ELLENANYAGOK ÉS SZÁRMAZÉKAIK

Átírás

1 Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére TÁMOP C-13/1/KONV ELLENANYAGOK ÉS SZÁRMAZÉKAIK 9. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK

2 ANTIGÉN

3 MI AZ ANTIGÉN? Az az anyag, ami immunválaszt indukál és ellenanyagtermelést indít meg Az epitóp az antigén determináns Az ellenanyag lehet fehérje, szénhidrát vagy egyéb természetű Antigén: haptén (5-10 kd >) carrier natív vagy módosított molekulák, sejtek

4 AZ ANTIGÉN KLÓNOZÁSA Plazmid DNS Beillesztett DNS A plazmid DNS szekvencia felnyitása endonukleázzal A DNS szekvencia beillesztése, ligálása A plazmid a baktériumban felszaporodik Baktériumban transzformálás Baktérium kolóniák Számos DNS kópia Fehérjetermelés és tisztítás immunizáláshoz

5 IMMUNIZÁLÁS

6 AZ ANTIGÉN ADMINISZTRÁLÁSI MÓDJÁNAK KIVÁLASZTÁSA TÁMOP C-13/1/KONV Intraperitoneális (hasba) Intravénás (vénás érbe) Intramuszkuláris (izomba) Szubkután (bőr alá) Intrakután (bőrbe) Per os (szájon át)

7 ADJUVÁNSOK Az adjuvánsok lassítják az antigén felszívódását és az immunrendszer nem specifikus stimulációja révén fokozzák az ellenanyag termelést. Leggyakoribb típusaik: Ásványolaj-alapú, inkomplett adjuvánsok (pl.: inkomplett Freund) Komplett Freund: ásványolaj keverékben szuszpendált, hővel elölt Mycobacterium tuberculosis Aluminium-hidroxid gél Muramil-dipeptid (Mycobacterium tbc.) Bakt. vakcinák egyidejű adása fokozza az immunogénekkel szembeni antitest termelést. Pl.: Bordetella pertussis Liposzóma

8 AZ ELLENANYAG TÍPUSÁHOZ A TERMELŐ ÉLŐLÉNY KIVÁLASZTÁSA IS SZÜKSÉGES TÁMOP C-13/1/KONV Monoklonális antitesthez: egér hörcsög vagy patkány Poliklonális antitest (leggyakoribbak): nyúl birka kecske, stb.

9 POLIKLONÁLIS ELLENANYAG

10 POLIKLONÁLIS ELLENANYAG I. Egy antigén felületén számos epitóp, azaz antigén determináns található, amely immunválasz kiváltására képes Az antigén determinánsok ellen egyenként egyegy B-sejt kezd el ellenanyagot termelni Az élő szervezetben egy antigén ellen az ellenanyagok keveréke található, amely számos B-sejtből, B-sejtek sok klónjából származik

11 POLIKLONÁLIS ELLENANYAG II. több, eltérő specificitású ellenanyag keveréke több B-sejt klón termékei egy adott antigén eltérő epitópjait ismerik fel

12 POLIKLONÁLIS ELLENANYAG III. Antigén Epitóp 1. Epitóp 2. Epitóp 3. B-sejt 1. B-sejt 2. B-sejt 3.

13 MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK

14 MONOKLONÁLIS ELLENANYAG Egyetlen B-sejtből származó sejtvonal (sejtklón) termeli Egyetlen epitóp felismerésére képesek

15 HOGYAN LEHETSÉGES A MONOKLÓN ELŐÁLLÍTÁSA? A normál immunválasz poliklonális, azaz több B- sejtből származó sejtvonal (sejtklón) termeli, amely klónok mind más epitópot ismernek fel. Egyetlen epitóp (epitóp 1) felismerésére képes B-sejteket ki kell válogatni a más epitópot (epitóp 2, 3, 4, stb) felismerő B-sejtek közül.

