Platelia Mumps IgG. 1 lemez /12 MUMPS VÍRUS ELLENI IGG ANTITESTEK MINŐSÉGI MEGHATÁROZÁSA HUMÁN SZÉRUMBÓL IMMUNOENZIMATIKUS MÓDSZERREL

Átírás

1 Platelia Mumps IgG 1 lemez MUMPS VÍRUS ELLENI IGG ANTITESTEK MINŐSÉGI MEGHATÁROZÁSA HUMÁN SZÉRUMBÓL IMMUNOENZIMATIKUS MÓDSZERREL 2014/12

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. FELHASZNÁLÁS 2. A TESZT ÁTTEKINTÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE 3. A TESZT MŰKÖDÉSI ELVE 4. A KÉSZLET ÖSSZETEVŐI ÉS A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE 5. A REAGENSEK TÁROLÁSA ÉS STABILITÁSA 6. FIGYELMEZTETÉSEK 7. A MINTÁK TÍPUSA ÉS TÁROLÁSA 8. A VIZSGÁLAT MENETE 9. A VIZSGÁLAT MENETÉNEK SÉMÁJA 10. A TESZT VALIDÁLÁSA 11. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE 12. A VIZSGÁLAT KORLÁTAI 13. ANALITIKAI SPECIFICITÁS 14. DIAGNOSZTIKUS ÉRZÉKENYSÉG ÉS SPECIFICITÁS 15. PONTOSSÁG 16. HIBAELHÁRÍTÁS 17. REFERENCIÁK Ref /BRD [HU] 2

3 1. FELHASZNÁLÁS MUMPS VÍRUS ELLENI IgG ANTITESTEK MINŐSÉGI MEGHATÁROZÁSA HUMÁN SZÉRUMBÓL IMMUNOENZIMATIKUS MÓDSZERREL 2. A TESZT ÁTTEKINTÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE A Mumps egy gyakori gyermekbetegség, amelyet normálisan parotitis alapján diagnosztizálnak. Mindamellett, azoknál a betegeknél, akiknél kialakulnak a leggyakoribb szövődmények, pl. orchitis, meningitis vagy meningoencephalitis, anélkül hogy a nyálmirigyek begyulladnának, szükséges a szerológiai eredmények által történő megerősítés. Az anti-mumps IgG minőségi meghatározása hasznos a korábbi fertőzés monitorozásánál vagy a sikeres vakcináció igazolásánál. 3. A TESZT MŰKÖDÉSI ELVE A teszt ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) technikán alapszik. A tisztított és inaktivált mumps vírus antigén hozzá van kötve a szilárd fázishoz (8 lyukú csíkok). A hígított humán szérumban jelen levő specifikus immunglobulinok az inkubációs idő alatt kapcsolódnak az antigénekkel. A mosási lépésben a felesleges fehérjéket elimináljuk, majd a konjugátummal inkubálunk, és végül peroxidázzal jelölt humán IgG monoklonális antitestek jönnek létre. A nem kapcsolódott konjugátumot elimináljuk és a peroxidáz szubsztrátot hozzáadjuk. A kialakult szín arányos a szérum mintákban levő specifikus antitestek koncentrációjával. 4. A KÉSZLET ÖSSZETEVŐI ÉS A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE - A reagensek 48 meghatározáshoz elegendőek. - Szobahőmérsékletre melegítsük a reagenseket felhasználás előtt. MT PLATE CONTROL + CONTROL CUT OFF CONJ Mikrotiterlemez 6x8 csík Mumps vírussal fedve. Használat: bontsuk ki a csomagolást pont az ellentétes végen, mint ahol a kódszám látható (NG, melyet a lotszám követ). A kódszámok fontosak a teszt beazonosításánál, ezért ezek épségére vigyázzunk. Távolítsuk el a felhasználni kívánt csíkokat a fóliacsomagolásból és helyezzük a fel nem használt csíkokat szilika géllel egy polietilén zacskóba, a levegőt távolítsuk el és zárjuk le megfelelően a tasakot. Pozitív kontroll szérum (1 x 1,6 ml) Tartalom: Hígított humán szérum, amely ismert koncentrációban tartalmaz Mumps IgG antitesteket, 0,01mol/L foszfát puffer oldatban (a puffer tartalmaz még 1% BSA-t és 0,09% Nátrium-azidot). Folyékony, további hígítás nélkül használatra kész. Szín: a kontroll színe arányos a relatív antitest titerrel. Cut off kontroll szérum (1x2,0 ml) Tartalom: Hígított humán szérum, amely ismert koncentrációban tartalmaz anti- Mumps IgG-t 0,01mol/L foszfát puffer oldatban (a puffer tartalmaz még 1% BSA-t és 0,09% Nátrium-azidot). Folyékony, további hígítás nélkül használatra kész. Szín: a kontroll színe arányos a relatív antitest titerrel. Konjugátum (1x10 ml) Tartalom: anti-humán IgG monoklonális antitestek, peroxidázzal jelölve, foszfát puffer oldatban, amely 0,05% fenolt és 0,02% Bronidox-ot tartalmaz. További hígítás nélkül használatra kész. CONTROL IgG - IgG negatív kontroll (PF93910) (1x1,6mL) LOTOK KÖZÖTT FELCSERÉLHETŐ! Tartalom: Humán szérum, amely nem tartalmaz anti-mumps vírus IgG-t, 0,01mol/L foszfát puffer oldatban (a puffer tartalmaz még 1% BSA-t és 0,09% Nátriumazidot). Folyékony, további hígítás nélkül használatra kész. Ref /BRD [HU] 3

