Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 5-6. Katona Éva. Scatchard egyenlet K= Ábrázoljuk az r/c hányadost az r függvényében

Átírás

1 Affinitás Az az erő, mellyel egy antitest megfog egy epitópot. Nem kovalens kötések, melyek hozzájárulnak: ionos kölcsönhatások, hidrogén kötések, hidrofób kölcsönhatások. Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 5-6 Katona Éva Számszerűen megadható az asszociációs konstans (K a ) meghatározásával A meghatározás egyik módszere az equilibrium dialízis. Feltételek: az antigén (ligand) elég kicsi legyen ahhoz, hogy átjusson egy membrán (pl. celofán) pórusain Az antigén valamilyen módon jelzett legyen F kamrába: B kamrába: ligand antiszérum v. nonimmun szérum Rendszeres időközönként mindkét kamrából mintát veszünk és mérjük a jelet. [Ab-Lg] K a = [Ab ] x [ Lg] a K d reciproka Scatchard egyenlet K= r (n-r)(c) r = a kötött ligand és a totál antitest cc. hányadosa n = a ligand kötő helyek száma az antitesten c = a szabad ligand cc.-ja Ábrázoljuk az r/c hányadost az r függvényében Ha a K a valóban konstans, a pontokra egyenes illeszthető és a meredekség=k a!! IgG esetén az r maximális értéke=2 Egyenest általában csak monoklonális antitest esetén kapunk! Példa egy poliklonális antitest K értékének meghatározására Az előző adatokat a Sips egyenlet alapján transzformálva log[r/(2-r)] = a logk+ a log c A log[r/(2-r)] -t a log c függvényében ábrázolva egyenest kapunk. K O = átlagos associációs konstans, az a ligand cc. melynél az ag kötő helyek fele telített (IgG esetén ez akkor teljesül, amikor r=1) 1 K O = (2-1)c K O = a szabad ligand cc.-jának reciproka, amikor r=1. Ez leolvasható a Scatchard görbéről, mivel amikor r=1, r/c=1/c= K O A K O közvetlenül leolvasható a Scatchard görbéről: amikor r = 1, log[r/(2-r)] = 0. Theát K O = reciproka annak a c értéknek, ahol a log[r/(2-r)] = 0. A K O értéke az immunizálás során az idő (és a ráoltások) függvényében emelkedik, feltehetően azért, mert a nagyyobb affinitású antitestet termelő B sejtek szelektálódnak ki. Ez a jelenség az affinitás érés. 1

2 Affinitás érés Az antitest affinitásának meghatározása nem kompetitív ELISA módszerrel 1. Különböző koncentrációjú antigénnel fedjük az ELISA lemezek felszínét (Ag, Ag ) 2. Az antitest különböző koncentrációit reagáltatjuk mindegyik antigén koncentrációnál 3. A mért OD-kat ábrázoljuk az antitest koncentráció függvényében 4. A maximális OD 50%-nak megfelelő antitest koncentrációkat leolvassuk a görbékről 5. A képlet alapján kiszámítjuk a K aff értékét Nem jelenti azt, hogy az antitest specifikusabb lesz! Az antitest affinitásának meghatározása SPR módszerrel 1. Sensor chip felszínére kovalensen felkötjük az antitestet 2. Különböző koncentrációjú antigén oldatot áramoltatunk a chip felszínén, miközben folyamatosan detektáljuk a lekötődött ag mennyiségét 3. Görbe illesztés 4. k on és k off meghatározása 5. Kd=k off /k on (software elvégzi) Egyéb módszerek: Bioassay PEIA-ellipsometry Az antitest specificitásának vizsgálata Az eredmény specificitása két dologtól függ: 1) az antitest specificitása 2) az alkalmazott módszer Az antitest kötődése egy fehérjéhez nem jelenti azt, hogy minden módszerben működik (pl. immunhisztokémia). Immunhisztokémia esetén a reakció specificitásának kontrollálására használnak: negatív kontrollt (az elsődleges antitest helyettesítése nem-immun szérummal) és pozitív kontrollt (olyan sejtek v. metszet reakciója az antitesttel, amely biztosan tartalmazza az adott fehérjét) Mit akarunk kimutatni a specificitás jellemzésekor? Azt akarjuk demontstrálni, hogy az antitest kizárólag azt a fehérjét köti, amely az immunogén peptidet tartalmazta (ma már sok esetben peptiddel immunizálunk). Az antitest specificitásának megállapítására legalkalmasabb módszerek az immunoblot és az immunprecipitáció. Példa 1 Poliklonális antitest élesztő Hda1 fehérje ellen: Immunizálás egy 21 tagú peptiddel Microarray (c): reakció 7 másik fehérjével is Immunoblot (a): reakció 3 másik fehérjével is (a másik 4 fehérjében az epitóp konformáció szenzitív lehet) Szekvencia összehasonlítás (b): jól magyarázza a keresztreakciót, DE! A szekvencia homólógia előre nem jól jelezte a keresztreakciót: 86 olyan fehérjét találtak az élesztő proteomban, ami nagyobb homológiát mutatott a peptiddel, mint a hét fehérje közül bármelyik. Továbbá csak három fehérje volt a hét közül az első 1000 találatban, melyet 6300 fehérje közül jósoltak. 2

