9 Primer immunválasz Az immunrendszer első találkozása az adott antigénnel Lassabban alakul ki Alacsonyabb Immunglobulin-szint jön létre Hamarabb lecseng Domináns immunglobulin: IgM

10 Szekunder immunválasz Második (sokadik) találkozás ugyanazzal az antigénnel Gyorsabban alakul ki (memóriasejtek!) Magasabb Immunglobulin-szint jön létre Tovább perzisztál Domináns immunglobulin: IgG

11 Szérum ellenanyag mennyisége Reinfekció Hetek

12 antigén - antitest specifikus kapcsolódása képződő immunkomplex detektálása egyik komponens a betegből származik, a másikat mi adjuk a reakcióközeghez: antigén kimutatás antitest kimutatás

13 IgG és IgM elkülönítése A friss fertőzés (IgM) vagy lezajlott fertőzés (IgG) kimutatása Védőoltás hatékonyságának ellenőrzése Beküldött minta: teljes vér

14 IgM és IgG Az egyén még nem találkozott a patogénnel Nincs védettség az egyén fogékony IgM + és IgG Akut, friss, az adott patogénnel először fertőződik Kezelés szükséges lehet Teratogén kórokozók és terhességi szűrővizsgálatok! (TORCH) IgM és IgG + Régi fertőzés (vagy találkozás a patogénnel), az egyén védett (immunis) Vakcina révén kialakított védettség IgM + és IgG + Friss fertőzés átfedő szakasza Korábbi fertőzés (vagy találkozás) utáni újabb fertőzés (reinfekció)

(TORCH) IgM és IgG + Régi fertőzés (vagy találkozás a patogénnel), az egyén védett (immunis) Vakcina révén

15 Immunkromatográfiás eljárás Agglutináció (flokkuláció) ELISA technikai megoldások: Hagyományos (indirekt) Capture Capture one step Reverz (kompetitív) (hepatitis szerológiában mind fellelhető)

16 Immunkromatográfiás eljárás A FAST-STEP DUO ROTA-ADENO TESZTLAP egy síkáramlású, gyors immunkromatográfiás teszt a Rotavírus és az Adenovírus kvalitatív kimutatására humán székletből. Pozitív Negatív Invalid

immunkromatográfiás teszt a Rotavírus és az Adenovírus

17 Definíció: agglutináció alatt a korpuszkuláris antigének ellenanyagokkal történő kapcsolódásakor létrejövő összecsapódást értjük. antigén kimutatás (Streptococcus tipizálás) ellenanyag kimutatás (RPR)

18 Szubsztrát (pl.: hepatitis C ellenanyag kimutatás)

19 1. Szilárd fázis inkubációja, ha a minta tartalmaz Szilárd fázishoz kötött Ag-re sepcifikus antitesteket azok az Ag-hez kötődnek 2. Mosási lépés: a minta egyéb komponenseinek eltávolítása 3. Második inkubáció a kikötődött antigén specifikus ellenanyag, enzimmel (tormaperoxidáz) konjugált anti-humán antitesttel való kötődése 4. Szubsztrát hozzáadása után reakcióba lép az enzimmel és látható jelet ad, mely arányos a mintában jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok mennyiségével Szubsztrát Primer antitest Enzimmel konjugált szekunder antitest

Második inkubáció a kikötődött antigén specifikus ellenanyag, enzimmel (tormaperoxidáz) konjugált anti-humán antitesttel való kötődése 4.

20 Enzimmel konjugált monoklonális ellenanyaggal kapcsolt rekombináns HBcAg Szubsztrát Mintában levő specifikus IgM anti-humán IgM Capture antitest Capture =rögzítő

21 Minta Enzimmel konjugált ellenanyag Szubsztrát Színes végtermék 120 perc Inkubáció 37⁰C anti-hbs ellenanyag Mosás 1. Specifikus anti-hbs monoklonális ellenanyag szilárd fázishoz kötve 2. A minta az enzimmel (torma-peroxidáz) konjugált monoklonális ellenanyaggal együtt mérjük fel (a két monoklonális ellenanyag két különböző vírusepitóphoz kötődik) specifikus immunkomplex 3. Egylépéses inkubáció 4. Mosási lépés során a nem kötődött szérumfehérjék eltávolítása 5. A bekötődött HBsAg immunkomplex jelenléte a szubsztrát hozzáadása által színes végtermékké alakul 6. Enzimatikus reakció leállítása termék optikai denzitásának mérése (szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg mennyiségével)

22 Neutralizáló ellenanyag Minta Enzimmel konjugált ellenanyag Szubsztrát Színes végtermék 120 perc Inkubáció 37⁰C anti-hbs ellenanyag Mosás 1. Specifikus anti-hbs monoklonális ellenanyag szilárd fázishoz kötve 2. A minta az enzimmel (torma-peroxidáz) konjugált monoklonális ellenanyaggal együtt mérjük fel (a két monoklonális ellenanyag két különböző vírus-epitóphoz kötődik) specifikus immunkomplex 3. Egylépéses inkubáció 4. Mosási lépés során a nem kötődött szérumfehérjék eltávolítása 5. A bekötődött HBsAg immunkomplex jelenléte a szubsztrát hozzáadása által színes végtermékké alakul 6. Enzimatikus reakció leállítása termék optikai denzitásának mérése (szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg mennyiségével)

23 HbcAb kompetitív ELISA Ellenanyag pozitív szérum minta Y E-jelölt kompetitív ellenanyag Y Y Y Y Y * YYY Ellenanyag negatív szérum minta Y E-jelölt kompetitív ellenanyag * Y * * * YY Y * * * YYY

