QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Alkalmazási terület A QUANTA Lite TM OMP Plus készlet enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA), amely az IgA osztályba tartozó OMP-ellenes antitestek kvantitatív kimutatására szolgál humán szérumban. Az anti- Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) antitestet alkalmazó (ASCA), IgG és/vagy IgA tesztrendszerekkel való együttes használatra fejlesztették ki. Az OMP (külső membránfehérjék)- ellenes IgA antitestek jelenléte, a klinikai vizsgálatok és egyéb laboratóriumi tesztek eredményeivel együtt segítséget nyújthat a Crohnbetegség diagnosztizálásában. A teszt összefoglalása és magyarázata A gyulladásos bélbetegség (IBD) általános kifejezés, amely a belek gyulladásához vezető betegségek leírására szolgál. Az IBD két fõ formája a Crohn-betegség (CD) és a colitis ulcerosa (UC). 1-3 A Crohn-betegség és a colitis ulcerosa egyaránt krónikus betegség, körülbelül egyenlő arányban érint férfiakat és nőket, és leggyakrabban Észak-Európában és Észak-Amerikában fordul elő. A Crohnbetegségben szenvedő egyének körülbelül 20%-ának egy vérrokona is az IBD valamely formájában szenved. A Crohn-betegség általában éves kor körül kezdődik, egy második, kisebb előfordulási csúccsal az évig terjedő életkorban. Az elmúlt évtizedben számos közlemény tudósított a Crohnbetegség prevalenciájának növekedéséről különböző földrajzi régiókban. 4-6 Bár a Crohn-betegség és a colitis ulcerosa okával kapcsolatban számos elmélet létezik, még egyiket sem sikerült bizonyítani. Mivel a Crohnbetegség és a colitis ulcerosa sok tünete hasonló, a diagnózis felállítása gyakran nehéz, időigényes és invazív. Az esetek körülbelül 10-12%-a kezdetben nem klasszifikálható, ezeket az eseteket nem meghatározott colitis névvel illetik. Az idő elteltével ezen páciensek körülbelül felét végül a CD vagy az UC csoportba sorolják. 7,8 Az anti-saccharomyces cerevisiae antitestekről (ASCA) kimutatták, hogy szignifikánsan gyakrabban fordulnak elő Crohn-betegekben, mint colitis ulcerosás betegekben, vagy egészséges kontrollokban Úgy tűnik, hogy ezek az antitestek, amelyek közé mind az IgG, mind pedig az IgA osztályba tartozó antitestek tartoznak, a Saccharomyces cerevisiae sejtfalának mannán alkotójában található mannóz szekvenciákkal szemben termelődnek. Az IgG vagy IgA ASCA jelenlétéről kimutatták, hogy nagy fokban specifikus a Crohnbetegségre. Az ASCA kimutatása néhány páciens esetében hasznos lehet a Crohn-betegség és a colitis ulcerosa elkülönítésében. 7,8 Néhány Crohn-beteg esetében kimutatták, hogy antitesteket termelnek számos baktériumból származó antigénnel szemben. A leírt antitestek közé tartoznak olyanok, amelyek az E.coli külső C membránfehérjéjével (OMP C), a Pseudomonas fluorescens fehérjéivel (12), valamint számos mycobacterialis antigénnel szemben termelődnek. 11,12 Mivel néhány ilyen antigénnel szembeni antitest megjelenik az ASCA-negatív Crohn-betegek egy alcsoportjában is, és ez egy bonyolultabb betegségfenotípussal függ össze, olyan assay-ket fejlesztettek ki, amelyek ezen IBD-vel kapcsolatos antimikrobiális antitestek kimutatására szolgálnak. Crohn-betegségben szenvedő páciensekből izolált két baktériumfaj külső membránjának és a hozzá kapcsolódó fehérjéknek a saját lizátumát magában foglalva a QUANTA Lite OMP Plus ELISA lehetővé teszi az antimikrobiális antitestek szélesebb tartományának a kimutatását, az egyetlen antigénen alapuló assay-kkel ellentétben. Az eljárás elve Crohn-betegségben szenvedő páciensekből izolált 2 baktériumfajból származó, részlegesen tisztított külső membránt és a hozzá kapcsolódó fehérjéket (OMP) tartalmazó saját lizátum polisztirén mikrocella-lemez celláihoz kötődik. Az előre hígított kontrollokat és a hígított páciensszérumokat különböző cellákhoz adják, így minden jelenlévő OMP antitest kapcsolódni tud az immobilizált antigénhez. A meg nem kötött mintát mosással eltávolítják, majd enzimmel jelölt anti-humán IgA konjugátumot adnak az egyes cellákhoz. Egy második inkubáció során az enzimmel jelölt anti-humán IgA kapcsolódni tud a páciens azon antitestjeihez, amelyek kötődtek a mikrocellákhoz. A meg nem kötött enzimmel jelölt anti-humán IgA kimosását követően a fennmaradó enzimatikus aktivitás egy kromogén szubsztrát hozzáadásával, majd a kialakuló szín intenzitásának a mérésével határozható meg. Az assay spektrofotometriásan értékelhető a pácienscellákban kialakuló szín intenzitásának és a kontrollcellák színének a mérésével és ezek összehasonlításával. Reagensek 1. Tisztított OMP Plus antigénnel bevont polisztirén mikrocellás ELISA lemez (12-1 x 8 cella) tartóval, szárítószereket tartalmazó fóliacsomagolásban 2. ELISA negatív kontroll; 1 ampulla, tartósítószert, valamint OMP-ellenes humán antitesteket nem tartalmazó humán szérumot magában foglaló puffer; 1,2 ml-es térfogatban, előre hígítva, azonnal felhasználható formában 3. OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontroll; 1 ampulla tartósítószert és OMP-ellenes humán antitesteket tartalmazó humán szérumot magában foglaló puffer; 1,2 ml-es térfogatban, előre hígítva, azonnal felhasználható formában 1

2 4. OMP Plus ELISA magas pozitív kontroll; 1 ampulla tartósítószert és OMP-ellenes humán antitesteket tartalmazó humán szérumot magában foglaló puffer; 1,2 ml-es térfogatban, előre hígítva, azonnal felhasználható formában 5. HRP mintahígító; 1, 50 ml-es, ampulla, amely rózsaszínű oldatban Tris-pufferelt sóoldatot, Tween 20- at, fehérje stabilizálószereket és tartósítószert tartalmaz 6. HRP mosókoncentrátum; 1 db. 40x-es koncentrátumot tartalmazó, 25 ml-es ampulla, amelyben piros oldatban Tris-pufferelt sóoldat és Tween 20 található A hígítási utasításokkal kapcsolatban kérjük, tájékozódjon a Módszerek fejezetből. 7. HRP IgA konjugátum (kecske), anti-humán IgA; 1, 10 ml-es ampulla, amelyben szalmasárga oldatban puffer, fehérjét stabilizáló szer és tartósítószer található 8. TMB kromogén; 1 db. 10 ml-es, stabilizálószereket tartalmazó ampulla 9. HRP Stop oldat; 1 db. 10 ml-es, színtelen, 0,344M kénsavat tartalmazó ampulla Figyelmeztetés 1. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék a Kalifornia Állam által ismert rákkeltő anyagot (0,02% klóramfenikolt) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban. 2. Minden, a termék kontrolljainak elkészítéséhez használt humán eredetű anyagot az FDA által jóváhagyott módszerekkel megvizsgáltak és negatívnak találtak a HIV-, a szifilisz-, a HBsAg- és a HCV-ellenes antitestekre nézve. Egyetlen ismert tesztmódszer sem tud azonban tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV vagy HCV vírusoktól, illetve más fertőző ágensektől. Emiatt az OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontrollt, az OMP Plus ELISA magas pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt potenciálisan fertőző anyagként kell kezelni Tartósítószerként nátriumot-azidot használtak. A nátrium-azid méreg, amely lenyelve, illetve a bőrön vagy a szemeken keresztül felszívódva toxikus hatású lehet. A nátrium-azid az ólom, vagy réz csővezetékekkel reakcióba lépve potenciálisan robbanékony fém-azidok keletkezését okozhatja. A reagens eldobására használt lefolyókat nagy mennyiségű vízzel öblítse le, az azidképződés elkerülése érdekében. 4. A HRP konjugátum hígított mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, amely nagy mennyiségekben lenyelve toxikus hatású lehet. A lehetséges kémiai égések megelőzése érdekében kerülje a bőrrel és a szemmel történő érintkezést. 5. A TMP kromogén irritáló hatású anyagot tartalmaz, amely belélegzés, lenyelés vagy a bőrön keresztüli felszívódás esetén veszélyes lehet. A sérülés megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, lenyelését, illetve a bőrrel és a szemekkel való érintkezését. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsavoldatból áll. Kerülje a lúgokkal, fémekkel és más olyan vegyületekkel való érintkezést, amelyek reakcióba léphetnek a savakkal. A kénsav mérgező és korrozív hatású vegyület, amely lenyelve toxikus lehet. A kémiai égések megelőzése érdekében kerülje a bőrrel és a szemmel történő érintkezést. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a teszttel szállított reagensekkel végzett munka során. 8. A kiömlött reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékártalmatlanítás során vegye figyelembe az összes szövetségi, állami és helyi környezeti szabályozást. Óvintézkedések 1. Ez a termék In Vitro diagnosztikai alkalmazásra szolgál. 2. Az alkotórészeknek a rendszerben biztosítottól eltérő alkotórészekkel történő helyettesítése ellentmondásos eredményekhez vezethet. 3. A folyadékok nem teljes, vagy nem hatékony eltávolítása az ELISA cellasávokból pontatlanságot és/vagy erős háttért okoz. 4. Az assay egészben vagy részben automata mintafeldolgozó és egyéb folyadékkezelő berendezésekkel történő használata a Felhasználói kézikönyvben leírt eljáráskor kapottaktól eltérő teszteredményeket okozhat. Minden laboratórium felelőssége, hogy hitelesítse, hogy az általuk alkalmazott automata eljárás az elfogadható határokon belüli teszteredményeket ad. 5. Számos tényező befolyásolja az assay teljesítményét. Ezek többek között a reagensek kezdeti hőmérsékletei, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és megismételhetősége, a mosás és a folyadékeltávolítás teljessége az ELISA sávok celláiból, az eredmények mérésére alkalmazott fotométer és az inkubációs idők hossza az assay során. A pontos és reprodukálható eredmények nyerése érdekében gondos figyelmet kell fordítani a következetességre. 6. Javasoljuk, hogy szigorúan tartsa be a protokoll utasításait. 7. A mikrocella-sávokat és szárítószereket tartalmazó tasak cipzárjának nem megfelelő visszazárása az antigén lebomlását és pontatlanságot eredményez. 8. Ha az idő folyamán egyetlen HRP konjugátum üvegéből kétszer vagy többször használ fel reagenst, elfogadhatatlanul alacsony abszorbanciaértékeket kaphat. Ennek elkerülése érdekében fontos, hogy kövesse az összes, a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó folyamatot. 9. A HRP konjugátum a berendezés, vagy az eszközök nem megfelelő tisztítása, vagy öblítése következtében kémiailag kontaminálódhat. Általános laboratóriumi vegyszerek, pl. formalin-, hipó-, etanol- vagy detergensmaradványok az idő folyamán a HRP konjugátum lebomlását okozzák. A kémiai tisztítószerek/fertőtlenítőszerek alkalmazása után alaposan öblítse le az összes berendezést vagy eszközt. 2

3 Tárolási körülmények 1. A készlet minden reagense 2-8 C-on tárolandó. Fagyasztani tilos. Az előírásoknak megfelelő tárolás és kezelés esetén a reagensek a lejárati dátumig stabilak maradnak. 2. A nem használt antigénnel bevont mikrocella-sávokat gondosan vissza kell zárni a szárítószereket tartalmazó fóliatasakba és 2-8 C-on kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C-on 1 hétig stabil. Mintagyűjtés Ezt az eljárást szérummintán történő kivitelezésre fejlesztették ki. Azid vagy más tartósítószer adása a tesztmintákhoz károsan befolyásolhatja az eredményt. Ne használjon mirobiálisan szennyezett, hővel kezelt vagy olyan mintákat, amelyekben látható részecskék vannak. Kerülje továbbá a makroszkóposan hemolizált, vagy lipémiás szérum vagy egyéb minták használatát. A mintagyűjtést követően a szérumot szeparálni kell az alvadéktól. A CLSI (NCCLS) H18-A3-as jelzésű dokumentumában a következő mintatárolási körülményeket javasolja: 1) Szobahőmérsékleten ne tárolja a mintákat 8 óránál tovább. 2) Ha az assay-t nem végzik el 8 órán belül, hűtse a mintát 2-8 C-on. 3) Ha az assay-t nem végzik el 48 órán belül, illetve a minta szállításához fagyassza azt -20 C-ra, vagy ennél alacsonyabb hőmérsékletre. A felolvasztást követően, a tesztelés előtt a fagyasztott mintákat jól össze kell keverni. Eljárás Biztosított anyagok 1 OMP Plus ELISA mikrocella-lemez (12-1 x 8 cella) tartóval 1 1,2 ml előre hígított, azonnal felhasználható ELISA negatív kontroll 1 1,2 ml előre hígított, azonnal felhasználható OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontroll 1 1,2 ml előre hígított, azonnal felhasználható OMP Plus ELISA magas pozitív kontroll 1 50 ml HRP mintahígító 1 25 ml HRP mosókoncentrátum, 40x-es koncentrátum 1 10 ml HRP IgA konjugátum (kecske), anti-humán IgA 1 10 ml TMB kromogén 1 10 ml HRP Stop oldat, 0,344 M kénsav További szükséges, de a teszttel nem szállított anyagok 5, 100, és 500 µl-es mennyiségek kezelésére alkalmas mikropipetták Eldobható mikropipetta-hegyek 4 ml-es térfogatú, a páciensminták hígításához szükséges kémcsövek Desztillált, vagy ionmentesített víz 1 l-es tároló a hígított HRP mosókoncentrátum számára OD-t (optikai denzitást) 450 nm-en (illetve a kettős hullámhossz-leolvasásokhoz 620 nm-en) mérni képes mikrocella-lemez leolvasó Módszer Kezdés előtti teendők 1. Hagyja a reagenseket és a mintákat szobahőmérsékletűre (20-26 C) melegedni és jól keverje össze őket. 2. Hígítsa a HRP mosókoncentrátumot 1:40 arányban, a HRP mosókoncentrátum-üveg tartalmának 975 ml desztillált, vagy ionmentesített vízhez való adásával. Ha ezen alkalommal nem fogja a teljes lemezt felhasználni, kisebb mennyiséget is készíthet. Ilyenkor minden felhasznált 16 cellánként adjon 2,0 ml koncentrátumot 78 ml desztillált, vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 2-8 C-on 1 hétig stabil. 3. Készítsen 1:101 arányú hígítást minden páciensmintából 5 µl mintának 500 µl HRP mintahígítóhoz való adásával. A hígított mintákat az előkészítést követő 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA az OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontrollt, az OMP Plus ELISA magas pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 4. Az OMP Plus jelenlétének vagy hiányának tetszőleges egységekben történő meghatározásához a három kontroll mindegyikéhez két cella, az egyes páciensmintákhoz pedig egy, vagy két cella szükséges. Javasolt a minták két példányban történő vizsgálata. Az assay eljárás 1. AZ ASSAY ELKEZDÉSE ELŐTT MINDEN REAGENSNEK SZOBAHŐMÉRSÉKLETŰNEK (20-26 C) KELL LENNIE. Helyezze a kívánt számú mikrocellát/sávot a tartóba. Azonnal tegye vissza a nem használt sávokat a szárítószereket tartalmazó tasakba és gondosan zárja le azt, a vízpárával való érintkezés minimalizálása érdekében. 2. Adjon 100 µl előre hígított OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontrollt, az OMP Plus ELISA magas pozitív kontrollt, az ELISA negatív kontrollt és a hígított páciensmintákat a cellákba. Fedje a cellákat és inkubálja őket 30 percig szobahőmérsékleten, vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta hozzáadását követően kezdődik. 3

4 3. Mosási lépés: Gondosan szívja fel az egyes cellák tartalmát. Adjon µl hígított HRP mosópuffert az összes cellába, majd szívja le azok tartalmát. Ismételje meg ezt a lépést még kétszer, hogy összesen három mosási lépést hajtson végre. Fordítsa meg a lemezt és ütögesse nedvszívó anyaghoz, az utolsó mosás után visszamaradó folyadék eltávolításához. Az egyes mosási lépések után fontos a cellák teljes kiürítése. A felszívással kapcsolatban kövesse a minta hozzáadásához használt lépéseket. 4. Adjon minden egyes cellához 100 μl HRP IgA konjugátumot. A konjugátumot az üvegből a hagyományos aszeptikus körülmények fenntartásával és a megfelelő laboratóriumi technikák alkalmazásával kell kivenni. Csak az assay-hez szükséges mennyiségű konjugátumot vegyen ki az üvegből. A POTENCIÁLIS MIKROBÁS ÉS/VAGY KÉMIAI KONTAMINÁCIÓ ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TEGYE VISSZA A NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. A 2. lépéshez hasonlóan inkubálja a cellákat 30 percig. 5. Mosási lépés: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Adjon minden cellához 100 µl TMB kromogént és inkubálja a cellákat sötétben 30 percig, szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100 µl HRP Stop oldatot a cellákhoz. A HRP Stop oldat hozzáadása során alkalmazza a TMB kromogén kapcsán használt eljárást és időzítést. Az ujjával óvatosan ütögesse meg a lemezt, hogy alaposan összekeverje a cellák tartalmát. 8. A reakció megállítását követő egy órán belül olvassa le a cellák abszorbanciaértékeit (OD) 450 nmen. Ha bikromatikus mérésekre van szükség, referencia-hullámhosszként 620 nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. Minden egyes mintatételen OMP Plus ELISA alacsony pozitív, OMP Plus ELISA magas pozitív és ELISA negatív kontrollt kell futtatni, hogy meggyőződhessen arról, hogy minden reagens és folyamat megfelelően működik. 2. Jegyezze meg, hogy az OMP Plus ELISA alacsony pozitív, az OMP Plus ELISA magas pozitív és az ELISA negatív kontrollok előre hígított kontrollok, így nem alkalmasak a minták hígításával kapcsolatos módszerek ellenőrzésére. 3. A helyi, állami és/vagy szövetségi szabályozások vagy akkreditáló szervezetek irányelveinek vagy követelményeinek megfelelően további kontrollokat is vizsgálni lehet. További megfelelő kontrollszérumok hozhatók létre egy-egy résznek humán szérumminta-poolokból való kivételével és < -20 C-on történő tárolásával. 4. A teszteredmények érvényességéhez az alábbiakban felsorolt minden kritériumnak meg kell felelni. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni és az assay-t meg kell ismételni. a. Az előre hígított OMP Plus ELISA magas pozitív kontroll abszorbanciájának magasabbnak kell lennie, mint az előre hígított OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontroll abszorbanciája, amelynek magasabbnak kell lennie az előre hígított ELISA negatív kontroll abszorbanciájánál. b. Az előre hígított OMP Plus ELISA magas pozitív kontroll abszorbanciájának magasabbnak kell lennie, mint 1,0, míg az előre hígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem haladhatja meg a 0,2-t. c. Az OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontroll abszorbanciájának az ELISA negatív kontrollénak több mint kétszeresének, vagy 0,20-nál magasabbnak kell lennie. d. Az ELISA negatív kontroll és az OMP Plus ELISA magas pozitív kontroll a lényeges reagenshibák monitorizálására szolgál. Az OMP Plus ELISA magas pozitív kontroll nem biztosít pontosságot az assay határértékénél. e. A megfelelő minőség-ellenőrzési (QC) eljárásokkal kapcsolatos további útmutatókat illetően a felhasználónak a CLSI (NCCLS) C24-A2-es dokumentumából kell tájékozódnia. Az eredmények kiszámítása Először meg kell határozni a két példányban vizsgált minták átlagos OD-jét. Ezután ki lehet számítani az egyes minták reaktivitását úgy, hogy elosztjuk a minta átlagos OD-értékét az OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontroll átlagos OD-értékével. Az eredményt megszorozzuk a címkén található, az OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontrollhoz rendelt egységek számával, amely 25 egység. Minta OD Mintaérték = x OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontroll (egységek) OMP Plus ELISA alacsony pozitív kontroll OD-je (25 egység) A reaktivitást nem lineáris módon viszonyíthatjuk a jelenlévő antitest mennyiségéhez. A páciens antitestkoncentrációjában bekövetkező emelkedések és csökkenések a reaktivitás megfelelő emelkedésében és csökkenésében mutatkoznak meg, a változás azonban nem arányos (pl. az antitest-koncentráció megkétszereződése nem eredményez kétszeres reaktivitást). Ha a páciens antitest-koncentrációjának pontosabb kvantitatív meghatározására van szükség, a páciensminta hígítási sorát kell vizsgálni és az utolsó, az assay során még pozitívnak mért hígítást kell a páciens antitest-titereként feltüntetni. 4

5 Az eredmények értelmezése Az ELISA assay nagyon érzékeny a technikára és még kis különbségeket is észlelni képes a pácienspopulációkban. Az alábbiakban bemutatott értékek csak javasolt értékek. Minden laboratóriumnak meg kell határoznia a saját normál tartományát, a saját technikája, kontrolljai, berendezése és pácienspopulációja alapján, a saját kialakított eljárásainak megfelelően. Az alábbi táblázatnak megfelelően a mintákat negatívnak (negatív az OMP-ellenes IgA antitestre nézve), nem egyértelműnek vagy pozitívnak (OMP-ellenes IgA antitestek kimutathatók) lehet klasszifikálni. Egységek Negatív 0,0 20,0 Nem egyértelmű 20,1 24,9 Pozitív A pozitív eredmény az OMP-ellenes IgA antitestek jelenlétére utal és felveti a Crohn-betegség lehetőségét. 2. Azt a mintát, amely nem egyértelmű koncentrációban tartalmazza az OMP Plus antitesteket, nem lehet értékelni az antiteststátusz kérdésében. Ha az eredmények a tesztelés megismétlése után sem válnak egyértelművé, az eredményt nem egyértelműként kell feltüntetni és/vagy további mintát kell gyűjteni. 3. A negatív eredmény azt jelenti, hogy nincsenek jelen OMP-ellenes IgA antitestek, vagy azok az assay detektálási határa alatti mennyiségekben vannak jelen. 4. Az olyan minták esetében, amelyeknél az O.D.-érték a lemezleolvasó leolvasási tartományánál magasabbnak bizonyul, az O.D.-értéket megadhatjuk úgy, hogy a legnagyobb mérhetõ O.D.-nél nagyobb, osztva az alacsony pozitív OD-szer 25-tel; vagy ezeket a mintákat hígíthatjuk, újra vizsgálhatjuk, majd kiszámíthatjuk a kapott értéket. 5. Javasolt, hogy a laboratórium által közölt eredmények tartalmazzák a következőt: A következő eredményeket INOVA QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA segítségével nyertük. A más gyártók assay tesztjeivel kapott OMP-értékek ezekkel nem felcserélhetők. A közölt értékek nagyságát nem l ehet egy végpont titerrel korreláltatni." Az eljárás korlátai 1. Negatív OMP Plus eredmény nem zárja ki a Crohn-betegséget. 2. Negatív OMP Plus antitest eredmény nem zárja ki az OMP-ellenes antitestek jelenlétét, mert az antitest koncentrációja az assay detektálási határa alatt lehet. 3. Pozitív teszteredmény csak az OMP-ellenes antitest jelenlétét igazolja és nem feltétlenül jelenti Crohn-betegség fennállását. 4. A Crohn-betegség diagnózisának felállításához szükség van a páciens demográfiai adatainak, klinikai kórlefolyásának és egyéb diagnosztikai tesztjeinek összesített dokumentációjára. 5. A jelen assay teljesítményét nem határozták meg gyermekpopulációban. 6. Az assay teljesítményjellemzőit nem határozták meg a szérumtól eltérő minták esetében. 7. Irritábilis bél szindrómában szenvedő pácienseket nem vizsgáltak ezzel az assay-vel. Várható értékek A Crohn-betegség prevalenciájának becslései / tartományon belül széles határok között mozognak. A Crohn-betegség az észak-európai és észak-amerikai populációkban a leggyakoribb. Körülbelül egyenlõ mértékben érinti a férfiakat és a nõket, és a Crohn-betegségben szenvedõ egyének körülbelül 20%-ának egy vérrokona is az IBD valamely formájában szenved. A Crohn-betegség prevalenciája 3-8-szor nagyobb az ashkenazi zsidók körében, mint az átlagos populációban. Az elmúlt évtizedben számos közlemény tudósított a Crohn-betegség prevalenciájának növekedésérõl különbözõ földrajzi régiókban. 5, 6 Normál tartomány 500, nyilvánvalóan egészséges, 41 év átlagéletkorú (tartomány: éves kor) amerikai egyesült államokbeli (250 férfi és 250 nõ) személytõl levett mintákat vizsgáltak a QUANTA Lite TM OMP Plus ELISAval. A kapott mediánérték 12,5 egység volt. A határértéket 25 egységre állították be. Ez 94%-os (468/500) specificitást eredményezett. 5

6 Specifikus teljesítményjellemző Egy, 365 Crohn-betegekből származó mintát, 821 nem Crohn-betegekből, azon belül 234 colitis ulcerosás betegből és 587 egészséges kontrollból származó mintát tartalmazó, összesen 1186 szérumból álló panelt vizsgáltak meg mind a QUANTA Lite OMP Plus ELISA -val és az azt megalapozó QUANTA Lite ASCA IgG ELISA-val. A pácienspopulációra vonatkozó demográfiai információ nem állt rendelkezésre. A klinikai módszer-összehasonlításhoz használt CD-s, UC-s és normál minták európai és kanadai eredetűek voltak. A megalapozó berendezéssel való összehasonlítás QUANTA Lite ASCA IgG ELISA Poz Neg Összes Poz QUANTA Lite Neg OMP Plus ELISA Összes A nem egyértelmű eredményeket negatívnak (vagyis nem pozitívnak számolták) Pozitív százalékos egyezés: 36,8% (117/318) Negatív százalékos egyezés: 90,4% (785/868) Összesített egyezés 76,1% ( /1186) Klinikai szenzitivitás és specificitás Egy, 365 Crohn-betegekből származó mintát, 821 nem Crohn-betegekből (azon belül 234 colitis ulcerosás betegből és 587 egészséges kontrollból) származó mintát tartalmazó, összesen 1186 szérumból álló panelt vizsgáltak meg mind a QUANTA Lite OMP Plus ELISA -val, mind QUANTA Lite TM ASCA IgG és ASCA IgA ELISA készletekkel. A Crohn-betegekből és nem Crohn-betegekből (colitis ulcerosás betegekből és normál kontrollokból) származó minták elkülönítése Crohnbetegsébetegség Nem Crohn- Összes N =1186 QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA Poz Neg Összes A nem egyértelmű eredményeket negatívnak (vagyis nem pozitívnak számolták) Klinikai szenzitivitás: 37,5% (137/365) (95%-os konfidencia intervallum, 0,325-0,427) Klinikai specificitás: 92,3% (758/821) (95%-os konfidencia intervallum, 0,903-0,941) A Crohn-betegekből és colitis ulcerosás betegekből származó minták elkülönítése Crohnbetegség Colitis ulcerosa Összes N =599 QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA Poz Neg Összes A nem egyértelmű eredményeket negatívnak (vagyis nem pozitívnak számolták) Klinikai szenzitivitás: 37,5% (137/365) (95%-os konfidencia intervallum, 0,325-0,427) Klinikai specificitás: 88,9% (208/234) (95%-os konfidencia intervallum, 0,841-0,926) Az OMP Plus IgA, az ASCA IgG és az ASCA IgA eredmények felhasználásával kiderült, hogy a mind a három markerre pozitív (háromszorosan pozitív) eredmény 25,5%-os (93/365) szenzitivitással, de 99,5%-os (817/821) specificitással járt együtt, így értékes segítséget nyújthat a Crohn-betegség kizárásában". Legalább 1 marker pozitív Legalább 2 marker pozitív 3 marker pozitív Szenzitivitás Specificitás Szenzitivitás Specificitás Szenzitivitás Specificitás 72,1% (263/365) 79,2% (652/821) 46% (168/365) 96,3% (791/821) 25,5% (93/365) 99,5% (817/821) 6

7 Keresztreaktivitás Az assay specificitásának vizsgálatához 36, különbözõ autoimmun vagy fertõzõ betegségben szenvedõ páciens szérumát tesztelték a QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA-val. A tesztelt szérumok pozitívak voltak a betegségekhez kapcsolódó antitestekre nézve, beleértve 8 rheumatoid arthritis, 2 szolubilis májantigénellenes (SLA), 2 máj-vese mikroszomális (LKM), 2 kromatinellenes, 2 Jo-1-ellenes, 2 centromer-ellenes, 1 SS-A-ellenes, 2 SS-B-ellenes antitestet, valamint 2 antimitokondriális antitestet (AMA), 2 szöveti transzglutamináz (ttg)-ellenes, 1 Scl-10-ellenes, 1 RNP-ellenes, 3 glomeruláris bazálmembrán (GBM)- ellenes, 2 citomegalovírus (CMV), 2 rubeola vírus és 2 herpes simplex vírus (HSV) antitestet. Egyetlen mintát sem találtak pozitívnak és csupán egyetlen minta (egy SLA-ra pozitív autoimmun hepatitises páciens mintája) adott 22,2 egységes, nem egyértelmû eredményt az OMP Plus ELISA-val. További tesztelés során kiderült, hogy ez a minta mérsékelten pozitív volt ASCA IgG-re nézve (76,1 egység), míg az ASCA IgA antitesteket nem egyértelmû mennyiségben tartalmazta. 226, coeliakiában szenvedõ páciens szérumait vizsgálták meg az OMP Plus IgA ELISA-val, amelyek 27%-a bizonyult pozitívnak. Ugyanezen csoport 27%-a volt pozitív ASCA IgA, 31%-a pedig ASCA IgG antitestekre. A coeliakiában szenvedõ páciensek közül 14 (6,2%) volt háromszorosan pozitív (OMP Plus IgA, ASCA IgG és ASCA IgA). Pontosság és megismételhetőség A QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA assay-n belüli teljesítményét 8 minta és a magas pozitív kontroll (HPC) készlet, egyenként összesen 8 alkalommal történõ tesztelésével határozták meg. A QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA assay-n belüli teljesítménye Spec. A Spec. B Spec. C Spec. D Spec. E Spec. F Spec. G Spec. H Az egységek átlagértékei 46,2 26,9, 45,5 26,3 41,8 24,5 23,9 21,8 SD 1,17 0,78 2,91 0,72 0,93 0,86 0,83 0,46 CV % 2,5 2,9 6,4 2,8 2,2 3,5 3,5 2,1 Az assay-k közötti teljesítményt két példányban 8 minta és a magas pozitív kontroll (HPC) készlet, 3 napon keresztül napi kétszeri (egyszer reggeli és egyszer délutáni) tesztelésével határozták meg. A QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA assay-k közötti teljesítménye HPC Spec. 1 Spec. 2 Spec. 3 Spec. 4 Spec. 5 Spec. 6 Spec. 7 Spec. 8 Az egységek átlagértékei 69,8 50,0 26,6 54,1 29,2 46,2 27,3 24,7 23,5 SD 2,35 0,74 0,89 2,23 1,07 1,63 1,14 1,07 0,89 CV % 3,4 1,5 3,4 4,1 3,7 3,5 4,2 4,3 3,8 Hivatkozások 1. Merck Manual of Diagnosis and Therapy Whitehouse Station, NJ. ( 2. National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK). Crohn s Disease. NIH Publication No , ( 3. Coche, J.-C. & Colombel, J.-F. Heterogeneity of Inflammatory Bowel Disease: Clinical Subgroups of Patients. Res. Clin. Forums 20, (1998). 4. Bernstein, C. N., Blanchard, J. F., Rawsthorne, P. & Wajda, A. Epidemiology of Crohn's disease and ulcerative colitis in a central Canadian province: a population-based study. Am J Epidemiol 149, (1999). 5. Loftus, E. V., Jr. et al. Crohn's disease in Olmsted County, Minnesota, : incidence, prevalence, and survival. Gastroenterology 114, (1998). 6. Niv, Y., Abuksis, G. & Fraser, G. M. Epidemiology of Crohn's disease in Israel: a survey of Israeli kibbutz settlements. Am J Gastroenterol 94, (1999). 7. Joossens, S. et al. The value of serologic markers in indeterminate colitis: a prospective follow-up study. Gastroenterology 122, (2002). 8. Rutgeerts, P. & Vermeire, S. Clinical value of the detection of antibodies in the serum for diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 115, (1998). 9. Norman, G. Anti- Saccharomyces cerevisiae antibodies in inflammatory bowel disease. Clin Applied Immunol Rev 2, (2001). 10. Sendid, B. et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies in familial Crohn's disease. Am J Gastroenterol 93, (1998). 11. Landers, C. J. et al. Selected loss of tolerance evidenced by Crohn's disease-associated immune responses to auto- and microbial antigens. Gastroenterology 123, (2002). 12. Sutton, C. L. et al. Identification of a novel bacterial sequence associated with Crohn's disease. Gastroenterology 119, (2000). 13. Papp, M., et al. New Serological Markers for Inflammatory Bowel Disease are Associated with Earlier Age at Onset, Complicated Disease Behavior, Risk for Surgery, and NOD2/CARD15 Genotype in a Hungarian IBD Cohort. Am J. Gastroenterol 102:1-17 (2007). 7

8 14 Ferrante, M. et al. New Serological Markers in inflammatory Bowel Disease are associated with complicated disease behaviour. Gut 56: (2007). 15. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN November 2008 Revision 0 8