QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság:

Átírás

1 QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: Javasolt alkalmazás QUANTA Lite β 2 GPI IgG egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a β 2 GPI IgG antitestek szemi-kvantitatív kimutatására humán szérumban. A β 2 GPI IgG antitestek jelenléte felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtt bizonyos autoimmun betegségekhez társuló thrombotikus folyamatok diagnosztikájában, mint amilyen a szisztémás lupus erythematosusban (SLE) vagy más lupus-szerű betegségben szenvedő páciensekben kialakuló másodlagos thrombosis. A teszt összegzése és magyarázata Anticardiolipin antitestek (ACA) jelenléte erősen összefüggésbe hozható a vénás és arteriás thrombosisokkal. 1-5 Ezt először a szisztémás lupus erythematosus (SLE) tanulmányozása kapcsán figyelték meg, amelyik betegség számos tünete között gyakran fordul elő thrombosis 6-7. Újabb tanulmányok 8-12 kimutatták, hogy egy 50kD szérum kofaktor szükséges az SLE-s betegekben képződött cardiolipin antitestek számára ahhoz, hogy képesek legyenek kötődni a műanyag lemezek felületére rögzített cardiolipinhez. A kofaktort azonosították, és megállapították, hogy az a β 2 -glycoprotein I vagy más néven apolipoprotein H. 8,12,13,14 Bár a β 2 GPI-ről ismert, hogy in vitro gátolja a véralvadási folyamat intrinsic útvonalon történő aktivációját, 15 az ADP-dependens aggregácót 16 és az aktivált thrombocyták prothrombinase aktivitását, 17 a tulajdonképpeni fiziológiás szerepe még nincs tisztázva. Kiderült, hogy az anti-phospholipid szindrómában (APS) a betegekben található anticardiolipin ellenanyag egy módosult β 2 GPI struktúrát ismer fel, nem pedig a cardiolipint, a natív β 2 GPI-et vagy egy olyan epitopot, ami szerkezetileg meghatározott mind a cardiolipin, mind pedig a β 2 GPI molekulán Galli et al. 9 és Viard, et al. 18 egymástól függetlenül közölték, hogy az autoimmun betegekből (SLE és/vagy APS) származó anti-cardiolipin antitestek a polisztirén mikrotiter lemezekhez kötött β 2 GPI molekulával reagáltak. Koike 11 és Matsuura 12 erre alapozva kimutatta, hogy valójában a β 2 GPI az az antigén, amelyhez a betegekből származó sokféle anticardiolipin antitest kötődik, és a foszfolipid egyszerűen csak a β 2 GPI fehérjét rögzíti a szilárd fázishoz. A hagyományos anticardiolipin teszteknek van egy jól ismert hajlama a téves pozitív eredmények produkálására, ami a mintában előforduló foszfolipideknek tulajdonítható. Ez egyes fertőző betegségek, leginkább jellemzően syphilis esetében, valamint más autoantitestek, például a kettős láncú DNS ellen irányuló ellenanyagok jelenlétében 2,3 fordulhat elő. Ha elhagyták a foszfolipidet a szilárd fázis készítésekor, és kizárólag β 2 GPI-et alkalmaztak, a teszt még specifikusabbá vált a potenciális alvadási problémák detektálása szempontjából. A megnövekedett specificitást több kutatócsoport következetesen kimutatta. 11,12,16,17,19,20,21,22 A β 2 GPI autoantitest kimutatása jól használható, és specifikusabb eljárás, amely a hagyományos anticardiolipin tesztekkel, és a lupus anticoaguláns kimutatásával együtt ajánlott a kockázati csoportok thrombosis rizikójának vizsgálatára. IgG osztályba tartozó β 2 GPI antitesteket találtak 47 SLE beteg közül 17-ben (36%). 18 Ebből a 47 SLE betegből kilencnek volt thrombosisa, és közülük 8-ban (89 %) volt kimutatható a β 2 GPI antitest. Hisham, et al. 20 IgG osztályba tartozó β 2 GPI antitestet talált mind az öt betegében (100%) akinél az APS-nek legalább két dokumentált klinikai manifesztációját lehetett kimutatni. Mind az 5 beteg a magas β 2 GPI antietst szinttel jellemezhető csoportba tartozott. Nyolcan a 14 alacsony szintű β 2 GPI antitesttel rendelkező beteg közül (57%) legalább 1 alkalommal thrombotikus eseményt szenvedtek el. Tsutsumi, et al. 22 β 2 GPI ellenes IgG és IgM antitesteket találtak 308 véletlenszerűen kiválasztott japán SLE beteg 10.1% és 5.8%-ában. Az IgG β 2 GPI antitestek gyakrabban fordultak elő olyan betegekben, akik kórtörténetében szerepelt thrombosis. Ez a kutatócsoport beszámolt arról is, hogy 15 ismételt vetélés miatt vizsgált betegből 20 % volt IgG β 2 GPI pozitív. Azt is kimutatták, hogy azok a betegek, akiknek a kórtörténetében thrombosis szerepelt, nagyobb valószínűséggel voltak IgM β 2 GPI pozitívak, és az IgM β 2 GPI szintek magasabbak voltak a thrombosisos betegekben, mint azokban, akiknél nem fordult elő thrombosis. 15 olyan páciens közül, akiknek a kórtörténetében nem szerepelt vetélés, egy sem volt IgM β 2 GPI pozitív. Cabiedes, et al. 23 tanulmányában 94 SLE beteg szerepel, közülük 39-ben fordult elő az APS valamilyen klinikai manifesztációja. A klinikai manifesztációk sokkal szorosabb összefüggést mutattak a β 2 GPI antitestekkel, mint a hagyományos ACA tesztek pozitivitásával. IgG β 2 GPI antitestek jelen voltak a 18 APS beteg közül 16-nak (89%) a szérumában. A 22 ACA pozitív betegből, akiknek emellett nem voltak APS-re utaló klinikai tünetei, egy sem volt β 2 GPI pozitív. 1

