Rubella-IgM-ELA Test PKS medac. Magyar 135-PKS-VPU/010708

Átírás

1 RubellaIgMELA Test PKS medac Magyar PKSVPU/010708

2 GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ RENDELÉSI CÍM Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ PKSVPU/010708

3 RubellaIgMELA Test PKS medac Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, rubeola vírus elleni IgM antitestek kimutatására Katalógusszám: 135PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA! BEVEZETÉS A rubeolát okozó patogén a rubeola vírus (németül measles), mely a Togaviridae családba és a Rubivirus nemzetségbe tartozik. A rubeola vírusnak egyszeres szálú RNS genomja van és egyetlen szerotípusa létezik. A rubeola leggyakrabban gyerekkorban jelentkezik és rendszerint enyhe lefolyású. A betegséget apró pontos exanthema jellemzi és lymphadenosis kíséri. A terhesség elsı trimeszterében a rubeola fetális fertızést okozhat, mely irreverzibilis embryofoetalis károsodást eredményezhet. A rubeloa vírus specifikus IgM antitestek a kiütések kezdetétıl számított 4 30 nap múlva mutathatók ki és 1 4 hónapig perzisztálnak. Ezért a RubellaIgMELA Test PKS medac teszttel történı IgM antitest kimutatás alkalmas az akut rubeola fertızés diagnózisára. Néha az IgM antitestek egy évig is perzisztálhatnak, vagy akár egyáltalán el sem tőnnek. Ezért az IgM eredményeket az anamnézis adatokkal és lehetıleg további rubeola fertızés kimutató módszerekkel együtt kell értelmezni. 135PKSVPU/

4 A TESZT ELVE A lemez antihumán IgM immunolobulinnal van bevonva. A mintában levı IgM szelektíven kötıdik a lyukakhoz. Az mabperoxidáz konjugátum és rubeola vírus antigén komplex kötıdik a rubeola virus specifikus IgM antitestekhez (AG = antigén, P = peroxidáz). Inkubáció a TMBszubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le. A teszt elınyei Nincs nemspecifikus reakció és nincs a reumatoid faktor által okozott álpozitív reakció. A magas IgG titer nem blokkolja az IgM antitesteket. A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetıvé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. A törhetı csíkok lehetıvé teszik a teszt gazdaságos felhasználását. Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerő ELISA készülékeken. 135PKSVPU/

5 A KIT TARTALMA Katalógusszám: 135PKS 1. MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk (kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhetı, Ualakú, kecske antihumán IgM immunoglobulinnal bevont, BSA és ph indikátor, felhasználásra kész. 2. CONTROL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 3. CONTROL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 4. WB Mosó puffer: 1 flakon, 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, ProClin TM 300 tartalmú. 5. VIRDIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, felhasználásra kész, ProClin TM 300 tartalmú. 6. ANTIGENDIL Antigén hígító: 1 flakon, 14 ml Tris/NaCl, felhasználásra kész, ProClin TM 300 tartalmú. 7. ANTIGEN Antigén: 4 fiola, mindegyik 3,0 ml rubeola vírus antigén/bsat tartalmaz, liofilizált. 8. CON Konjugátum: 1 fiola, 0,3 ml, antirubeola vírus IgG antitest, monoklonális (egér), HRPvel konjugált, piros színő, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 9. TMB TMBszubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész. 10. STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H 2 SO 4 ), felhasználásra kész. 135PKSVPU/

6 1. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS Anyag/Reagens Állapot Tárolás Stabilitás Teszt kit bontatlan C lejárati idı végéig Mikrotiterlemez bontott C zacskóban 6 hét szárítószerrel Kontrollok bontott C 6 hét Mosó puffer hígított C 6 hét Minta hígító bontott C 6 hét Antigén hígító bontott C 6 hét Antigénkonjugátum felhasználásra C 1 hét keverék kész TMBszubsztrát bontott C 6 hét Leállító oldat bontott C lejárati idı végéig Ne használjuk a reagenseket a lejárati idın túl. 2. SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM SZÁLLÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK 2.1. Víz injekcióhoz (H 2 O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást Állítható mikropipetták Tiszta üveg, vagy mőanyag edények a mosópuffer és a minták hígításához Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó) Inkubátor, 37 C Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és nm szőrıkkel. 3. A REAGENSEK ELİKÉSZÍTÉSE A mérés megkezdése elıtt az összes komponenst szobahımérsékletőre kell hozni. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. 135PKSVPU/

7 Megjegyzés: A mikrotiter lemez lyukai halvány zöld színőek. A lyukakban idınként elıforduló zöldesbarna elszínezıdést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítıképességét nem befolyásolja Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minıségő vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) elıforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 C) és/vagy szobahımérsékleten keveréssel Antigénkonjugátum keverék Oldja fel a liofilizált antigént 3,0 ml antigén hígítóval. Gyengéden keverjük el és ügyeljünk, hogy a dugóra tapadt részek is feloldódjanak. Felhasználás elıtt 60 perccel adjon 50 µl konjugátumot 3,0 ml antigénhez. Az antigén feloldása és a konjugátum hozzáadása után az antigénkonjugátum keverék piros lesz és felhasználásra kész. A felhasználásra kész antigénkonjugátum keverék 2 8 Con 1 hétig tárolható (ld. 1.). Figyelem! Ne fagyassza! Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, konjugátum, antigén, antigén hígító) a különbözı gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a minta hígító, a mosó puffer, a TMBszubsztrát és a leállító oldat általában cserélhetı az összes medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények csak a használati utasítás pontos betartása esetén nyerhetık. 4. MINTÁK 4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas A szérumok elıkezelése, pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroorganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket A mintákat 1:100szorosra kell hígítani mintahígítóval. A minták tovább hígíthatóak titer meghatározáshoz. 135PKSVPU/

