Az ellenanyagok orvosbiológiai. PhD kurzus 2011/2012 II. félév

Átírás

1 Az ellenanyagok orvosbiológiai alkalmazása PhD kurzus 2011/2012 II. félév

2 Ellenanyagok előállítása, tisztítása, jelölése, fragmentálása Monoklonális vs. poliklonális ellenanyagok

3 Ellenanyagok előállítása

4 Elvi lehetőségek Immunizálás 3D farmakofór modell Szintetikus CDR-ek Fág könyvtár HTS szelekció

5 Ellenanyag előállítás - immunizálás Antigenitás (kémiai természet, filogenetikai távolság, biológiai viselkedés) Antigén bejuttatási helye, módja, antigén mennyisége Adjuvánsok alkalmazása

6 Adjuvánsok Hatás Gyulladást idéznek elő ( veszélyes környezet stimulus) Depót képeznek, lassítják a felszívódást, lebomlást Típusai Freund-adjuváns (olaj alapú, +/- M. tuberculosis sejtfal) Alumínium-hidroxid (?) +/- bakteriális komponensek ISCOM (Immune Stimulating Complexes) Szabadalmaztatott kémiai adjuvánsok (TiterMax, RAS) Biológiai adjuvánsok (C3dg bevont Ag)

7 Ellenanyag előállítás - poliklonális Immunizálás Nagy mennyiségű szérum levétele nap Titer ellenőrzés

8 Ellenanyag előállítás - poliklonális Immunszérum Kimerítés Nem kívánt Ab-k eltávolítása Affinitás tisztítás Csak a nagy affinitású Ab-k meghagyása Fragmentálás Fab, F(ab ) 2 fragmentumok előállítása Jelölés Fluoreszcens, biotin, NP, HRP tag-ek

9 Ellenanyag előállítás - poliklonális Speciális lehetőségek Humán IgH, Igλ géneket tartalmazó mesterségek kromoszóma bevitele bigh -/-, bigλ / szarvasmarhába Immunizálás Humán poliklonális ellenanyagok kinyerése nagy mennyiségben Tyúk immunizálása Tojásból IgY tisztítás Előnyök: nem invazív, sok IgY, nagy filogenetikai távolság az emlősöktől, nem kötődik FcγR-okhoz

10 Ellenanyag előállítás - monoklonális IN VIVO IN VITRO Immunizálás Klónozás Klónok szaporítása Fúzió nap Titer ellenőrzés HAT szelekció Klónok kiválasztása mab termelés, tisztítás, jelölés

11 Ellenanyag előállítás - monoklonális Fúziós partnerek Ellenanyag termelő B sejt + Sp2/0 egér mielóma (HGPRT -/- ) Kacskovics I. után

12 Ellenanyag előállítás - monoklonális Limitált proliferáció Sp2 Sp2 Sp2 B B B HAT szelekció

13 Ellenanyag előállítás - monoklonális

14 Ellenanyag előállítás - monoklonális Flaska 0,001-0,010 mg/ml Roller flaska Tesztelt klón Nude / SCID egér 5-10 mg/ml Hollow fiber reaktor 1-5 mg/ml 0,010-0,050 mg/ml Transzgén módszerek Tg kecske tej / plantybody protoplaszt (olcsó, könnyű tisztítani)

15 Ellenanyag előállítás - monoklonális mabtartalmúminta Kisózás (NH 4 ) 2 SO 4 -tal Ioncserélő kromatográfia (DEAE- Sepharose) Affinitás kromatográfia (Protein-A, G Sepharose) Ellenőrzés PAGE-val!!!

16 Ellenanyagok módosítása Kémiai módosítás, jelölés Biológiai hasítás Géntechnológiai módosítások

17 Ellenanyagok módosítása Leggyakrabban Lizil oldallánc támadása izotiocianát, szukcinilimid, szulfonil-klorid csoportokkal, vagy glutáraldehid kapcsolómolekula segítségével más fehérjékkel Cukoroldallánc oxidálása után aldehid reakció aminnal (Schiff-bázis) R 1 -N=C=S + R 2 -NH 2 R 1 -NH-C-NH-R 2 Tiourea S R 1 -NH 2 + R 2 -COH R 1 -N=CH-R 2 + H 2 O R 1 -NH-CH 2 -R 2 Alkilamin Hasznos infó: Molecular Probes - Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals

18 Ellenanyagok módosítása Emésztés Papain Pepszin Tripszin Ficin Papain S S Fab Fc Pepszin F(ab ) 2 Fc frag.

19 Ellenanyagok módosítása Speciális ellenanyagformák (géntechnológia) scfv egyláncú, V H -V L egy peptidként történő szintézise, fág könyvtárból szelektálva, vagy ismert monoklonális szekvenciájából V H V L Spacer

20 Ellenanyagok módosítása Speciális ellenanyagformák (géntechnológia)

21 Ellenanyagok módosítása Szempontok Valencia aviditás Méret diffúzió Fc effektor funkció Teljes térszerkezet Ag/Ab kapcsolat Szekvencia - féléletidő

22 Ellenanyagok módosítása Humán terápiás ellenanyagok (cél a neutralizáló Ab válasz elkerülése) Egér monoklonális Kiméra ellenanyag (C régiók humán, V régiók egér eredetűek) CDR graft ellenanyagok (csak a CDR egér eredetű) Fág display szintetikus ellenanyagok Transzgenikus humán ellenanyagok

23 Poliklonális vs. monoklonális

24 Gyakran használt fogalmak Affinitás / aviditás Specificitás / szenzitivitás Keresztreakció / polireaktivitás Háttérreakció / aspecifikus reakció

25 Affinitás / aviditás k 1 Ag + Ab IC k 2 K d = [Ag][Ab] / [IC] = k 2 / k 1

26 Specificitás / szenzitivitás Elméleti érték Elméleti érték Elméleti érték Különböző antigének Különböző antigének Különböző antigének Mért érték 6 4 Mért érték 6 4 Mért érték Különböző antigének 0 Különböző antigének 0 Különböző antigének

27 Specificitás / szenzitivitás Mért érték 6 4 Mért érték Különböző antigének 0 Különböző antigének

28 Keresztreakció / polireaktivitás Immunizálás Célantigén Poliklonális Monoklonális

29 Keresztreakció / polireaktivitás Monoklonális Poliklonális Kimerítés Új monoklonális keresése, előállítása (irányított mutagenezis?) (affinitás kromatográfia) /

30 Háttérreakció / aspecifikus reakció OD OD TNFα (pg/ml) TNFα (pg/ml) Ok: a minta valamely hordozókomponenséhez történő kötődés, nem feltétlenül a CDR-régión keresztül (általános fehérje/fehérje, ill. fehérje/polimer reakció, ellenanyag Fc-receptorhoz való kötődése)

31 Háttérreakció / aspecifikus reakció Megoldások: 1. Blokkolás a potenciális ellenanyag kötő felszínek lefedése olyan anyaggal, amivel nem keresztreagál az ellenanyag (BSA, kazein, zselatin, tejpor, szérum) 2. Detergens használata (1-féle detergens terjedt el az ilyen típusú reakcióknál Tween 20 a kb. 100-féle másra általánosan használt reagensből!!!) 3. Ionerő megváltoztatása (van reakció, ami 1 M NaClben optimális!) 4. Inkubációs idők optimalizálása (k on /k off ) 5. Megfelelő módszer megválasztása 6. Új ellenanyag keresése/ előállítása

32 Háttérreakció / aspecifikus reakció Y Y Y Y Y Y Y Y Y

33 Poliklonális vs. monoklonális Jellemzők Specificitás Affinitás Izotípus Keresztreakció Előállítási idő Előállítási költség Infrastruktúra igény Szakértelem igény Immunizálás Mennyiség Gazdaszervezet Poliklonális Heterogén Heterogén Heterogén Gyakori 2 hónap Ag eft Olcsó, egyszerű Közepes Tiszta antigénnel Nagy, de korlátozott Nyúl, kecske, birka Monoklonális Homogén Homogén Homogén Nincs?? 4-12 hónap Ag eft Drága, speciális Magas Akár nyers keverékkel is Korlátlan, de drága Egér, patkány, (nyúl)

34 Poliklonális vs. monoklonális Poliklonális Immunprecipitáció Agaróz immundiffúzió Immunogold (elektronmikroszkóp) ELISA Western-blot Szekunder ellenanyagok Komplement aktivációs tesztek Vírusneutralizáció Affinitás kromatográfia IVIG Monoklonális ELISA Western-blot FACS Primer ellenanyagok FRET Bead-array Nano-Pro Immunszcintigráfia MAb terápia

35 Poliklonális vs. monoklonális

36 Jövő heti program Analitikai módszerek - részletesebben