Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 3 4

Átírás

1 Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 3 4 Antigén Immunizálás x B sejt Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58 m m m m + Myeloma Lépsejtek Sejtfúzió Katona Éva Antiszérum Antitest keverék Monoklonális antitestek Tiszta, homogén antitest Minden B sejt csak egyféle antigén specificitással bíró antitestet ermel. A konvencionális Immunizálás Ha Mindegyik az A myeloma-b egyes antiszérum hybridoma után B sejteket az egér hibrid tenyészthetôk a kiemeljük sejtvonal lépbôl lépe sejtkultúrában specifikus származó csak tenyésztjük, in egyféle, vitro, antitesteket B fenntartható sejtek de monoklonális nem mindegyik által termelnek termelô és termelt antitestet csak B antitest sejteket antitestet. egyféle termel. keverék. tartalmaz. antitestet termel. A B sejtek azonban nem tarthatók fenn hosszú ideig sejtkultúrában. Immunizált állat lépsejt szuszpenziója (HGPRT +, TK + ) PROTOKOLL Sp-2 myeloma (HGPRT, TK - ) felszaporítása A klónok antitest termelő Képességének tesztelése (ELISA) kb. 2 hét Sejtfúzió PEG segítségével Tenyésztés HAT (Hipoxantin, Aminopterin, Timidin) szelektív tápfolyadékban 2-3 hét Pozitív klónok felszaporítása egyenként kb. 2 hét fagyasztás klónozott! Specifikus antitestet termelő kultúrák azonosítása (ELISA) fagyasztás klónozatlan! Antitest termeltetés: ascites folyadékban tápfolyadékban 2-3 hét Klónozás (limiting dilution) az antitesttermelő sejtek higítása (96 lyukú lemez minden lyukába átlagosan 1 sejt jusson) Antitest tisztítás, jelzés Hogyan teszteljük a hibridóma felülúszókat? Mivel immunizáljunk? Natív antigén Denaturált antigén Fragmentált antigén Petid szakasz Pozitív B sejt hibridek kiválasztása Leggyakrabban használt módszer: ELISA vagy immunfluorescens assay, de célszerű azzal a módszerrel tesztelni, amelyben használni kívánjuk az antitestet. Elsődleges szempont: a cél és a módszer típusa, amiben majd használni kívánjuk az antitestet 1

2 Példa: Monoklonális antitest előállítása COX1 és acetilált COX1 ellen Peptid BSA konjugátumok ellenőrzése (SDS PAGE, 10%, nem redukáló gél) BSA Ser BSA Ser(ac) BSA 5 µg 2.5 µg 5 µg 2.5 µg 5 µg 2.5 µg Ser529 Product ( 95% purity) Sequence Quantity Peptide 1 H-Gly-Ala-Pro-Phe-Ser-Leu-Lys-Gly-Leu-OH Peptide 2 (peptide 1 O-acylated at H-Gly-Ala-Pro-Phe-Ser(Ac)-Leu-Lys-Gly-Leu-OH serine) Peptide 1 conjugated to BSA via an BSA-Cys-Gly-Ala-Pro-Phe-Ser-Leu-Lys Gly-Leu-OH Peptide 1 conjugated to KLH via an KLH-Cys-Gly-Ala-Pro-Phe-Ser-Leu-Lys-Gly-Leu-OH Peptide 2 conjugated to BSA via an BSA-Cys-Gly-Ala-Pro-Phe-Ser(Ac)-Leu-Lys-Gly-Leu-OH Peptide 2 conjugated to KLH via an KLH-Cys-Gly-Ala-Pro-Phe-Ser(Ac)-Leu-Lys-Gly-Leu-OH Immunizálás At titer tesztelés indirekt ELISA ban peptid BSA és peptid KLH konjugátum coatingon Immunizálás 2 hetes időintervallumokban 1.) 50 µg peptid-klh konjugátum/állat CFA-val emulgeálva, sc. (5 állat/csoport) 2.) 50 µg peptid-klh konjugátum/állat Alugélhez abszorbeáltatva, ip. (5 állat/csoport) 3.) 50 µg peptid-klh konjugátum/állat Alugélhez abszorbeáltatva, ip. (5 állat/csoport) Vérvétel: az utolsó oltást követő 7. napon At titer tesztelés indirekt ELISA-ban peptid-bsa konjugátum coatingon. 4.) oltás a fúzió előtt 4 nappal KLH peptid coating Az első fúzió eredménye BSA peptid coating Az első fúzió eredménye 1. Tesztelés BSA peptid coatingon, indirekt ELISA módszerrel Anti ser(ac)peptid (ser(ac)p) felülúszók 2. tesztelése OD 450 nm OD 450 nm Anti (ser)peptid (serp) felülúszók 2. tesztelése coating Mind használhatatlan! coating Mind használhatatlan! 2