8 5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a simítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat. (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, elımosás nem szükséges Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 µl hígított mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kékre változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahımérsékleten 30 percig nedves kamrában, illetve 60 percig 2 8 Con tarthatjuk Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva Készítsük elı az antigénkonjugátum keveréket (ld. 3.3.) Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 µl mosópufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szőrıpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel! 5.6. Adjunk antigénkonjugátum keveréket (piros színő) minden lyukba (kivétel A1). 50 µl antigénkonjugátum keveréket pipettázzunk a lyukakba, ha manuálisan dolgozzuk fel. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 µl antigénkonjugátum keveréket pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában elıforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerısítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban mőködı automatával való kompatibilitást ellenırizzük Inkubáljuk újra 60 percig (± 5 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva Az inkubáció után mossuk a lemezt újra.(ld. 5.5.). 135PKSVPU/

9 5.9. Adjunk 50 µl TMBszubsztrát oldatot minden lyukba (A1be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik Állítsuk le a reakciót 100 µl leállító oldattal minden lyukba (A1be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás elıtt tisztítsuk meg a mikrotiter lemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegıbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni! 5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN Negatív kontroll Pozitív kontroll Minta Háttér (A1) Negatív kontroll 50 µl Pozitív kontroll 50 µl Minta 50 µl Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3x 200 µl mosóoldattal Antigénkonjugátum keverék 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3x 200 µl mosóoldattal TMBszubsztrát 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkubáljuk 30 percig 37 Con sötétben Leállító oldat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Fotometrikus leolvasás 450 nmen (ref nm) *) manuális/automatikus eljárás (ld. 5.6.) 135PKSVPU/

10 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (VALIDITÁS) Olvassuk le az OD értékeket 450 nmen (referencia hullámhossz nm). Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékbıl. A negatív kontroll átlagos OD értéke < 0,100 legyen. A pozitív kontroll átlagos OD értéke > 0,800 legyen. Cutoff = negatív kontroll átlag OD értéke + 0,320 Szürke zóna = Cutoff ± 10 % Ismételjük meg a vizsgálatot, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak. 6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE/A MÓDSZER KORLÁTAI A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékő minták NEGATÍVnak tekintendık. A szürke zónába esı OD értékő minták KÉTESnek tekintendık. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal késıbb friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében. A szürke zóna felsı határánál nagyobb OD értékő minták POZITÍVnak tekintendık. Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni. Ritkán az ANApozitív minták álpozitív eredményt adhatnak. Nagyon nagy koncentrációjú lipidek magasabb OD értékeket eredményezhetnek, mely befolyásolhatja az eredményeket. A hemoglobin, vagy bilirubin nagy koncentrációja nem befolyásolja az eredményeket. 135PKSVPU/

11 7. TELJESÍTİKÉPESSÉG Az alábbi teljesítıképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS FAJLAGOSSÁG 466, egészséges véradóktól, akut rubeola fertızés gyanús betegektıl, egyéb vírusok (CMV, HSV, VZV, EBV, Parvo B19) elleni IgM antitesteket tartalmazó szérumokat, továbbá ANA és reuma faktor tartalmú szérumokat vizsgáltak RubellaIgMELA Test PKS medac teszttel, összehasonlítva egy a laborokban rutinban használt magas specificitású ELISA teszttel. Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be. Referencia teszt negatív pozitív RubellaIgMELA Test PKS negatív medac pozitív Érzékenység = 99,03 % Fajlagosság = 99,17 % Pozitív prediktív érték: 97,14 % Negatív prediktív érték: 99,72 % 7.B. PONTOSSÁG Minta Teszten belüli szórás Minta Tesztek közötti szórás átlag SD CV (%) n átlag SD CV (%) n OD OD NK 0,025 0, NK 0,024 0, PK 1,235 0, PK 0,962 0, N 0 1 1,400 0, N 0 4 0,922 0, N 0 2 0,930 0, N 0 5 0,230 0, N 0 3 0,488 0, N 0 6 1,159 0, N 0 7 0,426 0, NK = negatív kontroll; PK = pozitív kontroll 135PKSVPU/

12 ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK A keresztszennyezés elkerülése érdekében ne cseréljük fel a fiolákat és kupakjaikat. A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében. Használat után a reagenseket az elıírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében. Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekbıl, illetve gyártásból származó reagensekkel történı felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is). EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani. Az emberi eredető reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAgra, HIV1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erısen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredető reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertızıként kezeljük és az összes szükséges elıvigyázatossággal használjuk. MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendık. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és elıírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelı cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. A kibocsátás dátuma: PKSVPU/

13 IRODALOM Enders, G.: Röteln. Fortschr. Klin. Virol. München, (1986). Hermann, K.L.: Available Rubella serological tests. Rev. Infect. Dis. 7, (1985). Pustowoit, B., Hofmann, J. und Trauer, H.: Rötelnvirus, in: Diagnostische Bibliothek, Bd. 1, Virusdiagnostik, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell WissenschaftsVerlag, (1996). Selb, B.: Rötelnvirus, in: Medizinische Virusdiagnostik, Selb, B. (Hrsg.), Umschau Verlag, (1992). Thomas, H.I., MorganCapner, P., Roberts, A., Hesketh, L.: Persistent rubellaspecific IgM reacitivity in the absence of recent primary rubella and rubella reinfection. J. Med. Virol. 36, (1992). Wolinsky, J.: Rubella, in: Virology, 2. Edition, Field, B. N., Kiepe, D. M. et al. (Eds.), Raven Press, Ltd., New York (1990). 135PKSVPU/