3 Példa 2 Példa 3 Immunizálás humán myeloma IgG Fc fragmenssel, a monoklonális antitestek specificitásának vizsgálata Példa 4 Az antitest specificitásának vizsgálata immunprecipitációval 1. Antitest hozzáadása komplex antigén keverékhez (sejtlizátum, plazma, szérum, egyéb testfolyadék stb.) 2. Inkubálás 3. Antitest-ag komplex megkötése Protein G/A Sepharose gél hozzáadásával 4. A gél mosása 5. Ag és at eluálása a gél felszínéről (pl. SDS-PAGE minta pufferrel) 6. SDS-PAGE vagy egyéb kimutatása az eluált komponenseknek Példa: hiszton poszttranszlációs módosulásaira specifikus antitestek vizsgálata Az 1-3 lépés helyett lehet immunprecipitálni kovalensen gélhez kötött antitesttel is. 3

4 Nem szükséges elválasztani az immunkomplexben kötött és nem kötött komponenseket ahhoz, hogy a komplex mennyiségét megmérjük HOMOGÉN - HETEROGÉN A komplexben nem kötött komponenst el kell távolítani a komplex mérése előtt KOMPETITÍV - NEM KOMPETITÍV Jelölt és jelöletlen antigén verseng limitált mennyiségű antitest kötőhelyért Nincs kompetíció, a kötőhelyek száma nem korlátozott Az Ag-At reakció mérését befolyásoló Affinitás Aviditás Ag:Ab arány Az antigén fizikai Formája Ionerősség ph Hőmérséklet Reakcióidő Hidrofil és hidrofób molekulák jelenléte A közeg viszkozitása tényezők Precipitátum mennyisége antitest ekvivalencia Antigén koncentráció antigén A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében. (Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe) PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK KVALITATÍV MÓDSZEREK Felhasználási terület Passzív géldiffúzió: kettôs immundiffúzió két vagy több teszt anyagban lévô antigének azonosságának vagy különbözôségének eldöntése Elektroforézissel immunelektroforézis myeloma proteinek azonosítása kombinált: kétdimenziós immunelektroforézis fehérjekeverékek vizsgálata, aktiváció vagy más molekulákkal való kapcsolódás kimutatása counterimmunelektroforézis bakteriális antigének kimutatása vérbôl, vizeletbôl, cerebrospinális folyadékból immunfixáció myeloma proteinek azonosítása KVANTITATÍV MÓDSZEREK Radiális immundiffúzió antigének mennyiségi Elektroimmunoassay meghatározása specifikus Turbidimetria antitestek segítségével Nefelometria Precipitátum mennyisége antitest ekvivalencia Antigén koncentráció antigén A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében. (Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe) A fényszórást befolyásoló tényezők i s I o = 4π2 (dn/dc) 2 Mc sin 2 Θ N aλ 4 r 2 (Rayleigh) partikulum<0.1λ I s polarizált fénnyel megvilágított kis méretű partikulumok által szórt fény intenzirtása I o a beeső fény intenzitása dn/dc az oldószer/oldat fénytörési index változása N a Avogadro szám M molekulatömeg (g/mol) λ A megvilágító fény hullámhossza Θ A detektálás szöge R a detektor távolsága a fényszórás helyétől 4

5 KIS PARTIKULUMOK A fény szimmetrikusan szóródik, de 90 -ban kisebb mértékben (RAYLEIGH) NAGYON NAGY PARTIKULUMOK A fény fôként elôre szóródik (MIE) NAGY PARTIKULUMOK A fény fôként elôre szóródik (RAYLEIGH-DEBYE) A részecskeméret hatása a beeső fény szóródására Turbiditás A megvilágító fény intenzitásának csökkenése miközben az áthalad egy partikulumokat tartalmazó oldaton. A fényintenzitás csökkenést a fény visszavarődése, szóródása és az abszorpció okozza. A turbiditás a következő képlettel fejezhető ki: I = I oe -bt vagy t = (1/b)lnI o/i t turbiditás b a beeső fény hullámhossza A turbidimetria és nephelometria mérési elve EXCITÁCIÓS OPTIKA MINTA CELLA FÉNYFORRÁS Wolfram-halogén lámpa ( nm) Hélium-neon lézer (633 nm) puffer Ag At végpont jel EXCITÁCIÓS FILTER 0 OPTIKA DETEKTOR FILTER 90 idô DETEKTOR A= 0 TURBIDIMÉTER B= 30 NEFELOMÉTER C= 90 NEFELOMÉTER A fényszórás /abszorbancia változása az idő függvényében puffer Ag Maximális sebesség At sebesség idô A reakció sebessége az idő függvényében (kinetikus meghatározás) Optimális standard görbe turbidimetriás fehérje meghatározáshoz 5

