QUANTA Lite C1q CIC ELISA In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

Átírás

1 QUANTA Lite C1q CIC ELISA In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás Ezt a tesztet a humán vérben jelenlévő, a C1q-t megkötő keringő immunkomplexek (CIC) in vitro kimutatására tervezték. Alkalmas a különféle autoimmun, illetve más, keringő immunkomplexszekkel kapcsolatos betegségekben szenvedők szérum CIC szintjeinek meghatározására, illetve egyéb klinikai eredmények segítésére. A kit elegendő anyagot tartalmaz maximum 41 minta mérésére duplikátumban, vagy 89 minta egyszeri mérésére, kalibrációs görbe felvételével valamint pozitív és negatív kontrollok egyidejű meghatározásával. A teszt összegzése és magyarázata Az antigén-antitest kölcsönhatás immunkomplexek kialakulását eredményezhetik. Ez része a szervezet normális és folytonos immuntevékenységének. Az antigének lehetnek a szövetekben rögzítetten, illetve a plazmában vagy más testnedvekben szabadon, keringő immunkomplexeket alkotva. Normális esetben a keringő immunkomplexeket a reticuloendoteriális rendszer gond nélkül eltávolítja. Azonban az immunkomplexek az érrendszerben történő nagymértékű lerakódása, az azt követő a gyulladásos folyamatok, mint például a komplement kaszkád aktiválása révén szövetkárosodással járó immunkomplex betegségekhez vezethet. Ezen komplexek sorsa több tényezőtől függ, többek között az antigén és az antitest osztályától, a komplex méretétől, a termelődésük mértékétől és a fagocitarendszer működésének épségétől. A keringő immunkomplexek számos betegségben játszott patogén szerepük miatt speciális módszereket fejlesztettek kimutatásukra. Ezek a módszerek kihasználják a keringő immunkomplexek speciális fizikai-kémiai tulajdonságait, illetve a sejtfelszínekhez (pl. a Raji sejtek) és trombocitákhoz vagy molekulákhoz, mint például a C1q 1, 2, 3 -hoz való kötődési képességüket. A C1q-t kötő keringő immunkomplexek szérumkoncentrációjának ELISA-val történő mérése prognosztikai fontossággal bír 5. Különösen alkalmas a szisztémás lupus erythematosus-ban szenvedő betegek CIC szintjének figyelemmel kísérésére, akiknél a CIC szint a betegség aktivitásának függvényében változik, illetve csökkent komplement válasszal bírnak 6. A módszer elve A mikrotiter lemez mélyedései humán C1q-val vannak bevonva. A kalibrátorokat, a kontrollokat és a hígított betegmintákat a mélyedésekbe pipettázzuk. Az első inkubáció során a C1q-kötő immunkomplexek a C1q-hoz kötődnek. Miután a nem kötődött fehérjéket mosással teljesen eltávolítottuk, peroxidázzal jelölt, tisztított kecske anti-humán IgG konjugátumot adagolunk a lyukakba. A konjugátum az előző fázisban megkötött immunkomplexhez kötődik, majd a konjugátum feleslegét egy újabb mosással eltávolítjuk. A megkötődött konjugátumot 3,3,5,5 -tetrametil-benzidin (TMB) szubsztrát segítségével tesszük láthatóvá, ami kék reakcióterméket ad. A szín intenzitása arányos a mintában lévő CIC koncentrációjával. A reakció leállítása céljából minden egyes lyukba kénsavat adunk. Ez egy sárga színű végterméket eredményez, mely 450 nm-en mérhető. A minta CIC koncentrációja leolvasható a kalibrációs görbéről, a kapott eredmény aggregált humán IgG ekvivalens per ml (μg Eq/ml) egységben van kifejezve. Reagensek 1. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez C1q antigénnel bevonva (12-1 x 8 cella) tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA negatív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, C1q-hoz kötődő antitestek nélkül, előhígítva, 1,2 ml. 3. C1q CIC ELISA A kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint C1q-hoz kötődő, aggregált humán IgG 4. C1q CIC ELISA B kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint C1q-hoz kötődő, aggregált humán IgG 5. C1q CIC ELISA C kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint C1q-hoz kötődő, aggregált humán IgG 6. C1q CIC ELISA D kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint C1q-hoz kötődő, aggregált humán IgG 7. C1q CIC ELISA E kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint C1q-hoz kötődő, aggregált humán IgG 8. C1q pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint C1q-hoz kötődő, aggregált humán IgG tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml. 9. III típusú mintahígító, 2 üveg sárga, tartalmaz: Tween 20-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 50 ml. A hígítási utasítás a Módszerek c. fejezetben található. 10. HRP mosókoncentrátum, 1 üveg, 40-szeres koncentrátum - vöröses színű, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot, Tween 20-at és tartósító anyagot, 25 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók. 11. HRP C1q CIC IgG konjugátum, 1 üveg kékes színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagot tartalmaz, 10 ml. 12. TMB kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10 ml. 13. HRP stop oldat, 0,344 M kénsav, 1 üveg színtelen, 10 ml. Figyelmeztetések 1. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0,02% kloramfenikol) tartalmaz a mintahígító, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. A mintahígító Proclin 150-et tartalmaz. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását, illetve a bőrre, szembe jutását. 1

2 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV,HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért a C1q CIC pozitív kontroll, a C1q CIC A E kalibrátorok potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP C1q CIC IgG konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását, illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicseppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A terméket kizárólag megfelelően képzett személy használhatja. 3. Az előírások szigorú betartása javasolt. Az előírásoktól való bármely eltérés az assay működését és a kapott eredményeket hátrányosan befolyásolhatja. Figyeljen a jelen használati utasítás speciális megjegyzéseire és figyelmeztetéseire. 4. A különböző gyártási számú kitekből származó reagensek NEM felcserélhetőek. Nagyszámú teszt kivitelezésekor ügyelni kell arra, hogy valamennyi reagens azonos gyártási tételből származzon. Minden egyes mikrotiter csíkot, amit egy adott vizsgálati sorozatban használnak fel, ugyanabból a fóliatasakból kell elővenni. Bármely összetevő helyettesítése pontatlan eredményekhez vezethet. 5. A reagensek beszennyeződésének elkerülése céljából kizárólag új, vagy tiszta műanyag,- illetve üvegedényeket használjon. Soha ne töltse vissza a megmaradt reagenst az eredeti üvegbe. 6. Ne hagyja a reagenstartókat lezáratlanul; az emiatt fellépő párolgási veszteség, illetve szennyeződés téves eredményekhez vezethet. 7. A TMB szubsztrátot fénytől és nedvességtől óvni kell. 8. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hemolizált vagy lipémiás szérum, vagy csapadékot tartalmazó minta nem használható. 9. A pontatlan mintahígítást a teszt kivitelezése közben nem lehet ellenőrizni, mivel a kit kontrolljai felhasználásra kész oldatban kerülnek forgalomba. Kalibrált pipetták és alkalmas belső minőségi kontroll minták használata ajánlatos. 10. Automatizált tesztrendszerek, mintahígítók és más automatizált eszközök használata a manuális módszerrel összehasonlítva eltérő eredményekhez vezethet. Minden laboratórium saját felelőssége az általa használt rendszer teljes körű validálása, és annak biztosítása, hogy az eredmények a jelen útmutatóban foglalt határokon belül legyenek, és a csatolt Minőség-ellenőrzési bizonylatnak megfeleljenek. 