Korszerű Salmonella kimutatási módszerek tapasztalatai a magyarorsági élelmiszerellenőrzésben

Átírás

1 Korszerű Salmonella kimutatási módszerek tapasztalatai a magyarorsági élelmiszerellenőrzésben Tabajdiné dr. Pintér Vera FoodMicroKft. Budapest 1

2 We ling 2

3 Élelmiszerekkel szemben támasztott követelmények Egészségre ártalmatlan Jó minőség (érzékszervi tulajdonság, beltartalom) hosszú minőségmegőrzési időtartam tömeges termelés feldolgozottsági fok növelése nemzetközi kereskedelem új táplálkozási szokások Gazdaságos Preventív, gyártásközi technológiába beépülő szabályozási rendszer (HACCP) 3

4 A Salmonella vizsgálati módszerek csoportosítása Klasszikus vizsgálatok gyorsítása egyszerűsítése Kromogén táptalajok Dúsítás kombinálása műszeres méréssel pl. konduktancia Molekuláris biológiai módszerek (PCR, DNS hibridizáció) Immunológiai vizsgálatok (FIA, RIA, ELISA, ELFA) Sejtkoncentrálás 4

5 Salmonella táptalajok 5

6 Mikrobaszaporodás detektálása (hő, turbititás, szín, konduktancia, beütésszám, redoxpotenciál) 6

7 IMS 7

8 A Salmonella vizsgálatok idődiagramja Élelmiszer óra IMS, ICS Fizikai mérés MSRV, Diassalm PCR célirányos Elődúsítás 6-24 óra óra ELFA, ELISA, FIA Enzimreakciók Latex agglutináció Gene próba Célirányos (pl.utódúsítás) Szelektív dúsítás óra óra API MICRO ID Enterotube II SM ID, Rambach Kromogén táptalajok Szelektív agar óra Biokémiai reakciók óra Szerológiai vizsgálat 8

9 ELŐDÚSÍTÁS Cél:a sérült sejtek reszuszcitációja INKUBÁLÁSI IDŐTARTAM Az elődúsítást követö módszer és a kisérö mikroflóra mennyiségének függvénye Rázatva, nem rázatva Klasszikus tenyésztéses óra Motilitási elven alapuló óra Immunszelektív dúsítás 6-8 óra PCR 6-16 óra Konduktometriás ó ELISA kevés kísérő mikroflora óra sok kísérő mikroflora 6-8 óra 9

10 ELŐDÚSÍTÓ AOAC Laktózleves* tojás, tej, hús, gyümölcs hal Triptikáz szója leves* tojás, tojáslé, fűszerek, élesztö Brillantzöld oldat tejpor ISO 6579 TSB + 0,5 % K 2 SO 3 Steril sovány tej LB + Tergitol vagy Triton* BPW Pufferolt peptonvíz BPW +5% kazein, vagy 10 % tejpor BPW +1/100 higítású minta BPW+0,1-1% Tween80 BPW+ ph kontrol fokhagymapor, vöröshagymapor csokoládé termékek kókuszreszelék, húsipari melléktermékek, hal-, csont- húslisztek legtöbb élelmiszer, nyers hús kakaó és kakaó alapű termékek gyógynövények, füszerek, nagy zsírtartalmű termékek( 20%) savak és savas termékek 10

11 Tojásfehérje ,7 8,3 8,4 6,9 6,7 7,5 8,8 7,6 6 5,4 4,8 5,2 5,6 4 3,6 2,8 2,8 2 0 Kontrol 1 % élesztõ 0,1 % élesztõvas-amm.citrát Humet R Elõdúsítás idõtartama 8óra 6 óra 3 óra 11

12 Salmonella kimutatás hőkezelt tejből Kimutatási határ eléréséhez szükséges idő ,7 16,1 12,4 13,1 13,2 11,7 9, ,4 8,8 9,3 9,5 7,8 7,8 5 0 Induló sérült sejt 90/ml Kontrol 1 % élesztõ 0,1 % élesztõ vas-amm.citrát Humet R Elõdúsítás idõtartama 8óra 6 óra 3 óra 12

13 Dúsító tápoldatban Tetrationátos Szelenit-cisztin Rappaport V. Szelektív differenciáló táptalaj a dúsítást követő azonosítási módszer függvénye DNS hibridizáció Félfolyékony dúsítóban MSRV Diassalm Szelektív és differenciáló táptalaj SZELEKTÍV DÚSÍTÁS Impedimetriás mérő készülékben Rappaport V. TMO-s táptalaj Latex agglutináció DNS hibridizáció ELISA Utódúsítás M-levesben Immunszelektív dúsítás IMS Dipstick PCR Molekuláris biológiai módszerrel Szelektív differenciáló táptalaj 13

14 Salmonella táptalajok 14

15 Reveal Salmonella Test Élelmiszer 25 g 1 fiola táptalaj ml 42 C-os steril víz oldás Homogenizálás Stomacher 2 perc Elődúsítás (36 1 C) 2-4 óra 1 fiola táptalaj (d-rv) ml 37 C-os steril víz oldás Szelektív dúsítás (42 1 C) 18-24óra Reveal teszt 15 perc 15

16 REVEAL 16

17 17

18 Követelmények Gyors, vagy gyorsított Nemzetközi szabványoknak való megfelelőség Akkreditálási követelményeknek való megfelelőség Jártasság igazolása körvizsgálatokban való részvétellel Minőségbiztosítási rendszereknek való megfelelés 18

19 A vizsgáló és kalibráló laboratóriumok alkalmasságának általános követelményei MSZ EN ISO 17025: VIZSGÁLÓ MÓDSZEREK: Elsősorban nemzetközi, regionális és nemzeti szabványokat kell alkalmazni. Laboratóriumban kifejlesztett, vagy átvett módszert a használatba vétel előtt validálni kell. Validálni kell: Nem szabványos módszereket Saját kifejlesztésű módszereket Működési területen kívül eső szabványos módszereket Szabványos módszerek kiegészítéseit, módosításait 19

20 MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATI LÉPÉSEI: MÓDSZEREK VALIDÁLÁSA EN ISO 16140:2000 Alternatív és referencia módszer laboratóriumon belüli összehasonlítása Körvizsgálat 20

21 Jellemző paraméterek Relatív pontosság: 100 (p+n) / N % Relatív specitikusság: 100 n / (n+fp) % Relatív érzékenység: 100 p / (p+fn) % Referencia + Referencia - Alternatív + p f p Alternatív - f n n 21

22 Mi határozza meg, hogy melyik módszert válasszuk? a vizsgálat célja biztonsági szint mintavételi terv validálás érzékenység specifikusság pontosság élelmiszer összetétele vizsgálati idő automatizálás lehetősége adattárolás, adatelemzés szervíz és céginformációk vizsgálati költség 22

23 Élelmiszer óra IMS, ICS Fizikai mérés MSRV, Diassalm PCR célirányos Elődúsítás 6-24 óra óra ELFA, ELISA, FIA Enzimreakciók Latex agglutináció Gene próba Célirányos (pl.utódúsítás) Szelektív dúsítás óra óra API MICRO ID Enterotube II SM ID, Rambach Kromogén táptalajok Szelektív agar óra Biokémiai reakciók óra Szerológiai vizsgálat 23

24 24

25 BIOLINE ELISA 25

26 BIOLINE ELISA előnyei Széleskörű felhasználási terület (élelmiszerek, takarmányok, környezeti minták) Egyszerű, felhasználóbarát (akár napi 600 minta ) Flexibilis (igény szerint csíkokra szétszedhető kit) Stabil, felhasználásra kész reagensek (12 hónap) Detektálási limit ( cfu/ml RV) Analóg a referencia módszerrel Érzékenység: 99% Specifikusság: 97% Csak az ELISA pozitív mintákat kell megerősíteni. A reprodukálhatósági vizsgálatok során a variációs koefficiens 7% (12-szeri ismétlés esetén) Keresztreakció: E.coli, Proteus, E.cloaceae, Klebsiella negatív E.aerogenes, C.freundii előfordul Élelmiszerelőállítóknál biztonságos vizsgálat (hőkezelés miatt) AOAC certificate: No AFNOR, DANVAL 26

27 tojáspor hig.minta1 hig.minta2 baromfi takarmány ISO+ ELISA+ Salmonella + 27

28 20 % BAROMFIIPAR ,6 14, ,6 4,9 7 3,9 8,7 3,9 4,7 3,3 4,1 2,3 9,9 4,8 6,2 6,6 6, Összes Kórokozó 28

29 HÚSIPAR % ,6 4,2 4,2 4,1 4,4 3,9 4,6 4,4 4,7 2,5 2,8 0,9 0,9 0,9 1,4 0,8 0,8 1, Összes Kórokozó 29

30 % ÉLELMISZERIPAR ,8 7,6 6,5 6,3 6,7 5,5 5,6 5,6 4,6 1,1 2,7 3 1,1 1,1 1,1 1,5 1, Összes Kórokozó 30

31 Állatfaj Szarvasmarha Sertés Tyúk Kacsa, liba Pulyka Szerotípus reservoar S.Enteritidis, S.Typhimurium S.Derby, S.Typhimurium, S.Choleraesuis S.Enteritidis S.Typhimurium S.Saintpaul, S,Enteritidis, S.Infantis 31

32 Élelmiszer Szerotípus hordozó Marhahús Sertéshús Tyúk hús Kacsa, liba Pulyka hús Húsipari termék Tojás, sz.tészta S.Enteritidis, S.Typhimurium S.Derby, S.Typhimurium S.Enteritidis S.Infantis S.Typhimurium S.Brockley, S,Virchow, S.Hadar S.Derby S.Enteritidis 32

33 Konduktancia mérés 33

34 Salmonella kimutatás Malthus eljárással 34

35 HAGYOMÁNYOS MÓDSZEREK GYORSÍTÁSA, AUTOMATIZÁLÁSA TÁPTALAJOK (KÉSZ POR, REDY TO USE) GRAVIMETRIÁS ADAGOLÁS, HIGÍTÁS DIP SLIDE MÓDSZEREK SPIRÁL LEMEZ MÓDSZER PETRIFILM HIDROFÓB HÁLÓZATOS MEMBRÁNFILTEREK (HGMF) ÚJ SZELEKTÍV TÁPTALAJOK IDENTIFIKÁLÁS (API, CRISTAL, MINI TUBE:..) EGYSZER HASZNÁLATOS ESZKÖZÖK TELEPSZÁMLÁLÁS AUTOMATIZÁLÁSA 35

36 36