Harcban állunk! Régóta

Átírás

1

2 Harcban állunk! Régóta

3 Az immunrendszer működésének alapja: védelem a kórokozók ellen és tolerancia a saját szervezettel szemben Gazda immunitás sérülés Tolerancia Kórokozó

4 A veleszületett és az adaptív immunválasz kórokozó Veleszületett immunitás hámsejtek B limfociták Adaptív immunitás Ellenanyagok fagociták T limfociták Effektor T sejtek komplement NK sejtek órák napok Fertőzéstől eltelt idő

5 Az ellenanyagok szerepe a kórokozók semlegesítése Delves & Roitt 2000 NEJM

6 Az aktív és a passzív immunitás Veleszületett immunitás Aktív (fertőzés) Immunitás Természetes Adaptív immunitás Passzív (anyai) Aktív (vakcináció) Mesterséges Passzív (ellenanyag terápia)

7 A védőoltások kórokozót semlegesítő ellenanyag termelést serkentenek (mesterséges aktív immunitás)

8 A vér ellenanyag koncentrációja az egyedfejlődés során változik Anyai immuntranszport (természetes passzív) hónapok évek Immun hiányos beteg - intravénás immunglobulin kezelése (IVIG) (mesterséges passzív) Saját ellenanyag termelés (természetes aktív) Manz et al Nature Rev Immunol

9 Rh negatív vérsejt Rh pozitív vérsejt Anyai immuntranszport: természetes, passzív immunizálás Ellenanyag (IgG) életfontosságú, bár alkalmanként hátrányos Rh negatív vérsejt Ellenanyag (IgG) az Rh inkompatibilitás oka az anyai immuntranszport (hemolitikus anaemia) Rh pozitív vérsejt

10 Hemolitikus anémia állatokban x szamárkanca mén Kolosztrummal átadott anti-ló vörösvérsejt ellenanyagok Súlyos beteg öszvércsikó (ugyanannak a párnak a második csikaja)

11 Lulut, a Budapesti Állatkertben született orrszarvút, mesterséges anyai immuntranszporttal (ló IgG) tettük védetté Születés utáni IgG szint idő (napok) Sós és mtsai. 2006

12 Az ellenanyagok mesterséges alkalmazásai Terápia Mágikus lövedékek Diagnosztika

13 Kígyóméreg elleni antitest terápia (mesterséges, passzív immunizálás) kígyóméreg Ellenanyag termelés birkában Állati eredetű fehérje emberben immunreakcióhoz vezet!

14 Szervkilökődést megelőző antitest terápia (mesterséges, passzív immunizálás) egészséges vese Nyúlban termelt T-limfocita specifikus ellenanyagokkal ($ ~400 m/év) T-limfociták által elpusztított vese - szervkilökődés Állati eredetű fehérje emberben immunreakcióhoz vezet!

15 Poliklonális ill. monoklonális ellenanyag tulajdonságai poliklonális ellenanyag monoklonális ellenanyag

16 Monoklonális ellenanyagok előállítása Egér immunizálás a kérdéses molekulával Lépsejtek izolálása Mielóma sejtek Fúzió Hibridómák Szelekciós közegben tenyésztés Monoklonális ellenanyagok termelése

17 Tünet: A non-hodgkin-limfóma legjellemzőbb tünete a fájdalmatlan nyirokcsomó-megnagyobbodás, amely a nyakon, hónaljban vagy a lágyék területén jelentkezik, de más testtájékon is előfordulhat. Ha nagyobb csomót észlelünk, nem kell mindjárt limfómára gondolni, hiszen a különféle fertőzések okozta nyirokcsomóduzzanatok előfordulása gyakoribb, mint a rosszindulatú megbetegedés. Ha ez tartósan, két hét után is fennáll, vagy még a megfigyelési idő alatt tovább nő, és más okra nem derül fény, mindenképpen vizsgálódni kell tovább, részletes orvosi kivizsgálásra van szükség. Ok: a B-limfociták korlátlan osztódása Non-Hodgkin limfóma csecsemőmirigy/tímusz csontvelő lép nyirokcsomók A szervezet nyirok szervei Kezelés: kemoterápia, sugárkezelés, valamint immunterápia A nyaki nyirokcsomó megnagyobbodása utalhat rosszindulatú limfómára.

