Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló

Átírás

1 Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek ELISA, ELISPOT, Western blot, immunhisztokémia Józsi Mihály (köszönet Sándor Noéminek)

2 4. Az antigén és ellenanyag kapcsolódásán alapuló módszerek ( oldal, l oldal) l) 6. Sejtanalitikai módszerek ( oldal) 7. Limfociták funkcionális vizsgálata ( oldal, oldal) l)

3 Ismétlés Antigén ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek 1. Antigén ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló technikák Az ellenanyag tulajdonságai (valencia, flexibilitás, affinitás) határozzák meg a másodlagos reakciót, ami pl. kicsapódás, agglutináció (térhálóképzés), stb Jelöléses technikák Közvetlenül az ellenanyagnak az antigénhez való kapcsolódását mutatjuk ki azáltal, hogy valamilyen módon dtktálit detektálni tudjuk magát az ellenanyagot

4 Ismétlés Mivel jelöljük az ellenanyagot Példa Mit detektálunk Milyen módszerben használjuk Enzim HRPO, AP Enzimreakciót (szubsztrát elhasítva világít/színt vált) ELISA, Western blot, immunhisztokémia Fluoreszcens festék FITC, PE, Alexa Fluoreszcenciát FACS, fluoreszcens festékek, stb... (fényt) mikroszkópia Fémkolloid arany, vas A fém tulajdonságait MACS, elektronmikroszkóp Radioaktív izotóp pl. 125 I Radioaktiv sugárzást RIA

5 Jelöléses mérési technikák elve + minta benne a kimutatandó anyag = antigén az antigénre specifikus jelölt ellenanyag mindig feleslegben fl l adva, hogy minden antigént biztosan megjelöljünk antigén ellenanyag kapcsolódás + marad szabad ellenanyag Így nem tudom megmondani hogy mennyi ellenanyag kötött antigént, mindkét mintában ugyanannyi y van, maga az ellenanyag ygkötődés nem okoz látható változást ( másodlagos reakción alapuló technikák) M ldá ilá d fl íh kötö kiótí b dé kötött Megoldás: szilárd felszínhez kötöm a reakciót így a szabad és kötött komponensek elválaszthatóak

6 2 fontos megjegyzés 1. Nem minden ellenanyag jó minden módszerhez Immunológia 2.2 ábra 2. Maga az ellenanyag is lehet antigén, sokszor ellenanyagot mutatunk ki jelölés

7 Rosalyn Sussman Yalow The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1977 Prize motivation: "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones Photo from the Nobel Foundation archive. Prize share: 1/2

8 Takátsy Gyula Kísérletes Orvostudomány (1951) 2, 293. Új módszer sorozatos hígítások gyors és pontos elvégzésére A bejelentés tárgyát képező spirálkacsnak a javaslat szerinti felhasználása új ugyan és az eszköz célszerűen használható laboratóriumi munkáknál, azonban népgazdaságunk szempontjából való jelentősége nem oly nagy és a javaslat nem jelent oly lényeges haladást a technika ismert állásával szemben, hogy a fenti jogszabály értelmében szerzői tanúsítvánnyal elismert találmánynak lenne tekinthető. Országos Találmányi Hivatal (1951)

9 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Oldatban lévő anyagot detektálunk ellenanyagok segítségével mikrotitráló lemezen (= 96 lyukú plate) érzékenység éken < 0, µg/ml Detektálás: spektrofotometria Kvalitatív/kvantitatív E + SZ K K Az enzimreakciót az enzim denaturálásával állítjuk le (H 2 SO 4 ) E enzim (HRPO) SZ szubsztrát (H 2 O 2 ) K kromogén (TMB vagy OPD) Az átalakult lt szubsztrát áthtáá hatására a kromogén színe megváltozik, ezt fogjuk spektrofotometriával detektálni (maga az enzim és szubsztrátja színtelen!)