2 Cerrato, et al. 24 IgG anti-β 2 GPI elleanyagot talált 32 beteg 87.5%-ában, akiknek kórtörténetében kimutatható volt a thrombosis (APS). IgM anti-β 2 GPI-t találtak ugyanennek a 32 tagú betegcsoportnak a 71.9%-ában. Sebastiani, et al. 25 IgG anti-β 2 GPI-t detektált 110 betegben (20.3%) és IgM-et 109 betegben (20.1%) összesen 542 SLE beteg vizsgálata során. Az anti-β 2 GPI jelenléte szoros összefüggést mutatott az ACA -val (p < 10-5 ). Kimutatták továbbá, hogy az IgG és IgM β 2 GPI antitestek kapcsolatban voltak mind az artériás, mind a vénás thrombosis előfordulásával. A módszer elve Tisztított β 2 GPI antigént rögzítettek polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához, olyan körülmények között, ami az antigén natív állapotát képes megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő β 2 GPI IgG antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a minta-edényekben kialakult szín intenzitását egy ötpontos kalibrációs görbe hasonló adataival vetjük össze. A görbe készítéséhez használt standardot az IgG β 2 -Glycoprotein I referencia kalibrátorokhoz (Rheumatology Lab, Seton Hall University, St. Joseph's Hospital and Medical Center) kalibrálták. 26 Az eredményt szemi-kvantitatív módon, standard IgG anti-β 2 GPI (SGU) egységben fejezzük ki. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított β 2 GPI antigénnel (12-1 x 8 mérőhely) bevonva, tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot IgG tartalmaz, amelyben nincsenek humán β 2 GPI antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. β 2 GPI IgG ELISA Kontroll, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán IgG szérum β 2 GPI antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor A, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán IgG 5. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor B, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán IgG 6. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor C, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán IgG 7. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor D, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán IgG 8. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor E, 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán IgG 9. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínű, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 10. HRP Mosó Koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 11. β 2 HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kékre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 12. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 13. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a β 2 GPI IgG ELISA Kontroll, β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátorok és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 27 2

3 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. 3

4 Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az CSLI (korábban NCCLS) Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 β 2 GPI ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgG ELISA Kontroll előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor A előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor B előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor C előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor D előhígítva 1 1.2mL β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor E előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Mosó Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL β 2 HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, , és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény az HRP Mosó Koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó, ami képes az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP Mosó Koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP Mosó Koncentrátumos üveg tartalmát 975mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer 1 hétig stabil 2 8 C között tárolva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátorokat, a β 2 GPI IgG ELISA Kontrollt vagy az ELISA Negatív Kontrollt. 4. A β 2 GPI antitestek jelenlétének vagy hiányának meghatározása céljából használjon minden egyes kalibrátor és kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. 5. A standard görbe készítése: Az 5 pontos standard görbe pontjainak meghatározásához A-tól E-ig, használja az ELŐHÍGÍTOTT β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátorokat A-tól E-ig közvetlenül a reagens-üvegből. Az öt pontos standard görbe értékei a következők: Pont 4 Standard β 2 GPI IgG Egységek (SGU) A Előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor A B Előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor B 75.0 C Előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor C 37.5 D Előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor D 18.8 vagy E Előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor E 9.4 vagy A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének.