18 Non-Hodgkin limfóma kezelési lehetőségek Várj és figyelj Besugárzás Kemoterápia Immunterápia

19 Non-Hodgkin limfóma kezelése - kemoterápia A mellkas felső régiójában egy nyirokcsomóból kialakult tumoros szövet. A tumoros szövet mérete jelentősen csökken a kemoterápia hatására. A daganatos nyiroksejtek gyorsan osztódnak ezért érzékenyek a megfelelő kemoterápiára, röntgenbesugárzásra. A betegek többsége jól reagál ezen kezelés valamelyikére, vagy a kettő kombinációjára. Bizonyos esetekben azonban agresszívabb kezelésre is szükség lehet. Hátránya, hogy nem specifikus, azaz a szervezet valamennyi gyorsan osztódó sejtjét elpusztítja súlyos mellékhatásokkal, komplikációkkal jár.

20 CD20 ideális célpont An;géntől független érés An;géntől függő érés Őssejt Pre- B- sejt Éretlen B- sejt Ére8 B- sejt Ak;vált B- sejt Plazma sejt CD20

21 Rituximab - a CD20 + B sejteket célozza és pusztítja 1. Ellenanyagfüggő sejtfüggő sejtölés (ADCC) Természetes ölő sejt B- limfocita Sejt lízis 2. Komplement-függő sejtölés (CDC) Komplement ak;válás Sejt lízis B- limfocita 3. Programozott sejthalál (apoptózis) kiváltása Sejt lízis B- limfocita

22 Non-Hodgkin limfóma kezelése monoklonális ellananyaggal (Rituximab) A hasüregben számos nyirokcsomó megnagyobbodása látható tumoros nyirokcsomók Rituximab hatására a tumorok mérete jelentősen csökken, sőt eltűnik. A limfóma kezelésében mérföldkövet jelentett az immunterápiának az a formája, amely a daganatos nyiroksejtek ellen kifejlesztett ellenanyaggal, a gazdaszervezet jelentős károsítása nélkül csak a beteg sejteket pusztítja el. Ez az új, jól tolerálható immunterápia ma már a kezelés standard részévé vált. A célzott kezelés, egy a daganatsejtek felszínén nagy mennyiségben található fehérjéhez kötődik, és a szervezet védekező rendszerének segítségével az így megjelölt beteg sejtek pusztulását eredményezi. Alkalmazásával a terápiás eredmények javulása észlelhető, a mellékhatások fokozódása nélkül.

23 Tumorterápia ellenanyagokkal - anti-cd20 monoklonális ellenanyag (Rituximab) Forrás: Roche (Genentech)

24 egér MAb-ok (Köhler és Milstein, 1975) 11 év kiméra MAb-ok (Morrison és mtsai, 1984) muromonab-cd3 (Orthoclone OKT3), év abciximab (ReoPro), 1994 A terápiás monoklonális ellenanyagok evolúciója humanizált MAb-ok (Jones és mtsai, 1986) 11 év 12 év daclizumab (Zenapax), 1997 phage display segítségével nyert MAb-ok (McCafferty és mtsai, 1990) adalimumab (Humira), 2002 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I egér szekvenciák glikolizálódás helye humán szekvenciák CDR régiók humanizált egerek segítségével nyert humán MAb-ok (Lonberg és mtsai, Green és mtsai, 1994) 12 év panitumumab (Vectibix), 2006 Lonberg, N. (2005). "Human an;bodies from transgenic animals." Nat Biotechnol 23 (9): alapján módosítva Nagy Antal Balázs MSc

25 Humanizált transzgenikus egerek egér embrionális őssejtek Inak^v egér IgH lánc gén Inak^v egér Ig lánc gén humán IgL gén beültetése humán IgH gén beültetése keresztezés keresztezés dupla KO egér törzs (nem képes egér ellenanyagok előállítására) humán és egér ellenanyagok előállítására is képes egér törzs Jakobovits, A., R. G. Amado, et al. (2007). "From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human an;body product from transgenic mice." Nat Biotechnol 25(10): alapján módosítva Nagy Antal Balázs csak humán ellenanyagok előállítására képes egér törzs egér IgH gén egér Ig gén humán IgL gén humán IgH gén