11. Valamennyi alkalmazott készüléket a gyártó előírásainak megfelelően kell kalibrálni és karbantartani. Tárolási körülmények 1. A kit 2-8 C közötti hőmérsékleten tárolandó, lefagyasztani tilos. A nem megfelelő tárolási hőmérséklet az eredményeket befolyásolja. 2. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig stabil. 3. A kit lejárati dátuma a külső címkén van feltüntetve. A minta vétele és kezelése 1. A vérminta levétele vénapunkcióval történjen, a természetes alvadási folyamat után a szérumot a sejtes elemektől el kell választani. 2. A szérum a vizsgálat elvégzése előtt 2-8 C között 7 napig tárolható 7, vagy hosszabb tárolás céljából kisebb részletekben lefagyasztható és -20 C vagy, ez alatti hőmérsékleten tárolható. 3. Az ismételt felolvasztást és lefagyasztást kerülni kell. 4. A szérummintákat nem szabad hővel inaktiválni, mivel ez téves pozitív eredményt adhat. A teszt kivitelezése Rendelkezésre álló anyagok Használati utasítás: Az assay részletes leírását tartalmazza. Minőség-ellenőrzési bizonylat: adott gyártási sorozathoz tartozó kitek elvárható működési jellemzőit mutatja be. C1q-val bevont mérőedények: Humán C1q-val bevont 12 db, egyenként 8 mérőhelyet tartalmazó, bontható mikrotiter-lemez csík. Minden lemez 2 szárítóbetéttel ellátott, visszazárható fóliatasakba van csomagolva. ELISA negatív kontroll: 1 üveg, 1,2 ml hígított humán szérum. A várható érték a Minőség-ellenőrzési bizonylatban található. Azonnal felhasználható. C1q-CIC kalibrátorok: 5 üveg, az egyes üvegek 1,2 ml hígított humán szérumot tartalmaznak, melyek immunkomplex koncentrációja a következő: 100; 33,3; 11,1; 3,7; 1,2. µg Eq/ml. Azonnal felhasználható. 2

3 C1q-CIC Pozitív kontroll: 1 üveg 1,2 ml hígított aggregált humán IgG-t tartalmaz. A várható érték a Minőségellenőrzési bizonylatban található. Azonnal felhasználható. III. típusú mintahígító: 2 db 50 ml-es a mintahígító puffert tartalmazó üveg, sárga színű, azonnal felhasználható. HRP mosó koncentrátum: 1 db 25 ml-es üveg, ami 40-szeres töménységű puffert tartalmaz a mérőlyukak mosására. HRP C1q CIC IgG konjugátum: 1 üveg, 10 ml tisztított, peroxidázzal jelölt anti-humán IgG antitest, zöld színű. Azonnal felhasználható. TMB kromogén: 1 üveg, 10 ml TMB kromogént tartalmaz. Azonnal felhasználható. HRP stop oldat: 1 üveg, 10 ml 0,344 M kénsav oldatot tartalmaz. Azonnal felhasználható. További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mmikrotiter-lemez mosó berendezés: Használata ajánlott, de a lemezek mosása manuálisan is elvégezhető. Mikrotiter-lemez leolvasó: Legyen képes 450nm-en az optikai denzitás meghatározására, levegőre nullázva. Desztillált vagy ioncserélt víz: Az elérhető legjobb minőségben. Kalibrált mikropipetták: 1000, 100, illetve 10 μl-ek adagolásához. Többcsatornás pipetta: A 100 µl konjugátum, szubsztrát és a leállító oldat beméréséhez ajánlott. Üveg/műanyag csövek: Mintahígításhoz. Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. A kit szobahőmérsékletűre melegítése A kitet szobahőmérsékleten való felhasználásra tervezték (20-24 C). Vegye elő a kitet a tárolási helyéről és hagyja szobahőmérsékleten állni kb. 60 percig. A mérőedényeket nem szabad a fóliatasakból kivenni, addig míg azok el nem érték a szobahőmérsékletet. 2. A kit alkotórészei Felhasználás előtt az egyes összetevőket óvatosan keverje meg. 3. A mosópuffer hígítása Adjon 25 ml mosópuffer koncentrátumot 975 ml desztillált vízhez (1:40-es hígítás) egy tiszta edénybe, és keverje össze. Megjegyzés: A hígított mosópuffer 2 8 C között tárolva 1 hétig stabil, ezért célszerű csak a szükséges mennyiséget hígítani. Amennyiben a puffer a mikrobiológiai szennyezettség bármely jelét mutatja vagy zavarossá vált, dobja ki és készítsen friss oldatot. 4. A minták hígítása Hígítson minden egyes mintából 10 µl-t 1000 µl mintahígítóval (1:100) és alaposan keverje össze. MEGJEGYZÉS: A hígított mintákat az elkészítésüket követő 8 órán belül fel kell használni. 