4 WASH BUF 10x SAMP DIL SUBS TMB H 2 SO 4 0.3M Mosó puffer 10x (PF93603) (1x100mL) LOTOK KÖZÖTT FELCSERÉLHETŐ! Tartalom: Foszfát puffer só, koncentrált (10x); Brij 0,5% -ot tartalmaz. Előkészítés: a kívánt térfogatot hígítsuk 1:10 arányban desztillált vízzel. Így a mosó puffer már használatra kész. Ha kristályokat látunk, akkor hígítás előtt 37 Con ezeket fel kell oldani. Hígító 2 (PF93611) 1x100 ml. A szérum minták hígításához. Használatra kész. LOTOK KÖZÖTT FELCSERÉLHETŐ! Tartalom: Fehérje oldat foszfát pufferben, amely még 0,09% nátrium-azidot és metil narancs festékanyagot is tartalmaz. Szubsztrát (1x15mL) Használatra kész. LOTOK KÖZÖTT FELCSERÉLHETŐ! Tartalom: Tetrametilbenzidin hidrogén-peroxid (ph 3,8) citrát pufferben stabilizálva. Leállító oldat (1x16mL) Lotok között felcserélhető! H 2 SO 4 0,3 mol/l, oldatban, használatra kész. ADHEZÍV FÓLIA (2) POLIETILÉN ZACSKÓ (1) A MÉRÉSHEZ SZÜKSÉGES, DE A KÉSZLETBEN NEM SZEREPLŐ ANYAGOK - Inkubátor 37 C-ra beállítva, - Mikrotiterlemez leolvasó készülék, 450 vagy 450/620 hullámhosszra beállítva, (legalább) OD >=2,000 linearitással, - Mikrotiterlemez mosó készülék (ajánlott), amely ul tartományban képes mosni, - Desztillált, vagy deionizált víz, - Általános laboratóriumi üvegeszközök: mérőhenger, tesztcsövek, stb. - Mikropipetták az oldatok pontos kiméréséhez 10, 100, 1000 ul, - Egyszerhasználatos kesztyű, - Időzítő, - Nátrium-hiploklorit oldat (5%), - A potenciálisan fertőző anyagok gyűjtésére külön tartály, - Papírtörlő. 5. A REAGENSEK TÁROLÁSA ÉS STABILITÁSA A reagenseket 2/8 C-kon kell tárolni. A lejárati idő minden egyes komponens dobozán fel van tüntetve. A következő reagensek esetén a lejárati idő limitált a doboz felnyitása vagy az elkészítés után: REAGENS TÁROLÁSI FELTÉTEL Mikrotiterlemez 6 hét 2/8 C-on, polietilén zacskóban Kontroll szérum 6 hét 2/8 C-on Konjugátum 6 hét 2/8 C-on Szubsztrát a lejárati idő végéig 2/8 C-on, 1 hétig C-on, sötétben tárolva Hígító oldat a lejárati idő végéig 2/8 C-on Mosó puffer 2 hétig 2/8 C-on tárolva, 5 napig 15/30 C-on tárolva Leállító oldat a lejárati idő végéig 2/8 C-on Ref /BRD [HU] 4