5 2. Pipettázzon 100µL-t mind az öt kalibrátorból, a hígított beteg-mintákból, az ELISA Negatív Kontrollból és a β 2 GPI IgG ELISA Kontrollból a mérőedénykékbe. MEGJEGYZÉS: A β 2 GPI IgG ELISA Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll is előre meg van hígítva, és használatra kész. Az értékek és a β 2 GPI IgG ELISA Kontroll elfogadható tartománya az üveg címkéjén nyomtatott formában található. Ha a kontroll eredménye a címkén megadott elfogadási tartományon kívül esik, ismételje meg az analízist. Ha a kontroll értéke az ismételt mérés után is a megadott tartományon kívül van, kérjen segítséget az INOVA technikai szervíztől. Minden mintából ajánlott párhuzamos meghatározásokat végezni. 3. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 4. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon µL hígított HRP Mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 5. Adjon 100μL β 2 HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 3-ik lépésben. 6. Mosás: Ismételje a 4 lépést. 7. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 8. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 9. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátorok, a β 2 GPI IgG ELISA Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátorok, a β 2 GPI IgG ELISA Kontroll és az ELISA Negatív Kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor A abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított β 2 GPI IgG ELISA Kalibrátor A abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA Negatív Kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A β 2 GPI IgG ELISA Kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA Negatív Kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint d. A β 2 GPI IgG ELISA Kontroll koncentrációja a címkén megadott tartományon belül kell legyen. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az CSLI (korábban NCCLS) Document C24-A tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. 5

6 Az eredmények kiszámítása 1. Határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. 2. Ábrázolja az átlagos abszorbancia értékeket az IgG assay kalibrációs görbéjén a megfelelő koncentrációk logaritmusával szemben. Használjon a pontoknak leginkább megfelelő illesztési módszert a görbe megrajzolásához. Alternatív eljárásként a log/log ábrázolás is alkalmazható. A kalibrátorokhoz rendelt SGU egységek az egyes kalibrátor üvegek címkéin megtalálhatók. 3. Határozza meg az ismeretlen minták β 2 GPI IgG koncentrációját standard β 2 GPI IgG egységekben (SGU) az "X" tengelyen, úgy, hogy hozzárendeli az "Y" tengelyen a megfelelő abszorbancia értékhez. 4. Negatív az eredmény 0-20 egység között. A pozitív eredmények nagyobbak, mint 20 SGU. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában β 2 GPI IgG antitestek vannak, és felveti a lehetőségét valamely autoimmun betegséghez társuló thrombotikus folyamatnak, mint amilyen a szisztémás lupus erythematosushoz, vagy más lupus-szerű betegséghez társuló másodlagos thrombosis. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs β 2 GPI IgG antitestje, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi meállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott β 2 GPI IgG értékek ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. A β 2 GPI antitestek klinikai jelentősége az SLE-től eltérő más betegségekben még vizsgálatok tárgya. 2. Ha negatív anti-β 2 GPI eredményt kapunk klinikai tünetek fennállása mellett, lupus anticoaguláns, anticardiolipin, vagy más kiegészítő vizsgálatok elvégzése indokolt lehet. 3. Diagnózis nem állítható fel kizárólag az anti-β 2 GPI vizsgálat eredménye alapján. Ezeket az eredményeket más orvosi vizsgálatok eredményével együtt kell értékelni. 4. Nem szabad kezelést indítani kizárólag egy pozitív anti-β 2 GPI titer alapján. További megerősítő klinikai indikációk együttes jelenléte szükséges a kezeléshez. 5. Előfordulhat, hogy egyes minták anticardiolipin pozitívak lesznek, és mégis anti-β 2 GPI negaítívak. Az anti-β 2 GPI teszt a thrombosis kockázatának sokkal specifikusabb markere. Az anticardiolipin teszt téves pozitív eredményt adhat az anti-dsdna antitestekkel, és egyes infekciók kapcsán megjelenő ellenanyagokkal. 6. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek (Workshop Samples - 7th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies - New Orleans) Az október 9-13 között megrendezett 7-ik Antiphospholipid konferencián egy nedves munkaértekezletet szerveztek, a különböző kutatás-alapú és kereskedelmi antiphospholipid tesztek működésének felmérésére. A QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA kitet ezekkel a mintákkal ellenőrizték. A panelben helyet kapott 10 olyan beteg mintája, akinek dokumentáltan antiphospholipid szindrómája (APS) volt, 7 fertőző betegségben szenvedő páciens mintája, közöttük volt syphilis és Q láz, 2 minta rheumatoid autoimmun betegektől és 11 normál minta. A mintákat hagyományos antiphospholipid teszttel is vizsgálták. Az eredmények az alábbiak szerint foglalhatók össze: Csoport Minták β 2 GPI Cardiolipin száma pozitív pozitív APS Fertőző beteg Rheumatikus Egészséges Mind a 10 APS beteg mintája pozitív lett mindkét módszerrel, a β 2 GPI és a cardiolipin antitest assay-vel is. A másik három csoportban egy rheumatikus beteg kivételével valamennyi minta negatív volt a β 2 GPI teszttel. Négy minta az infectios csoportból, mindkét rheumatikus, és 1 a tizenegy normálból pozitív volt a hagyományos cardiolipin antitest módszerrel vizsgálva. 6

