IMMUNOASSAY. Immunoassay típusok AZ IMMUNASSAY-K TÍPUSAI. Homogén - Heterogén. Direkt - Indirekt. Kompetitív - Nem kompetitív 3/22/16

Átírás

1 Az immunassay-k jelentősége Az analitikai biokémia hátaslova IMMUNOASSAY Alkalmazás Gyógyszerszint meghatározás Részesedé s Analit típusa Koncentráció tartomány 26% Kis molekulák 10 nm-mm Fertőző betegségek 21% Baktériumok, vírusok, nagy molekulák, antitestek, metabolitok Endokrinológia 33% Kis molekulák, nagy molekulák beleértve az antitesteket is (70% <5 kda) Immunológia allergia, autoimmunitás, egyéb low pm-nm 7% Antitestek pm-nm Tumor 5% Nagy molekulák, antitestek pm-nm Egyéb (specifikus proteinek stb.) 8% Nagy molekulák > nm Immunoassay típusok Homogén - Heterogén Direkt - Indirekt Kompetitív - Nem kompetitív AZ IMMUNASSAY-K TÍPUSAI Kompetitív (a reagens mennyisége limitált) szimultán: Ab + + -L Ab: + Ab:-L + -L több lépéses: 1. lépés: Ab + Ab: + Ab 2. lépés: Ab: + Ab + -L Ab: + Ab:-L + -L Nem kompetitív (a reagens feleslegben van) L=ligand: radioaktív izotóp, fluorofór, enzim, chemiluminescens, kofaktor, inhibitor, fém, partikulum, szubsztrát, polinukleotid HETEROGÉN: a komplexben kötött és szabadon lévő ligandummal jelzett reagenst a lekötődött jel detektálása előtt elválasztjuk HOMOGÉN: a kötött és szabad jelzett reagens elválasztása nem szükséges 1

2 RADIOIMMUNOASSAY (RIA) Csak abban az esetben használatos, ha egy specifikus és nagyon érzékeny módszerre van szükség. A RIA hátrányai: a nagy γ-sugárzó izotóp atomokkal történő jelölés, mint a I 125 gyakran nem megfelelő (a gyógyszerek kis molekulák, nem hatékony a jelölés vagy csökken az antigenitásuk) a tríciummal való jelölés megfelelő, de ennek hátránya, hogy a H 3 β-sugárzó és a β -scintillációs számlálás lassú és körülményes. Csak heterogén módszer lehet. Antigén helyett az antitest jelölése izotóppal: immunoradiometric assay (IRMA) FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) I. A módszer elve: egy fluoreszkáló anyaghoz (fluorofór) kémiai kötéssel antigént (gyógyszer, hormon, metabolit) kapcsolnak (konjugátum) a fluorofórhoz kötött antigént megvilágítják polarizált fénnyel Ha a konjugátumhoz nem kötődik antitest, szabadon rotál az oldatban és a beeső és az emittált fény síkja egymáshoz képest elmozdulhat. Ha a konjugátumhoz antitest kötődik, az antitest molekula nagy mérete kb. 100x-ra csökkenti annak rotációs relaxációs idejét. Ez azt jelenti, hogy csak kis elmozdulás jöhet létre ugyanannyi idő alatt, ezért az elnyelt és kibocsátott fény ugyanabban a síkban polarizált. Az emittált fény polarizációjának mértéke arányos a szabad konjugátum mennyiségével. Ha a mintában lévő szabad antigén korlátozott mennyiségű antitest kötőhelyeiért versenyez a konjugátummal, a fény polarizációjának mértéke jelzi a minta antigén koncentrációját. FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) II. A mintában nincs antigén (az összes jelzett antigén antitesthez kötött lassú rotáció) At + At- antitest jelzett antigén minta FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) III. A mintában jelen van az antigén (a mintában lévő antigén az antitesthez kötődik a jelzett antigén szabadon rotál) At + + At- + antitest jelzett antigén antigén a mintában minta síkban polarizált beeső fény ugyanabban a síkban kibocsátott fluoreszcencia síkban polarizált beeső fény Depolarizált fluoreszcencia A detektálás síkjában csökkent fluoreszcencia intenzitás 2