5 6. FIGYELMEZTETÉSEK KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI FELHASZNÁLÁSRA. Figyelmeztetés A reagensek elkészítéséhez használt humán eredetű anyagokat hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag), hepatitis C vírus elleni (anti-hcv) és HIV elleni antitestekre (anti-hiv1 és anti-hiv2) vizsgálták FDA engedélyezett módszerekkel, és negatívnak találták. Mivel nem létezik olyan módszer, amellyel teljes biztonsággal kizárható a fertőző ágensek jelenléte, a humán eredetű reagenseket és betegmintákat potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. A laboratóriumi gyakorlatban az elfogadott óvintézkedéseket mindig követni kell, amennyiben humán eredetű mintával dolgozunk. Egészségügyi és biztonsági információk 1. Szájjal pipettázni tilos! A mintákkal és reagensekkel való munka során viseljünk egyszerhasználatos védőkesztyűt, valamint védőszemüveget. A munka befejezése után mossunk kezet. 2. A következő reagensek alacsony koncentrációban veszélyes vagy irritáló anyagokat tartalmaznak: a) a mosó puffer detergenseket tartalmaz b) a konjugát fenolt tartalmaz c) a szubsztrát sav d) a kalibrátorok konzervalószerként 0,09% nátrium-azidot tartalmaznak, amelyek a rézzel és az ónnal reakcióba léphetnek a lefolyóban, melynek következtében potenciálisan robbanás veszélyes metál azidok képződhetnek. Kiűrítéskor öblítsünk nagy mennyiségű vízzel, azért hogy megelőzzük az azidok képződését. Ha a reagens a bőrrel vagy a szemmel érintkezik, alaposan mossuk le vízzel. 3. A többször használatos eszközöket használat után sterilizálni kell. Az ajánlott metodika az autoklávozás 1 órán keresztül 121 C-on; az eldobható eszközöket autoklávozni kell vagy el kell égetni. 4. A leállító oldatként használandó kénsav, illetve az üvegeszközök mosásához használandó sósav korrozív, kezelésük ennek megfelelőn történjen. Amennyiben bőrrel vagy a szemmel érintkezik, alaposan mossuk le vízzel. 5. A neutralizált savak vagy más folyékony vegyületeket úgy kell dekontaminálni, hogy elegendő mennyiségű nátrium-hipokloritot adunk hozzájuk, úgy hogy a végső koncentráció legalább 1%-os legyen. 30 percen keresztül 1%-os nátrium-hipoklorittal történő kezelés szükséges ahhoz, hogy biztosítsuk a hatékony dekontaminálást. 6. A potenciálisan fertőző anyag kiömlése esetén azonnal papírtörlővel felitatjuk a kiömlött anyagot, a szennyezett területet megtisztítjuk pl. 1,0%-os nátrium-hipoklorit oldattal, mielőtt tovább folytatnánk a munkát. Amennyiben savat tartalmaz a kiömlött anyag, úgy nátrium-hipokloritot nem alkalmazhatunk, hacsak nem töröljük először szárazra a szennyezett területet. A tisztításra használt anyagokat, beleértve a kesztyűt is, potenciális veszélyforrásként kezeljük és ennek megfelelően dobjuk el. Nátriumhipokloritot tartalmazó anyagot szigorúan tilos autoklávozni! 7. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: Analitikai óvintézkedések 1. A reagenseket és a mintákat hagyjuk szobahőmérsékletre (18-30 C) melegedni használat előtt. Közvetlen használat után tegyük vissza a reagenseket az ajánlott tárolási hőmérsékletre. Fontos, hogy megfelelő hőmérsékleten dolgozzunk. Ellenőrizzük, hogy a termosztát nem megy 35 C alá vagy 39 C fölé. Nyissuk ki a csomagolást, ami a sorokat tartalmazza, miután legalább fél órát hagytuk szobahőmérsékleten. 2. Ne használjuk a reagenseket az előírt lejárati időkön túl. A reagensek mikrobiológiai kontaminációját kerüljük el, mert ebben az esetben csökken a lejárati idő és téves eredményeket kaphatunk. 3. Ne módosítsuk a vizsgálat menetét, illetve ne helyettesítsük a reagenseket más gyártó által gyártott reagensekkel vagy más lotokkal, csak abban az esetben, ha ez a reagensnél engedélyezett. Az inkubálási időket ne rövidítsük le. 4. Bármelyik üvegeszközt, amelyet használtunk mossuk át 2 M-os sósavval és öblítsük át desztillált vízzel vagy nagy tisztáságú deionizált vízzel. 5. Ne tegyük ki a reagenseket erős fénynek vagy hipoklorit gőznek a tárolás vagy az inkubációs idő alatt. 6. A vizsgálat alatt ne hagyjuk a lemezeket kiszáradni. 7. Ne szennyezzük át a reagenseket. Fontos, hogy minden reagenshez külön pipettát használjunk. 8. A mikrotiterlemezek peremét ne érintsük, illetve ne fröcsköljük le a konjugáttal. A reagensek és a minta ne ömöljön ki a lemezekből. Ref /BRD [HU] 5