26 Dupla transzkromoszomális egér: a humán nehéz- és könnyű ( ) láncot hordozzák Tomizuka et al 2000 PNAS

27 Humán poliklonális ellenanyagot termelő transzkromoszómális szarvasmarha - Hematech Kuroiwa et al Nature Biotech

28 Az FcRn szerepe az IgG homeosztázisban Roopenian and Akilesh alapján

29 A szarvasmarha FcRn-t fokozott mértékben kifejező transzgénikus egerek előállítása bakteriális mesterséges kromoszómával (BAC) vt bfcrn mrns (Northern blot) bovin Tg#14 he ho Tg#19 he ho bfcrn Fluorescence In Situ HybridizaJon kda B4 bfcrn protein (Western blot) vt Tg#14 Tg# bfcrn Bender és mtsai. 2007, Cervenak és mtsai. 2011

30 bfcrn Tg egerekben fokozott mértékű antigén-specifikus ellenanyag termelődik Cervenak és mtsai. 2011

31 bfcrn Tg egerekben fokozott mértékű a humorális immunválasz: Nagyobb lép, több lépsejt, több antigén-specifikus B-sejt Cervenak és mtsai. 2011

32 A bfcrn Tg egerek hatékony immunválasza gyengén immunogén antigénekre az Ekiert et al Science KLH- hoz konjugált HA2- pep;d (influenza hemagglu;n konzervált, nem immundomináns epitópja) csak a Tg állatokban válto8 ki megfelelő immunválaszt Végh és mtsai. 2011

33 A bfcrn Tg egerek hatékony immunválasza az 1. típusú kannabisz receptorra (CB1) értékes monoklonális ellenanyag előállításához vezetett CB1- specifikus IgG Jter CB1- specifikus immunhisztokémiai jelölés agymetszeten Monoklonális ellenanyag előállítás Egér típus Hibridómák száma CB1 pozitív klónok (IgG) Balb/c bfcrn Tg Nagy affinitású CB1- specifikus monoklonális ellenanyag 404 (3C2) K d = 1.7 E -9 M Együttműködés Dr. Katona Istvánnal (MTA, KOKI)

34 Nyúl FcRn Tg nyúl fokozott immunválasza Baranyi és mtsai PloS One

35 FcRn Tg nyulak több (4x) humán T-sejt specifikus poliklonális ellenanyagot (ratg) termelnek Baranyi és mtsai PloS One

36 ELSŐDLEGES IMMUNVÁLASZ T cell priming TH DC T H Ag B B sejt akjválás FcRn: hatékonyabb B sejt aktiválás Az FcRn fokozott kifejeződésének hatása a humorális immunrendszerre T H B T- B kooperáció FOKOZOTT DIVERZITÁS Ag IgM IgG RÁOLTÁS, MÁSODLAGOS IMMUNVÁLASZ AFC Differenciálódás, izocpus váltás, affinitás érés Ag Ag AFC Ag B B M FcRn: hatékonyabb IgG védelem, több IgG FcRn: több Ag-IgG IC g FcRn: hatékonyabb B M aktiválás MAGASABB Ag- SPECIFIKUS IgG TITER, NAGYOBB AFFINITÁS DC FcRn: több dendritikus sejt, amely nagyobb hatékonysággal NE prezentálja az antigéneket FcRn: több neutrofil, amely nagyobb hatékonysággal szállít antigéneket a nyirokszervekbe Kacskovics és mtsai. 2011

37 Az FcRn-t fokozott mértékben kifejező Tg egerek és nyulak jellemzői: (1) csökken az an-gén(ag)- specifikus IgG lebomlása (2) fokozo? mértékű az Ag- specifikus humorális immunválasz; nagyobb lép és a benne lévő Ag- specifikus immunsejtek száma jelentősen emelkedik (3) a gyengén immunogén Ag ellen is megfelelő mértékű specifikus immunválasz alakul ki (4) az immunválasz ellenanyag diverzitása fokozódik (5) a lépsejtekből jelentősen nagyobb számú hibridóma állítható elő (6) nem alakul ki autoimmunitás

38 Creating Transgenic Animals for Quality Antibodies

39 Köszönöm a figyelmet! egfp transzgénikus sertések Prof. Bruce Whitelaw - Roslin Istitute, UK, 2007

40

41