QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a centromer antitestek - amelyek specifikusan reagálnak a CENP-A és CENP-B antigénnel - szemi-kvantitatív kimutatására humán szérumban. Ezeknek az ellenanyagoknak a kimutatása felhasználható kiegészítésként bizonyos kötőszöveti betegségek, mint a scleroderma CREST variánsának a diagnosztikája során. A teszt összegzése és magyarázata A kromoszómák centromer régiója ellen irányuló autoantitestekről az első leírás 1980-ban jelent meg 1. Hagyományosan ezeket az ellenanyagokat indirekt immunfluorescens eljárással mutatják ki, gyorsan osztódó szövetkultúrát, például HEp-2 sejteket alkalmazva szubsztrátként 2. A centromernek nevezett képletről ma már tudjuk, hogy számos fehérjetartalmú alkotórészből áll, ezek közül legfontosabbak a CENP- A, CENP-B és a CENP-C 2. Ezek közül a centromer alegységek közül többet sikerült izolálni vagy klónozni. A CENP-B fúziós fehérjéket már évek óta használják diagnosztikai módszerekben 3. A centromer ellenes autoantitestek legtöbbször CENP-B és CENP-A specifikusak. Legalább még három további antigént sikerült azonosítani, de az ellenük termelődött antitesteket (CENP-D, CENP-E and CENP-F) sokkal ritkábban lehet kimutatni 3,4. CENP-B felhasználásával készült ELISA kitek érzékenységét 94-95%- osnak találták, amikor egy HEp-2 sejt szubsztráton végzett, jó immunfluorescens módszerrel hasonlították össze 3,5,6. Klónozták a CENP-A fehérjét 7, és a legújabb tanulmányok adatai azt igazolják, hogy az olyan ELISA módszerek, amelyek a CENP-A és CENP-B-t is tartalmazzák, az immunfluorescens eljáráshoz nagyon hasonló eredményeket tudnak nyújtani, és a tesztek érzékenysége mindkét fehérje használata esetén felülmúlja bármelyik egyedi antigénnel elérhető teljesítményt 8. A centromer antitesteket úgy tartjuk számon, mint a szisztémás sclerosis vagy scleroderma egy specifikus formájának szerológiai markerét, amit általában CREST szindrómának (calcinosis, Raynaud jelenség, esophagus immotilitás, sclerodactylia és telangiectasia) 9. A centromer antitestekkel rendelkező betegek betegsége rendszerint benignusabb, kevesebb általános szervérintettséggel, és ezek a betegek általában nem termelnek más antinuclearis antitesteket, beleértve a SCL-70 antigént is 10. A módszer elve A QUANTA Lite TM Centromere ELISA tesztben használt antigének rekombináns módszerrel előállított CENP- A és CENP-B. Ezeket az antigéneket rögzítették polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő centromer antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta-edényekben kialakult szín intenzitását a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított Centromer (CENP-A és CENP-B) antigénnel (12-1 x 8 mérőhely) bevonva, tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán anti-centromer antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. Centromere ELISA Low Positive (Mérsékelten Pozitív Kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-centromer antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. Centromere ELISA High Positive (Erősen Pozitív Kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum anti-centromer antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 1

2 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínű, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP Mosó Koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kékre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az 2

3 antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése, A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 Centromer ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll előhígítva 1 1.2mL Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Mosó Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény az HRP Mosó Koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó, ami képes az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer, Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP Mosó Koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP Mosó Koncentrátumos üveg tartalmát 975mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre 3

4 feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 1 hétig stabil 2 8 C között tárolva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív, a Centromer ELISA Erősen Pozitív és az ELISA Negatív Kontrollt. 4. Az anti-centromer antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységben történő meghatározása céljából használjon minden egyes kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t mind az előhígított Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív, a Centromer ELISA Erősen Pozitív kontrollokból, az ELISA Negatív Kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP Mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll, a Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4

5 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA Negatív Kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. Az ELISA Negatív Kontroll és a Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll a reagens minőségének jelentősebb eltérését kontrollálja. A Centromer ELISA Erősen Pozitív Kontroll használata nem garantálja a precizitást az assay küszöb (cutoff) koncentrációja közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja a Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll OD átlagával. Az eredményt megszorozza a Centromer ELISA Mérsékelten Pozitív Kontroll címkéjén található egységek mérőszámával. Minta OD Minta éretéke = x Centromer ELISA Mérs. Pozitív Kontroll (egység) Centromer ELISA Mérs.Poz.Kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi értékek csak tájékoztató jellegűek. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A mintákat az alábbi táblázat segítségével besorolhatjuk a negatív, gyengén pozitív, mérsékelten pozitív vagy erősen pozitív csoportba. Egység Negatív < 20 Gyengén pozitív Mérsékelt illetve erősen pozitív >30 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában Centromer antitestek vannak, és felveti CREST szindróma lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs Centromer antitestje, vagy annak koncentrációja a teszt negatív küszöbe alatt van. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi meállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A és CENP-B) ELISA használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott anti-centromer értékek ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. 5