6 9. Az enzim immonoassay-ket alkalmanként jellemezheti az ún. perem-hatás (edge-effect), amely csökkenthető, ha az inkubálási lépés alatt a páratartalmat növeljük. A lemezeket be kell fedni a fóliákkal és inkubálni 37 C-on vagy vízfürdőben (tartóban elhelyezve vagy úsztatva, ha szükséges) vagy inkubátorban. Alternatívaként inkubálhatjuk a lemezeket megfelelő analizátorban (automatában). További adatokért nézze meg a megfelelő működési előírást. CO 2 inkubátor használata tilos. 10. Biztosítani kell, hogy a lemezek alja tiszta és száraz legyen, valamint ne legyenek jelen buborékok a folyadék felületén a lemez leolvasása előtt. 11. Nagymértékben hemolizált minta, vagy nem teljesen alvadt minta esetén, vagy ha a minta mikrobiológiailag szennyezett a téves eredmények száma megemelkedhet. 12. A használata a kit nem Bio-Rad automatizált berendezéseket kell érvényesíteni, a felhasználó által. 13. Minden egyes műszer használata esetén, olvassuk el figyelmesen a használati utasítást, a következő szempontok figyelembe vételével: - installáció és különleges követelmények, - működési elvek, utasítások, óvintézkedések és kockázatok, - a gyártó specifikációi és a műszer jellemzői, - szerviz és karbantartás. 7. A MINTÁK TÍPUSA ÉS TÁROLÁSA Normál módon vénából vett és a laboratóriumi gyakorlatnak megfelelőn kezelt szérum minta.a friss szérumot 4 napig 2/8 C-on tárolhatjuk, vagy fagyasztva -20 C-on hosszabb ideig, és maximum 3 alkalommal olvaszthajuk fel. A felolvasztott mintát óvatosan összekeverjük a vizsgálat elvégzése előtt. Melegítés hatására téves eredményekhez juthatunk. A minta minőségét befolyásolhatja mikrobiológiai kontamináció, amely szintén hibás eredményekhez vezethet. Erősen hemolizált, lipémiás, icterusos vagy szennyezett minta használatát kerüljük! Humán plazmából a vizsgálat nem végezhető el. 8. A VIZSGÁLAT MENETE Manuális technika - Készítsük elő a megfelelő számú sort. - Készítsük elő a mosó puffert, hígítsuk 1:10-hez (100mL+900mL H 2 O). Hígítsuk a mintákat 1:101 arányban, 10 ul mintához 1 ml hígítót adagolva; osszunk szét 100 ul-t minden egyes mintából a lemez lyukaiba (párhuzamos mérések ajánlottak). Helyezzünk HÍGÍTATLAN kontrollokat a sorokba (100 ul). A minimum követelmény 1 negatív, 2 cut-off és 1 pozitív kontroll használata mérésenként. Egy lyukat hagyjunk meg a vaknak (100 ul a szubsztrát keverékből). A lyukakat fedjük le védőfóliával és inkubáljuk 45 percig 37 C-on. Miután négyszer mostuk 30 másodpercig (300 ul), adjunk 100 ul-t a konjugátumból minden egyes lyukhoz, kivéve a vakot és inkubáljuk újra 45 percig 37 C-on, lefedve védőfóliával. A lemezt újra mossuk négyszer, a fent leírtak szerint. Végül osszuk szét a szubsztrátot, 100 ul-t, lyukanként. 15 perc múlva szobahőmérsékleten az enzim reakciót állítsuk le 100 ul leállító oldattal. Az abszorbanciát (O.D.) olvassuk le 450 nm vagy 450/620 nm-en 30 percen belül. 9. Platelia tm Mumps IgG vizsgálat menete 1. lépés Helyezzünk 100 ul hígított mintát és kontrollt a lemez lyukaiba Inkubáljuk 45 percen keresztül 37 C-on Mossuk 4 alkalommal (30 mp áztatási idő; 300 ul) 2. lépés Adjunk 100 ul-t a konjugátumból minden egyes lyukhoz, kivéve a vakot Inkubáljuk 45 percig 37 C-on Mossuk 4 alkalommal (30 mp áztatási idő; 300 ul) 3. lépés Adjunk 100 ul szubsztrátot minden egyes lyukhoz Inkubáljuk 15 percig szobahőmérsékleten 4. lépés Adjunk 100 ul leállító oldatot minden egyes lyukba Olvassuk le az abszorbanciát 450 nm-en 30 percen belül. Ref /BRD [HU] 6