10 ELISA enzim szubsztrát színreakció mérés Alkalikus foszfatáz Tormaperoxidáz / HRPO NPP (p-nitrofenil-foszfát) színtelen sárga 406 nm MUP (4-metilumbelliferil- fluorogén 365 nm foszfát) 450 nm OPD (o-feniléndiamin) ABTS (2,2'-azino-bisz-3- etilbenzotiazolin-6- szulfonsav) TMB (3,3,5,5 -tetrametilbenzidin) DAB (3,3 -diaminobenzidin tetrahidroklorid) AEC (3-amino-9-etil- karbazol) színtelen rozsda színtelen kékeszöld kék sárga színtelen barna színtelen vörös 492 nm 405 nm 450 nm

11 kemilumineszcencia (wiki)

12 ELISA Hogyan kötjük szilárd fázishoz a reakciót? Coatolás (=fedés) antigénnel vagy ellenanyaggal ifik kötődé é ű f l í kö ött (hid fób köl ö h tá ) aspecifikus kötődés az anyag és a műanyag felszín között (hidrofób kölcsönhatás) olyan oldatban, amely elősegíti a hidrofób részek felszínre kerülését fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok, vírusok, baktériumok, sejtek minden ELISA ban ha kvantitatív (=koncentrációt mérünk) akkor nem coatolhatunk a mérendővel, mert a coatolás aspecifikus reakció

13 Blokkolás A szabadon maradt műanyag felszínt (szabad kötőhelyeket) egy indifferens fehérjével (pl. BSA bovine serum albumin) blokkoljuk, hogy az ELISA további rétegei ne kötődhessenek már aspecifikusan, csak a specifikus antigén ellenanyag kapcsolatokon keresztül (Megjegyzés: mivel az ELISA további lépései detergens tartalmú oldatban történnek, ami eleve megakadályozza az aspecifikus kötődéseket, néha elhagyható, ez mindig az adott rendszertől függ!)

14 Direkt ELISA *minden lépésnél lemossuk a nemkötődő anyagokat, de ezt többet nem jelezzük) 1. coatolás a kimutatandó 2. nemkötődő antigén 3. szabad kötőhelyek antigénnel lemosása * blokkolása kötődött antigén kötődött specifikus enzimmel jelölt ellenanyag 4. Az antigénre specifikus, enzimmel kapcsolt ellenanyag hozzáadása 5. Az enzim szubsztrátjának és a kromogénnek hozzáadása, mely színt változtat a reakció hatására leállítás fotometrálás enzimaktivitás színreakció

15 Indirekt ELISA Indirekt = a kimutatandó antigén és az enzimmel kapcsolt ellenanyag nem közvetlenül reagál egymással protocoltypes of elisa.html antigén antigén specifikus ellenanyag (jelöletlen) másodlagos, enzimmel kapcsolt ellenanyag Mik a másodlagos ellenanyagok? ellenanyagok konstans részére specifikus ellenanyagok pl. patkányban termeltetett anti egér ellenanyag (= MINDEN egér ellenanyagot felismer, izotípustól függetlenül), vagy patkány anti egér IgG (=MINDEN egér IgG t felismer, de pl. IgM et nem), stb... rengeteg féle van.

16 Szendvics ELISA Szendvics = az antigén két ellenanyag közt van, azaz a coat is ellenanyag detektáló ellenanyag coatoló ellenanyag assay/ Megjegyzés: A szendvics ELISA is lehet direkt vagy indirekt attól függően hogy az antigénhez kapcsolódó detektáló ellenanyag enzimmel jelölt vagy még jön rá egy réteg enzimmel jelölt másodlagos ellenanyag