5. A csíkok és a keret kezelése Helyezze a szükséges számú mérőedényt a csíktartóba. Az A1-es pozíciótól kezdve töltse be az oszlopokat balról jobbra haladva a lemezen. A lemezzel végzett munka közben szorítsa le a hosszabb oldalakat, hogy a mérőedények ki ne essenek. Megjegyzés: A fel nem használt mérőedényeket azonnal helyezze vissza a fóliatasakba, a szárítóbetétekkel együtt, majd szorosan zárja le a tasakokat, hogy a lehető legrövidebb ideig legyenek azok a nedvességnek kitéve. Vigyázzon, hogy a tasakot ne szúrja át vagy szakítsa el. FIGYELMEZTETÉS: Ha a mérőedények nedvességnek vannak kitéve, illetve porral vagy egyéb szilárd anyaggal szennyeződnek, akkor az antigén tönkremegy, és az a teszt pontosságának romlásához és téves eredményekhez vezet. Az teszt kivitelezése 1. A minták bemérése Pipettázzon 100 µl az egyes kalibrátorokból, assay kontrollokból és a hígított (1:100) mintákból a lemez megfelelő mérőlyukaiba. MEGJEGYZÉS: A mintákat a lehető leggyorsabb tempóban kell a lemezekre bemérni, a mérési csúszás ( drift ) minimalizálása érdekében, a stoppert az utolsó minta bemérése után kell elindítani. Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten 30 percig. 2. Mosás A mosás kritikus része a vizsgálatnak, ezért különleges figyelmet igényel. A nem megfelelően mosott lemez hibás eredményt fog adni, gyenge reprodukálhatósággal és magas háttérrel. Az inkubáció után vegye ki a lemezt és lyukanként µl mosópufferrel háromszor mossa. A mosás végezhető automatikus lemezmosó segítségével, vagy manuálisan, az alábbiakban javasolt módon. Az utolsó automatikus mosási ciklus után fordítsa a lemezt a nyílásokkal lefelé, helyezze egy nedvszívó papírra, és könnyedén ütögetve cseppmentesítse. A lemezek manuális mosásának lépései: a. A lyukak tartalmát rázza ki egy kiöntőbe. b. A lemezt finoman egy szűrőpapírhoz ütögetve, cseppmentesítse. c. A lyukakat, többcsatornás pipetta segítségével töltse fel µl mosópufferrel. d. Egy vízszintes felületre helyezve finoman rázogassa a lemezt. e. Ismételje meg az a - d lépéseket kétszer. f. Ismételje meg az a és a b lépést. 3. A konjugátum felvitele Pipettázzon 100 µl konjugátumot minden egyes mérőlyukba, itassa fel az lyukak peremét egy alkalmas anyaggal, hogy az esetleg kifröccsent konjugátumot eltávolítsa. MEGJEGYZÉS: A szennyeződés megelőzése érdekében soha se töltse vissza a megmaradt konjugátumot az eredeti üvegbe. Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten 30 percig. 4. Mosás Ismételje meg a 2. lépést. 3

4 5. A szubsztrát (TMB) bemérése: Pipettázzon 100 µl TMB szubsztrátot minden egyes mérőlyukba, itassa fel az lyukak peremét egy alkalmas anyaggal, hogy az esetleges kifröccsenéseket eltávolítsa. MEGJEGYZÉS: A szennyeződés megelőzése érdekében soha se töltse vissza a megmaradt TMB-t az eredeti üvegbe. Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten, sötét helyen 30 percig. 6. Leállítás Pipettázzon100 µl leállítóoldatot minden egyes lyukba. Ekkor a reakcióelegy színe kékről sárgára változik. 7. Az optikai denzitás mérése Lemezleolvasóval olvassa le minden egyes lyuk optikai denzitás (OD) értékét 450 nm-en, a reakció leállítását követő 30 percen belül. Minőség-ellenőrzés 1. Minőség-ellenőrzés Annak érdekében, hogy egy meghatározás érvényes legyen, a következő kritériumok mindegyikének teljesülnie kell: Minden egyes mérési sorozatban kell kalibrátorokat, valamint pozitív, negatív kontrollokat használni. Valamennyi kontroll mért értékének a Minőség-ellenőrzési bizonylatban megadott határokon belül kell lennie. A kalibrációs görbe alakja a Minőség-ellenőrzési bizonylatban bemutatott mintához hasonló kell legyen. Amennyiben a fenti feltételek valamelyike nem teljesül, az assay érvénytelen, a vizsgálatot meg kell ismételni. 2. Az optikai denzitások átlagainak kiszámítása (csak a párhuzamosan kivitelezett meghatározások esetén) Minden egyes kalibrátor, kontroll és minta-pár esetén számítsa ki a párhuzamos mérések OD átlagát. A párhuzamosok %-os variációs koefficienseinek (CV%) 15%-nál kisebbnek kell lennie. 3. A kalibrációs görbe elkészítése A kalibrációs görbe készülhet automatikusan vagy manuálisan, a következő eljárás szerint: ábrázolja minden egyes kalibrátorra vonatkozóan az immunkomplex koncentrációját (μg Eq/ml egységben) a logaritmikus skálán, a lineáris skálán jelölt OD értékkel szemben: Automatikus eljárásnál - használjon megfelelően validált programot, és olyan görbeillesztési módszert, amelyik legjobban megfelel a mért adatoknak. Manuális eljárásnál - log/lin beosztású papíron, egy olyan folytonos görbét rajzoljon, ami legjobban illeszkedik a pontokhoz (ne húzzon egyenes vonalat a pontok közé, és ne alkalmazzon pontról-pontra szakaszos ábrázolást). 4. A kiugró pontok kezelése Ha az egyik pont nem illeszkedik a görbére, ki lehet hagyni. Ha azonban a kérdéses pont kihagyása következtében a görbe alakja a mintául adott kalibrációs görbétől eltér, vagy egynél több pont nem illeszkedik, az egész mérést meg kell ismételni. 5. A kontrollok és a minták CIC tartalmának kiszámítása Olvassa le a kontrollok és a hígított minták immunkomplex koncentrációikat közvetlenül a kalibrációs görbéről. Az kontrollok értékeinek a Minőség-ellenőrzési bizonylatban feltüntetett határokon belülre kell esniük. Megjegyzés: A kalibrátor értékek úgy vannak megadva, hogy egy 100-as faktorral a minták 1:100- as hígítását számításba vették. További korrekcióra nincs szükség. 6. Az assay kalibrálása Az assayt belső kalibrátor alkalmazásával μg Eq/ml egységben kalibrálták, mely értékeket megfeleltettek egy WHO aggregált humán IgG referenciával kalibrált assay értékeinek. A módszer korlátai 1. Ez a kit csak kiegészítő információt nyújt a diagnózis felállításához. A pozitív eredmény bizonyos betegségek fennállására utalhat, ezt klinikai adatokkal és más szerológiai tesztekkel meg kell erősíteni. 2. Az ezzel a módszerrel kapott eredmények nem tekinthetők diagnosztikai bizonyítéknak valamely betegség meglétére vagy hiányára vonatkozóan. 3. Kérjük, ne felejtse el, hogy a szérum tartalmazhat bizonyos interferáló anyagokat, mint például kelátképzőket, DNS-t, anti-c1q autoantitesteket, rheumatoid faktort vagy immunoglobulin monomert. Várható értékek A referencia tartomány meghatározása 200 egészséges felnőtt véradó mintája alapján történt. A következő μg ekvivalens per ml (μg Eq/ml) egységben kifejezett értékeket kapták. A alább közölt tartományok csak útmutatásnak tekintendők. Az ELISA tesztek nagyon érzékenyek, alkalmasak a mintapopulációkban lévő igen kis különbségek kimutatására is. Minden egyes laboratóriumnak tanácsos meghatározni saját referencia tartományát, ami a vizsgált populációt jellemzi az alkalmazott módszerekkel és eszközökkel. Várható értékek < 4,4 µg Eq/ml Negatív eredmény 4,4 -<10,8 µg Eq/ml Nem egyértelmű >10,8 µg Eq/ml Pozitív eredmény 4

5 Referencia tartomány 200 egészséges felnőtt véradó szérumának C1q-CIC szintjét mérték meg, a kapott eredmények az alábbi grafikonon láthatók. Az egészséges populáció mintáiban C1q-CIC-et csak szorványosan találtak, ezek oka fertőzés, valamint étkezés utáni szintemelkedés lehet. A valóban egészséges küszöbérték megállapítása érdekében a megemelkedett szintű mintákat három iterációs ciklus alkalmazásával kihagyták. Ennek eredménye egy of 4,4μg Eq/ml-es küszöbérték lett. A Nem egyértelmű tartományt 4,4 és 10,8μg Eq/ml koncentráció közé helyezték, a pozitivitás a 10,8μg Eq/ml értéknél kezdődik Ezek alapján a 200 egészséges mintából, 11,6 és 13,5μg Eq/ml közötti értékkel, 9 bizonyult pozitívnak. Normal sample distribution No. of samples >10 C1q CIC ug Eq/mL Ez a referenciatartomány csak útmutatásnak tekintendő. Minden egyes laboratóriumnak tanácsos meghatározni saját referenciatartományát. Működési jellemzők Pontosság Az intra- és inter-assay pontosságot három olyan minta vizsgálatával állapították meg, melyek az assay mérési tartományán belül voltak. Az egyes minták esetében kapott koncetrációk és C.V. % értékek az alábbiak voltak: INTER-ASSAY PONTOSSÁG n=3 Koncentráció (μg Eq/mL) % C.V. 1. minta 5,4 13,0 2. minta 28,7 7,1 3. minta 50,7 3,9 INTRA-ASSAY PONTOSSÁG n=16 Koncentráció (μg Eq/mL) % C.V. 1. minta 5,3 7,2 2. minta 24,0 5,5 3. minta 67,4 7,5 ANALITIKAI ÉRZÉKENYSÉG Az érzékenységet 20 minta mérési átlaga + 2SD formában határozták meg, a kapott érték: 0,1 μg Eq/ml. RELATÍV SPECIFICITÁS, ÉRZÉKENYSÉG, EGYEZÉS Egy alternatív CIC-C1q EIA kithez képesti relatív specifitást, érzékenységet, illetve egyezést 48 tesztminta, melyek között volt 29 felnőtt véradó és 12 bizonyítottan SLE beteg mintája, felhasználásával határozták meg. Alternatív EIA + Nem egyértelmű BINDAZYME Nem egyértelmű C1q-CIC EIA Relatív érzékenység 95,0% Relatív specificitás 75.0% Relatív egyezés 83.3% A relatív érzékenység, a specificitás, illetve az egyezés kiszámításakor a nem egyértelmű értékeket pozitívnak tekintették. A két kitből származó értékek korrelációja (R 2 ) 0,8 volt. 5

6 ZAVARÓ ANYAGOK A C1q-t kötő CIC tekintetében negatív és pozitív mintákat tesztelték az interferáló anyagok lehetséges hatása szempontjából is. Ezen anyagok vizsgálatára az Interference Check A plus kitre (Kokusai Shiyaku, Japan) módszert alkalmazták. Interferáló anyag Bilirubin F (szabad) Bilirubin C (konjugált) Hemolizált hemoglobin Nyiroknedv Rheumatoid faktor Koncentráció 18,3mg/dl 19,0mg/dl 490 mg/dl 1930 egység 500 NE/ml A fenti koncentrációjú bilirubin, haemoglobin, illetve nyiroknedv esetében nem tapasztaltak interferenciát. Mivel a rheumatoid faktor (RF) mutat interferenciát, a feltételezhetően rheumatoid faktort tartalmazó mintákat, a C1q CIC meghatározása előtt egy megfelelő RF assay-vel tesztelni kell. MÉRÉSI TARTOMÁNY A teszt mérési tartománya: 1, μg Eq/ml. A lemez beosztása A B C D E F G H Az eljárás összefoglalása 1. Adjon 100 µl-t az egyes kalibrátorból, kontrollból és az 1:100 arányban hígított mintából a lemez megfelelő mérőlyukaiba. Inkubálja azokat 30 percig. Mosás. 2. Adjon minden egyes cellához 100 μl konjugátumot. Inkubálja azokat 30 percig. Mosás. 3. Adjon minden egyes cellához 100 μl szubsztrátot. Inkubálja azokat 30 percig. 4. Adjon minden egyes cellához 100 μl leállító oldatot. Mérje meg az abszorbanciát 450 nm-en QUANTA Lite bejegyzett védjegye INOVA Diagnostics, Inc. Copyright Minden jog fenntartva 6

7 Hivatkozások 1. Hay FC et al.: Routine assay for the detection of immune complexes of known immunoglobulin class using solid phase C1q. Clin. Exp. Immunol., 1976; 24: Stanilova SA, Slavov ES: Comparative study of circulating immune complexes quantity detection by three assays - CIF-ELISA, C1q-ELISA and anti-c3 ELISA. J. Immunol. Meth, 2001; 253: Van Hoeyveld E, Bossuyt X: Evaluation of seven commercial ELISA kits compared with the C1q solid-phase binding RIA for detection of circulating immune complexes. Clin. Chem, 2000; 46: Lambert PH: WHO collaborative study for the evaluation of immune complexes in serum. Clin Lab Immunol., 1978; 1: Espinoza LR and Osterland CK.: Circulating immune complexes. Their clinical significance. Future publishing Co., Abrass CK et al.: Correlation and Predictive Accuracy of Circulating Immune Complexes with Disease Activity in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum., 1980; 23: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : info@inovadx.com Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: HUN March 2011 Revision 1 7