7 10. A TESZT VALIDÁLÁSA A vak értéket (<=0,150) vonjuk ki minden egyes eredményből. Az Cut-off kontroll OD értékei, amennyiben 3x mérjük maximum 25%-kal térhetnek el az átlagtól. Hagyjunk el minden anomáliás értéket és számoljuk újra az átlagot. A pozitív kontroll OD értéke legalább 1,5-szöröse kell, hogy legyen a cut-off értéknek. Az arány a negatív kontroll és a pozitív kontroll között kevesebb kell, hogy legyen, mint 0,6. A cut-off kontroll OD értéke >=0,2 450 nm-en és >0,16 450/620 nm-en. 11. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE Ha a minta OD értéke magasabb, mint a cut-off értéke, akkor a minta pozitív specifikus IgG jelenlétére. Számoljuk ki a minta és a cut-off kontroll OD arányát. A minta Pozitív: ha az arány > 1,2 Kétes: ±20%-a a cut-off kontrollnak Negatív: ha az arány < 0,8 Amennyiben a teszt eredménye kétes, ismételjük meg a vizsgálatot. Ha ezek után is kétes marad, kérjünk új mintát. Pozitív eredmény esetén az eredmény megadható a következő formulával (AU-arbitrary unit): AU = Minta OD/Cut-off OD Ezt az értéket ún. pozitivitási index értéknek tekintjük. 12. AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A mintavétel történhet az akut fázis alatt, amikor csak IgM antitestek vannak jelen, ekkor a teszt eredménye negatív. A Mumps vírus IgM szintjének meghatározásához használhatunk Platelia TM Mumps IgM tesztet. Vagy 8-14 nap elteltével kérhetünk új mintát, tesztelhetünk parallel és az IgG antitestek szintjének emelkedését meghatározhatjuk. A teszt eredményét az egyéb elérhető eredményekkel (más diagnosztikus eljárások eredményei) együtt értékeljük. Parainfluenza vírus interferálhat a meghatározáskor. 13. ANALITIKAI SPECIFICITÁS Egyéb vírusok mint pl. Epstein Barr, Herpes simplex, Mumps és Kanyaró IgG antitestjeinek jelenléte a vizsgálati eredményeket nem változtatta meg. 14. DIAGNOSZTIKUS ÉRZÉKENYSÉG ÉS SPECIFICITÁS Klinikai kísérleteket végeztek kórházi laboratóriumokban; 166 minta vizsgálata történt meg, más, kereskedelmi forgalomban kapható enzim immunoassay teszttel párhuzamosan. Azok a minták, ahol eltérések voltak, IFA módszerrel, mint referencia módszerrel lettek megvizsgálva. Az eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze: PLATELIA TM REFERENCIA MÓDSZER MUMPS IGG A módszer érzékenysége 99,1%, a specificitása 94,0%. Ref /BRD [HU] 7