17 Gyakrolati kivitelezés Minél több lépcső, annál nagyobb jelerősítés keresztreakciók lehetősége is nő a biotin avidin kapcsolat is használható jelerősítésre HRPO b HRPO avidin HRPO szendvics ELISA a legérzékenyebb, ezzel pl. hormonok, citokinek is kimutathatók, pontos koncentrációjuk is megmutatható (=kvantitatívvá tétel) ha egy ismert koncentrációjú standard sort is lemérek az adott anyagból

18 ELISPOT elv ELISAhoz hasonló Az adott anyagot termelő sejtek számát nézi membránra coatolunk (nem műanyagra) rá a sejtek, amik termelik az adott anyagot (a közvetlen környezetükbe) a sejteket lemossuk, de a termelt anyag yga capture ellenanyaghoz kötődve marad innentől gyakorlatilag szendvics ELISA a szubsztrát itt is színt vált, de a színes anyag a membránhoz tapad, és nem fotometráljuk online.org/prot/protocols/elispot / l / 3456.html

19 ELISA ELISPOT különbség ELISA A termelt anyag mennyiségét nézi Pl. oltottunk X antigénnel, mennyi anti X ellenanyagot yg termelnek a B sejtek? ELISPOT Az anyagot termelő sejtek számát nézi Pl. X antigénnel oltás után hány db B sejt termel anti X ellenanyagot?

20 Western blot (=immunoblot) Fehérjék szelektív kimutatása fehérje keverékből specifikus ellenanyag segítségével kvantitatív meghatározásra nem alkalmas, mindig csak relatív különbségek detektálhatóak lehet direkt vagy indirekt egyszerre több, nem azonos méretű fehérje is kimutatható 1. SDS PAGE (SDS PoliAkrilamid GélElektroforézis) SDS = Na dodecil szulfát, letekeri és nega v töltéssel látja el a fehérjéket vándorlásuk csak a méretüktől függ + A negatív töltésű fehérjék a pozitív pólus felé vándorolnak méretüktől függő sebességgel, a vándorlást mi állítjuk le, amikor a legkisebb bbfhéék fehérjék elérik a gél végét

21 Western blot (=immunoblot) fehérjék megfestése lgelelect/acrylgel2.html s/simmons/technical definition.html vagy transzfer nitrocellulóz membránra, amin immobilizálódnak a fehérjék

22 Western blot (=immunoblot) 2. Minták átblottolása nitrocellulóz membránra Itt is elektromos erőtérben vándoroltatjuk a még mindig negatív töltéső fehérjéket, csak az előző irányra merőlegesen minden fehérje az ado helyén marad, mint a gélben volt, csak átkerül a nitrocellulózra A szeparáló gél minták szeparálása gélben minták blottolás peptidek transzferálása nitrocellulózra (blot) szeparált peptidek blot immunofestése Immunológiai módszerek 4.8 ábra jelölt ellenanyag hozzáadása előhívás megfuttatott fehérjék a gélben megfuttatott fehérjék a membránon B

23 2. A keresett fehérje specifikus kimutatása Western blot (=immunoblot) Lépések teljesen hasonlóak az ELISA hoz: blokkoljuk a szabad nitrocellulóz felszínt közvetlenül enzimmel (HRPO) kapcsolt antigén specifikus ellenanyaggal inkubáljuk a membránt direkt jelölés Az antigénre specifikus jelöletlen/biotinnal ti ljelölt ellenanyaggal l inkubáljuk k a membránt és ezután egy HRPO kapcsolt másodlagos ellenanyaggal vagy avidin HRPO val indirekt jelölés (jelerősítés!) előhívás: lumineszcens (fényt bocsájt ki) vagy kromogén szubsztráttal (ritka)

24 minták szeparálása gélben minták peptidek transzferálása nitrocellulózra (blot) Western blot (=immunoblot) 3. Eredmény szeparált peptidek A bloton csak az ellenanyag ygáltal felismert fehérjék fognak jelet adni B blot immunofestése jelölt ellenanyag hozzáadása Immunológiai módszerek 4.8 ábra M előhívás A B C Aggregált C3 Példa: A vizsgált fehérje monomer és dimer formában is előfordul a sejtekben Kérdés: Az A, B és C sejttípusok közül melyik tartalmazza a monomer formát? Western blot alapján a B sejttípusban nincs meg ez a forma (nincs jel) 200kDa C , ,5 Mert sokféle azonos molekula tömegű fehérje van a sejtben, ezért az SDS PAGE félrevezethet α lánc β lánc Ha tudom mekkora a fhéjé fehérjém (azaz hol várom a csíkot), miért nem elég az SDS PAGE?