24 Gesztációs CMV diagnosztika anyai oldal Anti-CMV IgG: + + Anti-CMV IgM: + + nincs teendő látens fert. IgG aviditás teszt 2 független assay! ismétlés sz.e. 3 hét magas aviditás alacsony aviditás nem jellemezhető látens/rekurrens fert. anyai oldalon nincs teendő primer fertőzés primer fertőzés nem zárható ki magzati/neonatális vizsgálatok

25 Gesztációs CMV diagnosztika anyai oldal Anti-CMV IgG: + + Anti-CMV IgM: + + nincs teendő látens fert. IgG aviditás teszt 2 független assay! ismétlés sz.e. 3 hét magas aviditás alacsony aviditás nem jellemezhető Ellenanyagok affinitás érése - ~ 4 hónap alatt megy végbe alacsony aviditású ellenanyagok 6-8 M ureával lemoshatók

26 Előnye: egy vizsgálati eljárás során egy reakció közegben adott kórokozó több antigénjével szembeni ellenanyag válasz detektálható, csökkentve ezzel az aspecifikus reakciók zavaró hatását a szerológiai eredmények interpretálásában!

27 1. Nagy tisztaságú, rekombináns Ag-ek a nitrocellulóz membránhoz kötve 2. A vizsgálandó mintában levő, adott Ag-re specifikus antitestek kötődése 3. Mosási lépések célja a nem kötődött komponensek eltávolítása 4. Torma-peroxidáz enzimmel konjugált anti-human IgG/IgM ellenanyag kötődése 5. Szubsztrát oldhatatlan színes csapadékot képez 6. Megjelent sávok értékelése

29 Definíciója: antigén-antitest komplex kialakulását fluoreszkáló anyagok FITC (fluoreszcein-izotiocianát) által tesszük láthatóvá. Direkt IF-vizsgálat során a fluoreszcens jelet adó ellenanyagok közvetlenül a keresett molekulához (kórokozó antigénje) kötődnek. Indirekt IF-vizsgálat esetében a fluorokrómmal jelzett ellenanyagok egy másik a keresett molekulára specifikus ellenanyag molekulához kötődnek.

30 Módszer: indirekt antigén (CMV pp65 mátrix proteinje) kimutatása CMV fertőzött leukocitákban Minta: heparinnal alvadásgátolt teljes vér Immunszupprimált betegek esetében súlyos CMV fertőzés esetében is késik az ellenanyagválasz! PCR: költségesebb és időigényesebb

31 1. Leukociták kivonása a teljes vérből vörösvértestek lízise által 2. Kenetkészítés citocentrifuga 3. Fixálás formalin tartalmú oldattal 4. Permeabilizálás CMV pp65 antigén hozzáférhetővé tétele a specifikus ellenanyag számára 5. Festés anti-cmv pp65 monoklonális ellenanyag kötődése, majd a FITC-al konjugált ellenanyag kötődése Antitestek Mosás Mosás Értékelés Antigének FITC konjugált antitest

A konjugátumhoz EVANS BLUE sejtek fehérjéinek jelölésére alkalmas festéket adunk, így a citoplazma

32 Értékelés Fluoreszcens mikroszkóp UV-fény gerjesztő hatása által a FITCmolekula zöldesen fluoreszkáló látható fényt bocsát ki pozitív eredmény esetében (vizsgálati mintában jelen van a keresett antigén) A konjugátumhoz EVANS BLUE sejtek fehérjéinek jelölésére alkalmas festéket adunk, így a citoplazma fehérjéinek vörös fluoreszkálása háttérként, nagy mértékben segíti az értékelést!

hitelesítő (standard) minta fluoreszcencia értékeinek összehasonlítása

33 - teljesen automatizált rendszer Eredmények: Vizsgálati minta és a hitelesítő (standard) minta fluoreszcencia értékeinek összehasonlítása --> RFV=Relative Fluorescence Value Összehasonlítás a küszöbértékkel: > v. = küszöbérték: + < küszöbérték: -

A pipettahegy (SPR) felülete specifikus monoklonális antitesttel bevont, s egyben pipettázó funkciót is ellát. www.

34 A pipettahegy (SPR) felülete specifikus monoklonális antitesttel bevont, s egyben pipettázó funkciót is ellát. Meghatározandó mikroorganizmus Egyéb immunkompetens molekulák

35 Mosási lépések az SPR csak függőleges irányban mozog a mérőtálca mozgása biztosítja a megfelelő reagensek elérhetőségét monoklonális antitesttel bevont pipettahegyek felületén megkötődnek az antigének

www.biomerieux-industry.com Több mosási folyamat után a 2.

36 Több mosási folyamat után a 2. poliklonális antitest hozzákötődik az előzőleg megkötött antigénekhez Az 5. Cellában van az enzimmel jelzett konjugátum

37 Alkalikus-foszfatázzal konjugált antitest Egy szendvics komplex alakul ki, amely az enzim kromogén szubsztrátjával fluoreszkáló vegyületet alkot, és ennek a fluoreszcenciáját méri a készülék 450 nm-en Kötött antitest Befogott antigén Kromogén szubsztrátum (4-metilumbelliferilfoszfát))

38 Streptavidin + Phycoerythrin (PE) Biotinált másodlagos antitest Antigen Az antigénre specifikus immobilizált antitestek a bead felszínén BEAD

39 www. scinecedirect.com

Hasonló dokumentumok

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 8. előadás Immunszerológia, immunkémia Az immunoassay-k érzékenysége A fő szérumfehérje frakciók és az ahhoz tartozó fehérjék Az Ig valencia és aviditás viszonya