A Legionella jelenlétének kimutatása

Átírás

1 A Legionella jelenlétének kimutatása Diagnosztikai lehetőségek Kari András Budapest

2 Legionella nemzetség: aerob coccoid-pálca Gram (gyengén festődik) kataláz +, oxidáz +, hippurátot hidrulizálja tenyésztéséhez speciális igények : L- cisztein, vas (BCYE) lassan növekednek

3 Szabványos módszerek (Környezeti Legionella vizsgálatok) ISO 11731:1998 (Water quality-detection and enumeration of Legionella) ivóvizek, ipari és természetes vizek MSZ EN ISO :2008 (Vízminőség. Legionella kimutatása és megszámlálása 2.rész: Közvetlen membránszűréses módszer kis baktériumszámú vizek esetén) emberi fogyasztásra és használatra szánt vizek esetében kezelt fürdővizek esetében Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben

4 I. ISO 11731:1998 (Water quality-detection and enumeration of Legionella) II. Koncentrálás Közvetlen szélesztés Membránszűrőn Centrifugálással III. IV. A) Savkezelés B) Hőkezelés C) Kezelés nélkül Legionella szelektív táptalajra való szélesztés (GVPC/GVPN) 0,1 ml- 0,5 ml Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben

5 MSZ EN ISO :2008 (Vízminőség. Legionella kimutatása és megszámlálása 2.rész: Közvetlen membránszűréses módszer kis baktériumszámú vizek esetén) a legtöbb hazai laboratórium alkalmaz Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben II. Koncentrálás: membránszűrés I. III. Savkezelés IV.

6 Mintafeldolgozás Vizsgálati térfogatok: Ivóvíz/használati melegvíz: ml Fertőtlenített fürdővíz: ml Nem fertőtlenített fürdővíz: 0,1 ml szélesztés, 10 ml szűrés Hűtőtorony, klíma kondenzvíz : 0,1-0,5 ml szélesztés, 10 ml szűrés Minta feldolgozás ideális esetben 24 h belül, de maximum 48 h! Membránfilter: fekete nitrocellulóz Savkezelés: Ph 2,2 ± 0,2 ; 5 perc öblítés foszfát pufferrel, vagy Ringer oldattal Sterilitás!

7 Azonosítás GVPC/GVPN szelektív Telepmorfológia: táptalaj (glicin, vancomicin hidroklorid, polimixin-b szulfát, cikloheximid/natamicin) tejfehér színű( zöld, Inkubálás : 36 ± 2 C 10 napon barna, keresztül rózsaszín) Leolvasás a 3. naptól kezdődően szabályos köralakú (sztereomikroszkóp) épszélű irizáló szél UV fény alatt sok faj kékesfehéren, sárgászölden, vörösesen autofluoreszkál

8 Azonosítás megerősítés: 5-5 telep levétele cisztein-auxotrófia: ciszteines BCYE (pufferolt aktív szén és élesztőkivonat táptalaj) pozitív BCYE-Cys (L-cysteint nem tartlmaz)/nutrient/véres agar negatív szerotipizálás: (Legionella latex teszt kit) szerocsoport szintű azonosítás: L. pneumophila 1 L. pneumophila 2-14 L. species

9 Molekuláris biológiai eljárások Polimeráz láncreakció (PCR) Egy nap alatt megbízható eredményt ad (szemben a tenyésztés 10 napjával) rt-pcr (real time, vagy kvantitatív)- nem csak kvalitatív, hanem kvantitaív infromációk is. Repetitív-PCR faj alatti genotipizálás (PFGE, SBT) In situ hibridizáció (ISH) radioaktív vagy fluoreszcens (FISH) festékkel jelölt DNS / RNS próbák.

10 További laboratóriumi módszerek Immunfluoreszcencia DFA (direkt immunfluorszcencia) Dot-blot immunteszt Immunenzim módszer- immunperoxidázzal való festés Klinikai minták esetében ál pozitív eredmények más baktériumokkal való keresztreakció miatt (Bordatella, Francisella ).

11 További laboratóriumi módszerek Antigénmeghatrozás : Radioimmunesszé ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Immunkromatográfiás membránvizsgálat Latex agglutináció Nagy szenzitivitás és specificitás Legionella szerocsoportok között keresztreakció Szerológia: MAT (mikroagglutinációs teszt) IIFT (Indirekt immunfluoreszcencia ) ELISA

12 Köszönöm a figyelmet! 1211 Budapest Szállító u 6. Tel.: , biologia@kviplusz.hu