25 Dot blot Fehérjék stb. közvetlen felvitele membránra vagy chip-re Blokkolás és inkubálás (pl. ligandummal, majd antitestekkel), előhívás mint előbb Példák: anti-c3b anti-c3d anti-crp (C-reaktív fehérje) Józsi et al., Journal of the American Society of Nephrology 2006, 17: Hebecker et al., Molecular Immunology 2010, 47:

26 Mit akarunk nézni? -> hogyan? Példa: szérummal/tisztított FH fehérjével inkubált sejtek vizsgálata anti-fh ellenanyaggal kezeletlen szérummal kezelt sejtek lizátuma FH mikroszkópia Western blot FHL-1 FHR-1 kontroll FH áramlási citometria

27 Immunhisztokémia (IHC) Szöveti antigének (pl. Sejtek, erek, stb...) kimutatása in situ metszet előállítása (beágyazás, fagyasztás, stb...) szövet feltárása, fixálás kri kus lépés, sokszor vagy a szöve szerkezet sérül az antigéndeterminánsok megtartása érdekében, vagy a szerkezet megmarad, de az ellenanyagunk számára felsimerhetetlenné válik az antigén jelölési lépések ezután az ELISA hoz és a Western blothoz hasonlóak egyszerre több antigén is jelölhető lehet direkt/indirekt, de ritkább a direkt mert ott nincs jelerősítés poliklonális ellenanyagok előnye

28 Immunhisztokémia (IHC) példa ábra. Bőrsarcoidosis epitelioid granulómákkal (bekarikázottak), a nyíl a felhámot mutatja ábra. Ugyanez a szövet, ahol az epitelioid makrofágok CD163 IHC-vel vannak feltüntetve (bordó sejtcsoportok, nyilak)

29 Immunhisztokémia (IHC) példa ábra. SLE, membranosus glomerulonephritis (MGN). PAS-festéssel láthatók az enyhén megvastagodott g falú glomerularis kapillárisok, más vonatkozásban strukturálisan épnek tűnnek (nyilak) ábra. SLE, MGN, ugyanaz az eset, ahol a glomerulus (nyíl) kapillárisok falában finom mebránhoz hasonló granuláris IgGdepozíció látható a (zöld fluoreszcencia), ami imunkomplex lerakódásnak felel meg. perjódsav-schiff-reakció (PAS- reakció) a glikoproteinek szénhidrát komponenseit festi bíbor (bordó) színűre IgG-depozíció (zöld fluoreszcencia)

30 Ellenőrző kérdések Milyen típusú ellenanyag jelölést használunk az ELISA, ELISPOT, Western blot, immunhiszotkémia módszerek során? Mi a különbség a direkt és indirekt ELISA között? Mi a szendvics ELISA lényege? hogyan tehető kvantitatívvá az ELISA? Melyik fajtáját használjuk erre? Mi a különbség az ELISA val és ELISPOT tal nyert információ ióközött? ött? Milyen tulajdonság alapján választja szét a Western blot a fehérjéket? Hogyan azonosíthatunk egy adott fehérjét Western bloton? Miért nem lehet gélfestéssel azonosítani? Mi az immunhisztokémia? Mi az előnye az órán ismertetett módszerekben az indirekt jelölésnek? Mi a hátránya? Mia biotin avidin jelölés előnye az órán ismertetett módszerekben?