3 Egér szérum titrálás BSA peptid konjugátummal történő ráoltás után SerP coating Ser(ac)P coating A második fúzió eredménye, tesztelés/2 OD 450 nm Sejtfúzió/2 IMMUNOBLOT ASA t NEM szedő egyén mosott trombocita szuszpenziója (1000 G/L) (Emese!) Lizálás: 1% Triton X 100, szonikálás 3x15 sec Denaturálás: 5 perc főzés minta pufferben (SDS, MEA) Futtatás: 10% SDS PAGE fésű nélkül, 150 µl minta Immunoblotting: antitestek felvitele: BIORAD MULTI SCREEN (500 µl/sáv) biotinált anti egér IgG avidin biotinált HRPO komplex ECL előhívás 5/2F10 7/2B1 5/2B8 5/3D12 5/1F5 B9 C6 E6 D7 D10 H5 H7 H8 C7 C8 H3 H6 H10 B10 E7 G6 G3 A9 B3 K IMMUNOBLOT Ugyanazon személy trombocita lizátumai aszpirin szedés előtt, egy és hét nap múlva. 5/3D12G6 Ig, 5µg/ml) 5/2B8H3 Sn, 3x 7/2B1D7 Sn, 3x COX1 COX1 MW MW MW MW/nap ASA szedés A FXIII A és B alegységének komplex képződését gátló antitestek előállítása MW 66kD Patient 1 Patient days after ASA treatment monoclonal anti 529Sre(ac)COX 1 monoclonal anti 529SerCOX 1 polyclonal anti COX 1 Immunizálás: tisztított, natív FXIII B Hibridóma felülúszó tesztelés: indirekt ELISA tisztított FXIII B vel fedett lemezen negatív! ELISA rendszer, melyben a komplex képződését ill. annak gátlását ki tudjuk mutatni több pozitív (komplex képződést gátló) antitest 3

4 Immunoprecipitation of FXIII-B by FXIII-B antibodies from plasma FXIII-B (1) FXIII-B (2) FXIII A 2 B 2 5x 10x 5x 10x Polyclonal human FXIII-B FXIII-B (1) FXIII-B (2) FXIII A 2 B 2 5x 10x 5x 10x Polyclonal human FXIII-A OD 450 nm The effect of anti FXIII B antibodies on FXIII complex formation antibody concentration (mg/l) FXIII-B (1) FXIII-B (2) 1. Anti FXIII B capture antibody (biotinylated) 2. Purified FXIII B 3. Anti FXIII B(1) or anti FXIII B(2) 4. Purified FXIII A 5. Anti FXIII A (HRP labeled) 6. TMB 5 10 Antitestek tisztítása Fizikai frakcionálás Méretkizárásos kromatográfia (SEC) Ammónium szulfátos kicsapás Ioncserélő kromatográfia Immobilizált fémkelát kromatográfia (pl. Immobilizált Ni His taggel rendelkező rekombináns Ig Thiophil adszorpciós kromatográfia (Sulfone thioether liganddal módosított agaróz Ig (csirke IgY is)) Melon gel kromatográfia (negatív szelekció, az Ig az átfolyó frakcióban van) Osztály specifikus affinitástisztítás Antigén specifikus affinitástisztítás Antibody 2 immunoprecipitates only free FXIII B, but not FXIII B being in complex and, when bound to FXIII B, it inhibits complex formation with FXIII A. Az antitest forrása Szérum kis térfogat magas antitest koncentráció, de sok a nem specifikus at sok egyéb fehérje jelenléte Ascites folyadék kis térfogat magas antitest koncentráció, kevesebb nem specifikus at egyéb fehérje jelenléte Sejtfelülúszó nagy térfogat alacsony at koncentráció, de nincs nem specifikus at ( fermentor estén magasabb) kévés egyéb fehérje Kisózás: a) 33-45% (max 50%) ammónium-szulfát (az Ig-ok kicsapódnak, míg más fehérjék oldatban maradnak) b) bórsav (IgM), 20x szérum térfogatnak megfelelő 0.5%-os bórsav csapadék centrifugálása, oldása 0.05M Tris-HCl pufferben (ph: 8.0) 1x kicsapás a szérum IgM mentesítése Az IgM frakció 3x kicsapása + gélszűrés tiszta IgM Gélszűrés (Sephadex G-200) Ioncserélő kromatográfia (DE-52 anion cserélő) Affinitás kromatográfia Ellenanyag tisztítás affinitás kromatográfiával Különböző osztályba ill. alosztályba tartozó ellenanyagok növényi lektinekhez, bakteriális proteinekhez való szelektív kötődésén alapul. IgM protamin szulfát, MBP (Mannose Binding Protein) IgA IgA kötő lektin, Jacalin (Jackfruit Artocarpus integrifolia lektin) IgG Protein A (Staphylococcus aureus protein A) Protein G (Streptococcus fajok) Protein L (Protostreptococcus magnus) Antigén-Sepharose Kombinálás FPLC-vel gyorsabb izolálás 4

5 Antitestek tisztításának lépései Protein G vagy Protein A Sepharose kromatográfiával Antitestek tisztításának lépései Protein G vagy Protein A Sepharose kromatográfiával Ellenanyagok tárolása Immunglobulinok jelzése + 4 C-on megfelelő pufferben, tartósítószerrel, több hónap, akár évek 50% glicerol jelenlétében -20 C-on évekig fagyasztva -20/ -80 C-on évekig (a többszöri felolvasztás, lefagyasztás az antitesteket is károsítja!) A jelzés típusa a céltól függ Biotin Enzim Más fehérje Fluorofór Izotóp partikulum 5

6 6