3 FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) IV. A készülékek a polarizált fény intenzitását mérik, ami fordított arányban áll a minta antigén koncentrációjával. polarizáció Immunoassay típusok - nem kompetitív jel At első At direkt at indirekt jel At jel második At jel At 2 antigén koncentráció direkt ag szendvics At 1 Immunoassay formációk - kompetitív 1 Immunoassay formációk - kompetitív 2!!! jelöletlen At a mintában jelzett At a reagensben jelzett a reagensben jelöletlen At a a mintában reagensben vagy a felszínen 3

4 A szilárd felszín típusai 96 lyukú mikrotitráló lemez felszíne (polystirol, PVC stb) (ELISA) Reakciócső felszíne (RIA) Latex partikulumok felszíne (pl. MEIA) Mágneses partikulumok felszíne (automatizált heterogén immunoassay-k) Izotóp Enzim JELZÉSEK 1. ( 125 I: γ, T 1/2 = 60 nap 57 Co: γ, T 1/2 = 270 nap 3 H: β, T 1/2 = év 14 C: β, T 1/2 = 5760 év) tormaperoxidáz HRPO (oxidoreduktáz) alkalikus foszfatáz AP (primer alkoholok, fenolok és aminok foszfát észtereinek hidrolízise) β-d- galaktozidáz glükóz oxidáz glükóz-6-foszfát dehidrogenáz kataláz ureáz JELZÉSEK 2. Fluorofór (megvilágítva fényt emittál) 1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP MU Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) acridium észter acridium szulfonamid isoluminol Biotin Protein A Kofaktor Inhibitor DNS 4

5 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Microwell Products ELISA (szendvics típus) Enzyme-Linked ImmunoSorbent (ELISA) leggyakrabban peptidek, proteinek, antitestek és hormonok kimutatására és meghatározására szolgál. Általában 96-well plate-t használunk (Corning s/nunc/costar stb.), de lehet 384 well, stb. Lépései: A lemezt bevonjuk (capture) az antigénre specifikus elfogó antitesttel (1-10µg/ ml) leggyakrabban karbonát-bikarbonát pufferben (ph:9.5), inkubálás 2 h szobahőn vagy egy éjszakán át 4 C-on mosás A szabadon maradt felszín blokkolása (0,5-1% BSA), inkubálás 0,5-1 h szobahőn mosás Standardok/minták bemérése ( µl/well), inkubálás 1 h szobahőn mosás Az antigénre specifikus, enzimmel (HRP/AP) konjugált jelző antitest bemérése, inkubálás 1 h szobahőn mosás Szubsztrát adása és detektálás Az inkubálási időket és hőmérsékleteket minden ELISA esetén optimalizálni kell. ELISA (szendvics típus) Ha az elfogó antitest biotinált és streptavidinnel bevont ELISA lemezt használunk, az elfogó, jelző antitesteket és a mintát egyszerre is bemérhetjük. Az inkubálási idő letelte után mossuk a lemezt majd bemérjük az enzim szubsztrátját és detektálunk (egylépéses ELISA). Szükség van istmert ag koncentrációjú standardra! ELISA kalibrációs görbe Reagensek Reakció Biotinilált anti-fxiii-b elfogó antitest FXIII A A HRP-vel jelölt anti-fxiii-a jelzô antitest A A B B B B Streptavidinnel fedett felület A lemez rázatása szükséges! Az egy lépéses szendvics ELISA FXIII meghatározás elve 5

6 Indirekt ELISA módszer (adott antigénre specifikus antitest kimutatása) MEIA (Mikropartikuláris Enzim Immuno Assay) Anti-Troponin I monoklonális antitesttel fedett Latex szemcsék Üvegszál mátrix A Mikropartikuláris Enzim Immunoassay (MEIA) elméleti alapjai A mérendő anyagra specifikus elfogóval fedett szubmikron nagyságú latex részecskéket alkalmaz a módszer. Következmény: nagy, hatékony felületet az immunreakció számára. a kinetikus reakció felerősödik, csökken az inkubációs idő. Mintavevő egységben: A mérendő minta és a szükséges reagensek egy reakcióedénybe kerülnek Mérőegységben: 1. A minta inkubálódik 2. A reakcióelegy egy inert üvegszálas mátrix felületére kerül át. Az immunkomplex fennmarad az üvegszálakon, a reakcióelegy többi összetevője átáramlik, kimosódik. 3. Az üvegszálas mátrix felületére egy a mérendő anyagra specifikus, alkalikus foszfatázzal jelzett konjugátum kerül. 4. Az üvegszálas mátrix felületére 4-Methylumbelliferyl-foszfát (MUP) kerül, melyet az enzim Methylumbelliferonná (MU) hidrolizál. 4. A reakció során a mátrix felületén keletkező fluoreszcens MU képződési rátáját mérjük, ami arányos a mintában lévő analit koncentrációjával. A MEIA reakció lépései Kétlépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG Minta Mikropartikulumok Alkalikus foszfatáz konjugát REAKCIÓ EGYSÉG A minta és a Mikropartikulumok keverednek Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik MOSÁS Alkalikus foszfatáz konjugát a mátrixra MOSÁS Egylépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG Minta Mikropartikulumok Alkalikus foszfatáz konjugát REAKCIÓ EGYSÉG A minta a Mikropartikulumok és az Alkalikus foszfatáz konjugát keverednek Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik MOSÁS Fluoreszcencia mérés Fluoreszcencia mérés 6

7 Tipikus standard görbe MEIA módszer esetén JELZÉSEK Fluorofór (megvilágítva fényt emittál) 1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP MU DELFIA: a TRF (Time Resolved Fluorometry) elvén működik JELZÉSEK Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) Enzim szubsztrátja kemiluminescens fényemisszióval stabilizálódik, pl: AP szubsztrátja az adamantil 1,2-dioxetan arylfoszfát (AMPPD) isoluminol (A HRPO hatására, H 2 O 2 jelenlétében bekövetkező luminol oxidáció fényemisszió jelerősségét 1000-szeresre növelhetjük, ha a közegben szubsztituált fenolok, vagy naftolok vannak (pl. 4-jodofenol). Az enhanced kemilumineszcenciás jel 2-20 perc időtartamban jól leolvasható. Ezt a jelképzést sok automatizált módszer használja) acridium észter, acridium szulfonamid (A jel keletkezésekor alkalikus közegben az észter kötés hasad s egy instabil N-metilakridon származék keletkezik, amely jellemző hullámhosszúságú fény felvillanások emissziójával stabilizálódik. A fényintenzitás mértéke a közeg lumineszcens anyag koncentrációjával arányos.) A DELFIA rendszerben a fluorometer 1000 excitációs fényfelvillanást szolgáltat másodpercenként, melyek kevesebb, mint 1 mikrosecundumig tartanak. A fluoreszcencia mindegyik impulzus után 400 és 800 mikrosecundum között mérhető Eltérően a fluoreszcencia méréstől, itt nincs besugárzási fény, és jel csak a lumineszcens molekulából származik, így a háttér teoretikusan nem ad jelet. Eltérően a radioaktív bomlástól, a kémiai reakcióból származó összes foton rövid idő alatt rendelkezésre áll, így növelve a potenciális specifikus aktivitást. 7

8 JELZÉSEK 4. Elektrokemiluminescens immunoassay (ECLIA) A rutenium(ii) tris (bipiridil) [Ru(bpi) 3 3+ ], egy platina elektród felületén gerjesztődik, majd alapállapotba kerül fény (elektrokemilumineszcens) emisszióval. A reakcióban elektron donorként tripropilamin (TPA) vesz részt. A Ru(bpi) 3 3+ komplex redukciójával nyerjük a gerjesztett állapotú Ru(bpi) 3 2+ komplexet, amely elektronleadás mellet fénykibocsátással tér vissza alapállapotába. Ezt a fénykibocsátást (620 nm) mérik egy átfolyó elektrokémiai cellában. Elektrondonor felesleg mellett a ruténium sokszorosan gerjeszthető, ami a jel erősödését eredményezi. 8