6 Abszorbancia IgG Ag első leolvasás At idô Maximális jel Minta vak Reagens abszorbancia második leolvasás Az abszorbancia változása az idő függvényében Minta vak mérés jel Mérési tartomány Biztonsági tartomány Kritikus pont Ag koncentráció Turbidimetria és nefelometria érzékenyítése jel antigén latex partikulumhoz kötött antigénre specifikus antitest Mérési tartomány Ag koncentráció Az antitest koncentráció hatása a biztonsági zónára (szaggatott vonal). 1: alacsony, 2: közepes, 3: magas antitest koncentráció antigén/antitest komplex turbidimetriás mérés Turbidimetriás/nefelometriás inhibíciós assay HIBALEHETŐSÉGEK: 1. Az antitest nincs feleslegben. 2. A háttér fényszórás túl magas (pl. lipémia) Ebben az esetben a kinetikus meghatározás előnyösebb, mint a végpontos. 3. Színes anyagok okozta interferencia. 4. A keverés nem megfelelő. 5. A mintában lévő immunkomplexek (reuma faktor) fals magas vagy alacsony értékeket okozhatnak a háttér korrekciótól függően. ÉRZÉKENYSÉG: ng/l is lehet! 6

7 antitest antigén Precipitátum mennyisége ekvivalencia Antigén koncentráció TIME A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében. Antigén tesztelése (kinetikus nefelometriás meghatározás) KETTŐS RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓ (Ouchterlony) (Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe) RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓ (Mancini) Módszer: - kb. 3 mm vastag agar géllel (2-4% agar 0.9% NaCl-ban) megtöltött Petri csészét használunk - Megfelelő eszközzel lyukakat készítünk a gélbe, melybe egy csepp 1%-os agart, majd 1-2 µl mintát töltünk Ag antigén Ab antitest 1 feltöltés helye 2 ellenanyagot tartalmazó agar-gél 3 precipitációs gyűrű St1-2-3 ismert koncentrációjú standard fehérjeoldat M vizsgálandó ismeretlen fehérjeoldat A két antigén immunológiailag A azonos B nem azonos C részlegesen azonos (sarkantyú) D a sarkantyú képz[dés sémája IMMUNFIXÁCIÓ IMMUNELEKTROFORÉZIS (IEP) -IgG -IgA Anti -IgM -kappa -lambda Módszer: - agaróz gélt öntünk üveg vagy műanyag lapra - Megfelelő eszközzel lyukakat készítünk a gélbe, melyekbe néhány µl mintát töltünk (x, y, z) - Az elektroforézis során a mintában lévő fehérjék eltérő elektroforetikus mobilitásuk miatt szétválnak - Az elektroforézis után a szétválasztott fehérjék közötti hosszanti vájatokba (A, B, C) antitszérumot töltünk - Az antitest és a szétválasztott antigének diffúziója precipitációs ívek képződéséhez vezet Módszer: - Elektroforézist végzünk agaróz gélben - A megfelelő antiszérumot közvetlenül a gélre szélesztjük, az antitest precipitálja az antigént - A precipitátum a gélben marad, a többi fehérjét a gél mosásával eltávolítjuk - A mosás után a gélt fehérje festékkel megfestjük Elektroforézis után fehérje festés 7

8 Counterimmuno-elektroforézis KÉTDIMENZIÓS IMMUNELEKTROFORÉZIS (CRIE) At + - minta A gélben egymással szemben vándorol az antigén és az antitest. Ha találkoznak precipitátum képződik. Az első dimenzióban elektroforézissel szétválasztott fehérje frakciókat a lemezt 90 -ban elforgatva, a második dimenzióban specifikus antitestet tartalmazó gélbe futtatjuk. KÉTDIMENZIÓS IMMUNELEKTROFORÉZIS (CRIE) ELEKTROIMMUNOASSAY (RAKÉTA ELEKTROFORÉZIS) Allergy Methods and Protocols Methods in Molecular Medicine Volume 138, 2008, pp Módszer: - Antiszérumot tartalmazó agaróz gélbe készített lyukakba (vagy gélre fektetett applikátor felviteli helyeire) mintákat töltünk - Az elektroforézis során a mintában lévő fehérjék a + pólus felé vándorolnak - Az antigént az antitest precipitálja, ha ekvivalencia koncentrációra hígul a vándorlás során, azaz a képződő rakétacsóva alakú precipitációs ív magassága az antitest eredeti koncentrációjától függ. - Kalibrátorok alkalmazásával kalibrációs görbét készítünk PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK KVALITATÍV A diffúzió típusa Módszer neve Felhasználási terület Passzív kettős immundiffúzió két vagy több teszt anyagban lévő antigének azonosságának vagy különbözőségének eldöntése Elektroforézist követően passzív Elektroforézis KVANTITATÍV immunelektroforézis myeloma proteinek azonosítása kétdimenziós immunelektroforézis fehérjekeverékek vizsgálata, aktiváció vagy más molekulákkal való kapcsolódás kimutatása Counterimmunelektroforézis bakteriális antigének kimutatása vérből, vizeletből, cerebrospinális folyadékból immunfixáció myeloma proteinek azonosítása Passzív Radiális immundiffúzió Elektroforézis Elektroimmunoassay nincs Turbidimetria nincs Nefelometria antigének mennyiségi meghatározása specifikus antitestek segítségével 8