6 A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Nem minden CREST szindrómás beteg lesz pozitív CENP-A vagy CENP-B antitestre. 3. A teszt eredményeit minden esetben a klinikai adatokkal és más szerológiai vizsgálatok eredményével együtt kell értékelni. 4. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek A QUANTA Lite TM Centromer (CENP-A és CENP-B) ELISA alkalmasságát a Centromer IgG antitestek detektálására klinikai betegcsoportokban tesztelték a módszert egy külső klinikai értékelés és egy belső tanulmány során, és összehasonlították egy Centromer antitest kimutatására alkalmas IFA módszerrel is. Referencia tartomány Válogatás nélküli véradóktól összesen 150 mintát vizsgáltak. A vizsgált populáció 89 férfiból és 61 nőből állt, az életkoruk 17 és 74 év között volt. Csak 1 minta (0.6%) volt pozitív. Az egyetlen pozitív minta 51 Egység pozitivitást mutatott, és Centromer antitestre pozitív volt IFA módszerrel is, HEp-2 sejt szubsztrátumon vizsgálva. Relatív szenzitivitás és specificitás 397 mintát tszteltek a QUANTA Lite Centromere ELISA kittel és egy másik, kereskedelmi ANA teszttel anticentromer antitestre. Az eredményeket az alábbiakban foglaltuk össze : Centromer immunfluorescens módszerrel + - QUANTA Lite Relatív Szenzitivitás = 98.7% Centromere Relatív Specificitás = 100% Klinikai szenzitivitás és specificitás A QUANTA Lite Centromere antitest kitet egy külső klinikai tanulmányban és egy belső tanulmányban értékelték. Az alábbi táblázat a két tanulmány összesített adait foglalja össze : Betegcsoport N. Poz.szám (%) Centromer* (98.7%) Egyéb ANA pozitív esetek* 59 0 Scl-70 pozitív esetek* 29 0 Egészségesek 150 1** (0.6%) *Mindegyik minta pozitív volt HEp-2 sejt szubsztráton. A fenti centromer pozitív minták nagy többségét Professor Rene' Louis Humbel laboratóriumában vizsgálták, a Central Hospital-ban, Luxemburgban. **Ez volt az egyetlen minta, amelyet centromer pozitívnak találtak, HEp-2 szubsztráton is. Kereszt-Reaktivitás A QUANTA Lite Centromer kit kereszt-reaktivitásának meghatározása 59 minta felhasználásával történt, amelyekben nagy koncentrációban volt jelen ANA, dsdna, ENA és más autoantitestek. Egyik mintát sem találták reaktívnak. Hasonlóképpen a vizsgált 29 Scl-70 pozitív minta is negatív eredményt adott a tesztben. Precizitás és reprodukálhatóság A precizitás és a reprodukálhatóság vizsgálatát egy negatív, egy gyengén pozitív és egy erősen pozitív mintából hatszor megsmételt meghatározásokkal végezték, hat független sorozatban. Az egységben kifejezett átlagos érték volt az erősen pozitív mintában, a gyengén pozitívban és a negatív értéke 2.46 egység volt. Az egyes minták értékeinek standard deviációja és variációs együtthatója látható az alábbi táblázatban. 6

7 Negatív Erősen pozitív Gyengén pozitív SD CV SD CV SD CV Öszesített % % % Sorozaton belül % % % Sorozatok között % % % Hivatkozások 1. Moroi Y., et al. Autoantibody to Centromere (kinetochore) in sclerderma sera. Proc Natl Acad Sci USA 77: , McHugh NJ. Centromere autoantibodies pp In Autoantibodies, JB Peter and Y Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, Earnshaw WC., et al. Analysis of anticentromere autoantibodies using cloned autoantigen CENP- B. Proc Natl Acad Sci USA 84: , Rattner JB., et al. CENP-F is a ca. 400 kda kinetochore protein that exhibits a cell cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton 26: , Vazquez-Abad D, et al. AntiCentromere autoantibodies: Evaluation of an ELISA using recombinant fusion protein CENP-B as antigen. Arthritis Rheum 37: , Whyte J., et al. Frequency of autoantibodies to a major epitope as the carboxyl terminal fragment of CENP-B in patients with autoimmune disease. Brit J Rheumatol 34: , Sun D., et al. Detection of anticentromere antibodies using recombinant CENP-A protein. Arthritis Rheumatism 39: , Russo K., et al. Circulating anticentromere CENP-A and CENP-B antibodies in patients with diffuse and limited systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis. J Rheumatology 27: , Tan EM., et al. Diversity of antinuclear antibodies in progressive systemic sclerosis: Anticentromere antibody and its relationship to CREST syndrome. Arthritis Rheumatism 23: , McCarty GA., et al. Anticentromere antibody clinical correlations and association with favorable prognosis in patients with scleroderma variants. Arthritis Rheumatism 26: 1-7, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN May 2007 Revision HUN0 7