8 15. PONTOSSÁG Egy mérésben 3 különböző lot esetén: Cut-off n=12 Lot 024 Lot 025 Lot 026 O.D. 0,594 0,410 0,433 CV% 7,3 5,4 7,1 Mérések közötti és lotok közötti pontosság: INDEX Minta Lot n. 024 Lot n. 025 Lot n. 026 Átlag CV% Pozitív kontroll 4,0 5,1 4,9 4,7 13 MPG1 0,7 0,6 0,6 0,6 9 MPG2 1,2 2,0 1,5 1,6 26 MPG3 2,4 3,7 2, HIBAELHÁRÍTÁS PROBLÉMA LEHETSÉGES FORRÁSOK TESZT VAGY CSELEKVÉS Egy vagy több reagens nem lett hozzáadva vagy rossz a sorrend. meg a tesztet. Érvénytelen eredmények (mind negatív) Érvénytelen eredmények (mind pozitív) Gyenge pontosság Rendellenes szín képződése Nem reaktív a lemez. A szubsztrát szennyeződött. Nem megfelelő mosás. A mosási lépés nem komplett. Nem megfelelő aspiráció. Pipettázási hiba. A reagensek hozzáadása túl lassan történt. Buborékok jelenléte. Az optikai út nem tiszta. Nem megfelelő inkubációs idő vagy hőmérséklet. Nem megfelelő mennyiségű szubsztrát hozzáadása. Ellenőrizzük a folyamatot. Ellenőrizzük a fel nem használt oldatokat. Ismételjük Ellenőrizzük a csomagoláson a kódszámot (a tesztleírás 4. pontjában látható a helyes kódszám). Ellenőrizzük a fel nem használt lemez nedvességét. (A szilikagélnek halvány sárgának kell lennie. Ismételjük meg a tesztet. Vegyünk egy új adag szubsztrátot. Bizonyosodjunk meg arról, hogy a mosó jól működik. Bizonyosodjunk meg arról, hogy a mosó jól működik. Bizonyosodjunk meg arról, hogy a mosó jól működik. Ellenőrizzük a pipettát. A mosási lépés után ne hagyjuk, hogy kiszáradjon a lemez. Adjuk azonnal hozzá a regenseket. Pipettázás alatt kerüljük el a buborékok képződését. Ellenőrizzük a készülék fényforrását és a detektort, hogy nem koszos-e. A lemezek alját töröljük le papírtörlővel. Ellenőrizzük a hőmérséklet és az idő monitoringját. Ragaszkodjunk a használati utasításhoz. Ellenőrizzük a pipettát. 17. REFERENCIÁK 1. G. Berbers et al. Blocking ELISA for detection of mumps virus antibodies in human sera. J. Virol. Methods 42, 155 (1993). Ref /BRD [HU] 8

9

10

11

12

13 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /12