QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás The QUANTA Lite TM CCP3.1 IgG/IgA ELISA egy enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat (ELISA), amely citrált,- vagy EDTA szérumban lévő IgG és IgA anti-ccp3 (ciklikus citrullinált peptid 3) antitestek félkvantitatív kimutatására szolgál humán szérumban. Ezen antitestek jelenléte, a klinikai eredményekkel és más laboratóriumi tesztekkel együtt, felhasználható a rheumatoid arthritis (RA) diagnosztizálására, beleértve azon RA-t is melyet a tünetek megjelenését követő 2 éven belül diagnosztizáltak. A teszt összegzése és magyarázata A rheumatoid arthritis (RA) a leggyakrabban előforduló szisztémás autoimmun betegségek egyike, amely a világ népességének mintegy 0,5%-át érinti. 1 A diagnózis elsősorban a betegség klinikai megnyilvánulásaitól függ. A közelmúltig egyetlen rutinszerűen használt szerológiai teszt mutatta ki rheumatoid faktorok (RF) jelenlétét, mely ezen páciensek mintegy százalékánál volt észlelhető. 1,2 Találtak azonban RF pozitivitást fertőzésekben, más autoimmun betegségekben, és ritkán egészséges személyekben is. 1,2 A betegség eredményes gondozása szempontjából fontos a betegséget minél korábbi stádiumban diagnosztizálni, és az RA betegek kezelését a lehető legkorábban elkezdeni. 3 Évek óta ismeretes, hogy anti-perinuclearis autoantitestek, más néven anti-keratin autoantitestek találhatók az RA betegekben. 4 Újabban megfigyelték, hogy ezek az autoantitestek egy olyan epitópot ismernek fel, amelyik az arginin deiminált formáját, a citrullint tartalmazza. 4,5 Egy citrullint tartalmazó, szintetikus ciklikus peptid, amit CCP IgG (ciklikus citrullinált peptid) névvel jelölnek, jobbnak bizonyult a RA betegeknek más betegektől való megkülönböztetése szempontjából, mint akár a perinuclearis autoantitestek vizsgálata, akár a rheumatoid faktor kimutatása. 6,7 A közölt irodalom egyik összefoglalása 8 szerint az RA-betegek 68%-a volt anti-ccp pozitív, míg a nem RA-betegeknek átlagosan 5%-a volt pozitív. Egy ELISA teszt, amely az eredetileg leírt CCP szekvenciával 5 készült, alacsony érzékenysége nem került széles körű forgalmazásra. Ugyanakkor a második generációs anti-ccp teszt (melyet egyes vállalatok CCP2-nak hívnak) széles körben beszerezhető, és az eredeti peptidhez viszonyítva kiváló teljesítményt mutat. 9 Az INOVA cég CCP IgG ELISA-nak nevezte el második generációs tesztjét. Fontos megjegyezni, hogy a korai RA 8 betegekben talált anti-ccp néha jobban jelzi előre az RA kifejlődését, mint az rheumatoid faktorok. 4,7 Az a tény, hogy bizonyos RA betegek, akik anti-ccp2-vel szemben negatívnak bizonyulnak, más citrullinált fehérjékkel 6,7 szemben reaktívak, felveti annak a lehetőségét, hogy léteznek olyan epitópok, melyeket a második generációs CCP antigén szekvenciája nem tartalmaz ben váltak elérhetővé olyan kitek, melyek harmadik generációs antigént (CCP3) használnak. Ezek a harmadik generációs peptiddel készült kitek, a CCP2 antigént használó kitekhez képest kb. 5%-kal érzékenyebbek, miközben specificitásuk megegyezik. 10 Az antigén, amit a QUANTA Lite TM CCP 3.1 kitben található, az újabb, harmadik generációs peptidet tartalmazza. Ezen felül ez a kit egy olyan konjugátumot tartalmaz, ami a szokásos IgG antitesteken kívül az IgA antitesteket is képes kimutatni. Az érzékenysége nagyobb, mint a CCP 3 kitnek azáltal, hogy bizonyos RA betegek rendelkeznek CCP 3 elleni IgA antitestekkel, miközben IgG antitest hiányuk van. 11 A CCP 3.1 ELISA teszt további fejlesztése a színkódolt, egymástól különválasztható cellák alkalmazása, valamint annak lehetősége, hogy szérum vagy plazma betegmintát is lehet használni a méréshez. A módszer elve A QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA tesztben alkalmazott antigén egy szintetikus, ciklikus citrullinált peptid, amiről megállapították, hogy nagy érzékenységgel és specificitással rendelkezik az RA betegekben lévő antitestek kimutatása során. Ezt az antigént egy mikrotiter lemez felületéhez kötötték. Az előzetesen hígított kontrollmintákat és a betegek hígított mintáit eltérő cellákba adagolják, lehetővé téve bármely jelenlévő CCP IgG és/vagy IgA antitest immobilizált antigénhez kötődését. A nem kötődött mintát lemossák és mindegyik cellához enzimjelölt anti-humán IgG/IgA konjugátumot adnak. Egy második inkubáció lehetővé teszi, hogy az enzimjelölt anti-humán IgA és/vagy IgG minden olyan, a beteg mintájából származó antitesthez hozzákötődjön, amely korábban a cellához kötődött. Az összes megkötetlen enzimjelölt anti-humán IgG/IgA lemosása után a fennmaradó enzimaktivitást kromogén szubsztrát hozzáadásával, és a kialakuló szín intenzitásának mérésével határozzák meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a betegminták celláiban kialakult szín intenzitását mérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez tisztított szintetikus CCP antigénnel bevonva (12-1 x 8 cella), tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva 2. ELISA negatív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, CCP-hez kötődő antitestek nélkül, előhígítva, 1,2 ml 3. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint CCP-hez kötődő humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml 4. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll/ A kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint CCP-hez kötődő humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml 1

2 5. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA B kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint CCP-hez kötődő humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml 6. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA C kalibrátor, 1 ampulla, tartósítószert, valamint CCP-hez kötődő humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml 7. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA D kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint CCP-hez kötődő humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml 8. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA E kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint CCP-hez kötődő humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml 9. HRP mintahígító, 1 üveg rózsaszín, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot, Tween 20-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 50 ml 10. Nagy specificitású mosókoncentrátum, 1 üveg, 10-szeres koncentrátum - vöröses színű, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot és Tween 20-at, 100 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók 11. HRP CCP 3.1 IgG/IgA konjugátum, (kecske), anti-humán IgG/IgA, 1 üveg világossárgás színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10 ml 12. TMB kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10 ml 13. HRP stop oldat, 0,344 M kénsav, 1 üveg színtelen, 10 ml Figyelmeztetések 1. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0,02% kloramfenikol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV,HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA erősen pozitív kontroll/kalibrátorok és az ELISA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából, öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekhez vezethet. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA cellákból nem megfelelő pontosságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. A teszt adaptációja automatikus mintakezelő rendszerek, vagy más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja a manuális módszerekhez képest. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az alkalmazott automatizált rendszer validálása, annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt teljesítményét több tényező befolyásolhatja. Ilyen a reagensek kezdeti hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványok az ELISA lemez celláiból történő eltávolításának alapossága, a kiértékeléshez használt fotométer, illetve az inkubációs idők hossza. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. A protokoll szigorú betartása javasolt. 7. A mikrotiter csöveket és a deszikkánst tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját, és a teszt pontosságának romlását okozza. 8. A HRP konjugátum ugyanazon csövének bizonyos idő elteltével két- vagy többszöri használata, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása, az ilyen problémák megelőzése érdekében. 2

3 9. Az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt a HRP konjugátum kémiailag szennyeződhet. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítőszerek, alkohol vagy detergensek maradványai idővel a HRP konjugátum lebomlását okozzák. Kémiai tisztítószerek/fertőtlenítőszerek használata után a készülékeket és az eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét 2-8 C között tárolja. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csövek a deszikkánssal együtt a fóliatasakot biztonságosan lezárva 2-8 C között tárolandók. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig stabil. A minta vétele és kezelése Ezt az eljárást egy szérummintával, egy citrált plazmával, vagy egy EDTA plazmával kell elvégezni, mivel ezek a minták azonos eredményeket adtak. Lítium és heparin plazma nem használható, mivel ezek az szérumtól eltérő eredményeket adhatnak. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. A minta levétele után a szérumot el kell választani az alvadéktól, illetve a plazmát a lent ismertetett módon kell tárolni. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 18 A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 cella), tartókerettel 1 1,2 ml előhígított ELISA negatív kontroll (ELISA Negative Control) 1 1,2 ml előhígított CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll (CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Low Positive) 1 1,2 ml előhígított CCP 3.1 IgG/IgA ELISA erősen pozitív kontroll/ A kalibrátor (CCP 3.1 IgG/IgA ELISA High Positive/Calibrator A) 1 1,2 ml előhígított CCP 3.1 IgG/IgA ELISA B kalibrátor (CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Calibrator B) 1 1,2 ml előhígított CCP 3.1 IgG/IgA ELISA C kalibrátor (CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Calibrator C) 1 1,2 ml előhígított CCP 3.1 IgG/IgA ELISA D kalibrátor (CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Calibrator D) 1 1,2 ml előhígított CCP 3.1 IgG/IgA ELISA E kalibrátor (CCP 3.1 IgG/IgA ELISA Calibrator E) 1 50 ml HRP mintahígító (HRP Sample Diluent) ml Nagy specificitású mosókoncentrátum (High Specificity Wash Concentrate), 10x-es koncentráció 1 10 ml HRP CCP 3.1 IgG/IgA konjugátum (HRP CCP 3.1 IgG/IgA Conjugate), (kecske), antihumán IgG/IgA 1 10 ml TMB kromogén (TMB Chromogen) 1 10 ml HRP stop (HRP Stop Solution) oldat 0,344 M kénsav További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mikropipetták 5, 100, , és 500 µl-es mérésekhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4 ml térfogattal Desztillált vagy ioncserélt víz 1 l-es edény a nagy specificitású mosókoncentrátum hígításához Olyan mikrotiter lemez leolvasó, ami képes OD mérésre, 450 nm-en (illetve 620nm-en a két hullámhosszon történő méréshez) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a nagy specificitású mosókoncentrátumot 1:10 arányban, úgy, hogy a nagy specificitású mosókoncentrátumos üveg tartalmát 900 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. Ha nem egyszerre kerül a teljes lemez felhasználásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó cellánként adjon 10,0 ml koncentrátumot 90 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez. A hígított puffer 2 8 C között tárolva 1 hétig stabil. 3. Készítsen minden egyes betegmintából 1:101 arányú hígítást, a következő módon: adjon 5 µl mintát 500 µl HRP mintahígítóhoz. A hígított mintákat az elkészítésüket követő 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA erősen pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 3

4 4. Az anti-ccp 3.1 antitestek jelenlétének vagy hiányának tetszőleges egységekben való meghatározásához használjon mindhárom kontroll méréséhez két-két cellát, és minden betegminta méréséhez egy vagy két cellát. A betegmintákból párhuzamos minták (duplikátumok) meghatározását javasoljuk. 5. Ha mennyiségi meghatározásra van szükség, ez egy ötpontos kalibrációs görbe használatával elvégezhető. Az ötpontos kalibrációs görbe A-E pontjainak felvételéhez használja, közvetlenül az ampullákból az ELŐHÍGÍTOTT CCP 3.1 A - E kalibrátorokat. Az ötpontos kalibrációs görbe értékei a következők: pont Egység A Előhígított CCP 3.1 IgG/IgA "A kalibrátor 250,0 B Előhígított CCP 3.1 IgG/IgA "B kalibrátor 125,0 C Előhígított CCP 3.1 IgG/IgA "C kalibrátor 62,5 D Előhígított CCP 3.1 IgG/IgA "D kalibrátor 31,25 E Előhígított CCP 3.1 IgG/IgA "E kalibrátor 15,62 A teszt kivitelezése 1. A TESZT MEGKEZDÉSE ELŐTT VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBAHŐMÉRSÉKLETET (20-26 C). Helyezze a szükséges számú cellát/csövet a keretbe. A fel nem használt csöveket haladéktalanul tegye vissza a deszikkánst tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a cellák minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon μl-t az előhígított CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA erősen pozitív kontrollból, (ha szükséges a B - E kalibrátorokból) az ELISA negatív kontrollból és a hígított betegmintákból a mérőedénykékbe. Fedje be és 30 percig szobahőmérsékleten inkubálja a lemezeket, egy vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta adagolása után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes cella tartalmát. Adjon µl hígított HRP mosó puffert minden egyes cellához, majd ezt is szívassa le. Ismételje meg ezt az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen, finoman ütögetve tökéletesen távolítsa el az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait a cellákból. Nagyon fontos, hogy a cellák minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. Leszíváskor a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet tartsa be. 4. Adjon 100µlHRP CCP 3.1 IgG/IgA konjugátumot minden egyes cellához. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között, és a helyes laboratóriumi eljárásoknak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a mérés elvégzéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig úgy, mint a 2. lépésben. 5. Mosás: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Adjon 100 µl TMB kromogént minden egyes cellába, és inkubálja sötét helyen, 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100 µl HRP stop oldatot minden egyes cellába. A HRP stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt az időzítést és sorrendet tartsa, amit a TMB kromogén bemérésekor alkalmazott. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, hogy a cellák tartalma alaposan összekeveredjen. 8. Olvassa le minden egyes cella abszorbancia (OD) értékét 450 nm-en, a reakció leállítását követő egy órán belül. Ha bikromatikus mérést kíván végezni, referencia hullámhossznak használja a 620 nm-t Minőség-ellenőrzés 1. Futtassa együtt a CCP 3.1 IgG/IgA II ELISA mérsékelten pozitív, a CCP 3.1 IgG/IgA II ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontrollt is minden egyes betegminta sorozattal, annak ellenőrizésére, hogy az összes reagens és a végrehajtása is megfelelően működik. 2. Ne feledje, hogy mivel a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív, a CCP 3.1 IgG/IgA II ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll is előhígított, ezért egyikük sem kontrollálja a minta hígításával kapcsolatos lépéseket. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelő módon. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és -20 C alatt történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit valósnak tekinthessük, valamennyi alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított CCP 3.1 IgG/IgA II ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell legyen, mint az előhígított CCP 3.1 IgG/IgA II ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, ami nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított CCP 3.1 IgG/IgA II ELISA erősen pozitív kontroll OD-ja 1,0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll OD-ja nem lehet nagyobb 0,2-nél. 4

5 c. A CCP 3.1 II ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy nagyobbnak kell lennie mint 0,25. d. Az ELISA negatív kontroll és a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek alapvető hibájának jelzésére szolgál. A CCP 3.1 IgG/IgA ELISA erősen pozitív kontroll nem garantálja a precizitást a teszt diagnosztikai küszöbértékének közelében. e. A felhasználó, megfelelő minőség-ellenőrzési eljárásokra vonatkozó további információkat a CLSI (NCCLS) Document C24-A3 -ban találhat. A szemikvantitatív eredmények kiszámolása arány módszer Először határozza meg az egyes párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Majd az így kapott eredményt megszorozza a CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén feltüntetett egységek számával. Minta OD Minta értéke = x CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív (egységek) CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mérsékelten pozitív OD (egységek) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). A számítás választható módszere Szemikvantitatív eredmények kalibrációs görbe használatával Az eredmények kiszámítása kalibrációs görbével 1. Határozza meg a leolvasott párhuzamosok középértékét. 2. Ábrázolja a kalibrációs görbén a minták átlagos abszorbanciáit (OD) az egységekben megadott értékeik függvényében. Az ábrázoláshoz lin/lin Cubic Spline -t (harmadfokú polinom) vagy pontról-pontra illesztett görbét használjon. 3. Határozza meg az ismeretlen anti-ccp 3.1 koncentráció mértékét egységekben úgy, hogy az "Y" tengelyen lévő abszorbancia értékhez tartozó koncentrációt az "X" tengelyről leolvassa. Számítsa ki az ismeretlen egységet. 4. MEGJEGYZÉS: Az arány módszerrel számított értékek különbözni fognak a kalibrációs görbével számított értékektől. A magas értékek jobban el fognak térni, mint az alacsonyak. A CCP 3.1 IgG/IgA erősen pozitív kontroll az arány módszerrel nem fog 250 egységes értéket adni. Az eredmények értelmezése Az ELISA teszt a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, valamint képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alább mutatott értékek csak javaslatok. Minden egyes laboratóriumnak meg kell határoznia a saját referencia tartományait, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a saját eljárásaiknak megfelelően. A minta besorolása az alábbi táblázat szerint lehet: negatív, gyengén pozitív, mérsékelten vagy erősen pozitív. Egységek Negatív <20 Gyengén pozitív Közepesen pozitív Erősen pozitív A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában IgG és/vagy IgA anti-ccp 3 antitestek vannak, és felveti az RA fennállásának lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincsenek CCP 3 antitestjei, vagy azok koncentrációja nem éri el a teszt diagnosztikai küszöbértékét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredményeket az INOVA QUANTA Lite TM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA használatával kaptuk. Más gyártók tesztjével kapott Anti-CCP értékek ettől eltérőek lehetnek, ezek fel nem cserélhetőek. A közölt IgG vagy IgA értékek nagysága nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. A beteg mintájában jelenlévő immunkomplexek vagy immunoglobulin aggregátumok a nemspecifikus kötődés szintjének emelkedését okozhatják, és téves pozitív eredményt adhatnak a vizsgálatban. 2. Nem minden RA beteg pozitív anti-ccp tekintetében. 3. Ezen teszt eredményeit a klinikai adatok, és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 5

6 4. A teszt működési jellemzői szérumtól, EDTA plazmától vagy citrát plazmától eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. 5. Az anti-ccp 3 diagnosztikai értéke juvenilis rheumatoid arthritis betegek esetére nincs meghatározva. 6. Zavaró anyagok: Magas hemoglobin-, bilirubin-, koleszterin- vagy trigliceridszintek nem okoznak téves pozitív vagy téves negatív eredményeket. A klinikai minták várható értékei A QUANTA Lite TM CCP3.1 IgG/IgA ELISA teszt CCP3 elleni IgG/IgA antitest kimutatási képességét egy IgG anti-ccp2 antitestet mérő ELISA teszten mért 942 minta eredményeinek összehasonlításával nyerték. Köztük volt 495 olyan beteg, akiknél 186 esetben belső, 309 esetben pedig külső klinikai vizsgálatok során RA-t diagnosztizáltak. Ezen felül 275 random kiválasztott véradó mintáját is tesztelték. Azon 272 minta között, ahol az életkor és a nem ismert volt, 97 nő volt, az átlag életkor pedig 42,2 év volt. A beteg kontrollcsoportot, ami 74 egyéb reumatikus betegségben (ORD) szenvedő egyént úgy mint szisztémás lupus erythematosus (34), Sjögren kór (16) és scleroderma (24), valamint 98 fertőző betegségek (ID), úgy mint hepatitis C (58), herpes simplex vírus (15), cytomegalo vírus (14), toxoplasmosis (6) and rubeola (5) elleni antitesteket tartalmazó mintákat, egy nagy, belső vizsgálatban tesztelték. Klinikai érzékenység és specificitás Valamennyi klinikai vizsgálatunk eredményét a következő táblázat foglalja össze. Minta N=942 CCP3.1 ELISA CCP ELISA RA (összes N=495) RA- két éven belül (=86) Összes kontroll (N=447) Véradó (N=275) ORD (N=74) Fertőző betegség (N=98) Klinikai érzékenység [95% konfidencia intervallum (CI)] = CCP3.1 = 70,3% (66-74%) CCP = 64,6% (60-69%) RA-ban, két éven belül = CCP3.1 = 64,0% (52-74%) CCP = 54,7% (43-65%) Klinikai specificitás (95% CI) = CCP3.1 = 97,8% (96-99%) CCP = 98,2% (97-99%) A módszerek összevetése N=942 CCP3.1 IgG/IgA ELISA CCP IgG ELISA Össze Egyezés (95% CI) s Pozitív Negatív Pozitív * 358 Poz. % Megegy.=97,6% (95,3-98,9%) Negatív 8** Neg. % Megegy.=93,8% (91,6-95,6%) Összes Össz. % Megegy=95,1% * Ezek közül 33 diagnosztizált RA beteg. ** Ezek közül 5 diagnosztizált RA beteg. Kereszt-reaktivitás A más autoantitestekkel lehetséges kereszt-reaktivitás miatt várható problémák felmérése céljából, 16, egyéb autoantitestet nagy mennyiségben tartalmazó mintát vizsgáltak QUANTA Lite CCP3.1 ELISA kitel. Ez a csoport 2-2 olyan mintát tartalmazott melyek SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P, illetve dsdns-sel reagáltak. Anti-CCP3.1 tekintetében valamennyi minta negatív volt. A fent említett vizsgálat azt mutatja, hogy a CCP3.1 antigén és különböző egyéb autoantitestek között nincs szignifikáns kereszt-reaktivitás. Pontosság és reprodukálhatóság Ez egyes futások közötti eltérés vizsgálatát negatív, mérsékelten pozitív és erősen pozitív minták párhuzamosainak 6 különálló teszten, 5 különböző napon történt futtatásával mérték. A futásokon belüli eltérés méréséhez 9 mintát, 9 vagy 10 alkalommal futtattak ugyanazon az ELISA mikrotiter lemezen. A reprezentatív eredmények az alábbi táblázatban láthatók. Sorotatok közötti eltérés Negatív 1 Mérsékelt 1 Mérsékelt 2 Erős 1 1 pont* 5 pont** 1 pont 5 pont 1 pont 5 pont 1 pont 5 pont Átl. 6 E 4 E 22 E 23 E 28 E 30 E 69 E 85 E SD 0,4 0,5 0,7 0,6 0,8 1,2 1,7 1,2 CV% 8% 11% 3% 3% 3% 4% 2% 1% 6

7 Sorozaton belüli eltérés Negatív 1 Mérsékelt 1 Mérsékelt 2 Erős 1 1 pont 5 pont 1 pont 5 pont 1 pont 5 pont 1 pont 5 pont Átl. 4 E 2 E 22 E 24 E 26 E 30 E 68 E 81 E SD 0,2 0,2 0,9 1,1 0,9 1,0 1,9 3,2 CV% 4% 13% 4% 5% 3% 3% 3% 4% *Arány módszerrel kapott eredmények **Kalibrációs görbével kapott eredmények Hivatkozások 1. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, NR Rose et al., eds, American Society for Microbiology Press, (2002). 2. Borretzen M et al.: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Shoenfeld Y, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 3. Kim JK and Weisman MH: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: (2000). 4. Vossenaar ER and Van Venrooj WJ: Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis. Clin Applied Immunol Rev 4: (2004). 5. Schellekens GA et al.: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 101: (1998). 6. Vittecoq O et al.: Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using citrullinated and non-citrullinated recombinant proteins as antigens are highly diagnostic for rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 135: (2004). 7. Saraux A et al.: Value of antibodies to citrulline-containing peptides for diagnosing early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 30: (2003). 8. Avovac J et al: Diagnostic and predictive value of anti-cycllic citrullinated protien antibodies in rheumatiod arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 65: (2006). 9. van Gaalen FA et al.: A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the firstand second anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (CCP1 and CCP2) tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 64: (2005) 10. Mittermayer S et al.: A comparison of the frequency of autoantibodies to cyclic citrullinated peptides using a third generation CCP assay (CCP3) in systemic sclerosis, primary biliary cirrhosis and rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol June 15, e-pub ahead of print (2007). 11. Vieira LEA et al: Rheumatoid arthritis diagnosis: a comparative study of second and third generation anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) ELISAs. Arthritis Rheum 56: S724 (2007). 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN January 2009 Revision 0 8