16 HIBRIDÓMA TECHNIKA Kiválasztott antigénnel aktivált immunsejtek (plazmasejtek) Tumorsejtek Aktivált B/plazma-sejtek és tumorsejtek in vitro fúziója A korlátozott osztódási képességű, de specifikus ellenanyagot termelő sejt korlátlan ideig fenntartható in vitro

17 HIBRIDÓMA TECHNIKA Myeloma sejt Plazmasejt Korlátlan osztódás Ellenanyag termelés Hybridoma sejt Korlátlan osztódás és ellenanyag termelés

18 MONOKLONÁLIS ELLENANYAG Az egér immunizálása Z ellenanyaggal Egér lép sejtek keveréke; Egyes sejtek ( ) ellenanyagot termelnek az antigén epitópjai (Z2, Z3) ellen Mutáns egér myeloma sejtek (nem képesek HAT médiumban növekedni) Z3 A A sejtek összekeverése és fúzionáltatása HAT médiumban tenyésztés A sejteket egyenként (!), tenyésztjük tovább A nem fúzionált sejtek ( ) elpusztulnak A fúzionált sejtek ( ) osztódnak A A Z3 A Z2 Z3 A Z3 A Z2 Z3 A Az ellenanyagtermelést (minőség, mennyiség, specificitás) egyenként teszteljük

19 ELLENANYAGOK TISZTÍTÁSA

20 OSZLOP KROMATOGRÁFIA Minta Az oldószert folyamatosan adagoljuk az oszlopra egy megfelelő méretű tartályból Idő A szétválasztott molekulák frakcióit eluáljuk és összegyűjtjük

21 ION-CSERÉLŐ KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás Pozitívan töltött gyöngyök Gyöngyhöz kötődő negatív töltésű molekula Szabadon áramló pozitívan töltött molekulák

22 GÉL SZŰRÉSES KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás Lyukacsos gyöngyök Lelassított kismolekulák Gyorsan átfolyó nagymolekulák

23 AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás Gyöngyök, melyekhez kovalens kötéssel kapcsolt szubsztrát található Szubsztráthoz kötődött enzim molekula A szubsztrátra nem specifikus fehérjék átfolynak az oszlopon

24 FLUORESZCENSEN VAGY ENZIMATIKUSAN JELZETT ELLENANYAGOK

25 ELLENANYAG KONJUGÁLÁSA Fluroeszcens festék pl.: FITC (zöld) Enzim pl.: HRPO Biotin Radioaktív sugárzók Toxin (pl ricin)

26 TERÁPIÁS ELLENANYAGOK

27 TERÁPIÁS, ENGEDÉLYEZETT ELLENANYAGOK Termék neve Specificitása Típusa Alkalmazási terület Év Orthoclone OKT3 CD3 egér Transzplantátum rejekció 1986 ReoPro GpIIb/gpIIa kiméra Fab Kardiovaszkuláris betegségek 1994 Rituxan (mabthera) CD20 kiméra Non-Hodgkin lymphoma 1997 Zenapax CD25 humanizált Transzplantátum rejekció 1997 Remicade TNFα kiméra Crohn betegség, rheumatoid arthritis 1998 Simulect CD25 kiméra Transzplantátum rejekció 1998 Synagis RSV humanizált Respiratorikus synctitium vírusfertőzés 1998 Herceptin Her-2 humanizált Metasztatikus emlőrák 1998 Mylotarg CD33 humanizált Akut myeloid leukémia (AML) 2000 Campath CD52 huamnizált B sejtes krónikus limfoid leukémia (B-CLL) 2001 Zevalin CD20 egér B sejtes non-hodgkin-lymphoma 2002 Erbitux EGFR kiméra Colorectális carcinoma (EGFR+ tumorok?) 2004 Avastin VEGF humanizált Colorectális carcinoma 2004 Tysabri α4β1/7 integrin humanizált Sclerosis multiplex 2004

28 KIMÉRA ANTITESTEK A kiválasztott rágcsáló monoklonális antitest Fv régióját kódoló gének hozzákapcsolása humán antitest Fc régióját kódoló génhez A kiméra antitestek kb. 75%-a emberi fehérje Az antigén specificitása azonos az eredeti rágcsáló antitestével Az in vivo féléletideje és az effektor funkciói az emberi antitestével azonosak DE: Immunugének!

29 HUMANIZÁLT ANTITESTEK A kiválasztott rágcsáló monoklonális antitestjének CDR régiója humán antitest génbe klónozva A humanizált antitestek > 90%-a emberi Az antigén specificitása azonos az eredeti rágcsáló antitestével Az in vivo féléletideje és az effektor funkciói az emberi antitestével azonosak

30 AZ ELLENANYAGOK ELNEVEZÉSE mab xi zu li tu ci u o Monoklonális antitest Kiméra antitest Humanizált antitest Immunomoduláns antitest Tumor ellenes antitest Kardiovaszkuláris betegségben használható antitest Humán Rágcsáló

31 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE CÍMŰ, TÁMOP C-13/1/KONV AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.