7 Specifikus Működési Jellemzők Klinikai tanulmányok összefoglalása A QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA teszt működését 1 belső és 4 külső klinikai tanulmányban értékelték. Az eredményeket az alábbi táblázat foglalja össze: Páciens csoport Mintaszám Pozitívak száma (%) SLE-hez kapcsolódó APS * (97.2) Primer APS (93.3) SLE 34 2 (5.8) Rheumatoid arthritis 17 0 (0) Polyhypergammaglobulinemia 7 0 (0) Infectio ** 81 0 (0) Normál (0.4) * APS = Antiphospholipid szindróma ** Többségük pozitív lett syphilis szerológiai teszttel A fenti vizsgálati eredmények alapján a β 2 GPI teszt klinikai szenzitivitása 96.2%, klinikai specificitása 99.6%. Relatív szenzitivitás és specificitás Összehasonlítás az anticardiolipin teszttel Negyvenhét szérumot vizsgáltak, amelyeket random módon választottak ki egy nagy referencia laboratóriumba cardiolipin antitest vizsgálatra érkezett mintákból, cardiolipin és β 2 GPI IgG antitestek jelenlétére. Az eredmények összefoglalása: β 2 GPI Relatíiv Szenzitivitás 20.8% Cardiolipin Relatív Specificitás 100.0% Relatív Hatékonyság 52.5% Öt minta volt pozitív mindkét módszerrel és 16 minta volt mindkettővel negatív. Nem volt olyan minta, amelyik β 2 GPI pozitív lett, miközben cardiolipin antitest negatív. Tizenkilenc mintát találtak anticardiolipin pozitívnak és ugyanakkor negtívnak β 2 GPI IgG antitestre nézve. Ebben a kis mintaszámú összehasonlító tanulmányban, ahol random minták eredményeit dolgozták fel, a klinikai háttér ismerete nélkül, a IgG β 2 GPI eredmények relatív szenzitivitása alacsonynak tűnik az IgG anticardiolipin teszttel összehasonlítva. Ez nem váratlan eredmény. A hagyományos anticardiolipin tesztek egyaránt detektálják a β 2 GPI ellenes antitesteket és olyan antitesteket is, amelyek magával a phospholipiddel reagálnak. Amint az a fentebb említett New Orleans Workshop adataiból, valamint a Klinikai tanulmányok összefoglalása című szakaszban is látható, a β 2 GPI assay által nyújtott érzékenység versenyképes, specificitása pedig nagyobb, ha igazolt APS betegek szérumából végzett mérések alapján történik az összehasonlítás az anticardiolipin teszt eredményeivel. Precizitás és reprodukálhatóság A módszer precizitását és reprodukálhatóságát egy negatív, egy erősen és egy mérsékelten pozitív minta hat alkalommal végzett analízisének eredményei alapján kalkulálták. A méréseket három egymást követő napon egy délelőtti és egy délutáni munkafolyamatban végezték. A negatív minta átlagértéke 18.9, a mérsékelten pozitív minta átlaga 44.3 és az erősen pozitív mintáé 82.4 volt. A sorozaton belüli (within-run) és a sorozatok közötti (between-run) eredmények az alábbi táblázatban láthatók: Negatív Mérsékelt Pozitív Erősen Pozitív SD CV SD CV SD CV Összesített % % % Sorozaton belül % % % Sorozatok között % % % QUANTA Lite bejegyzett védjegye INOVA Diagnostics Inc. 7

8 Hivatkozások 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: , Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: , Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: , Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: , McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: , Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: , Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: , McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 -glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: , Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: , Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: , Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 - GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 -GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: , Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: , Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: , Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: , Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: , Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: , Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: , Roubey, RA. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: , Tsutsumi A, et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: , Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899, Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β 2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516, Sebastiani, G.D., et al. Anti β 2 GPI and acl in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5: 519, Erickson, E., S. Najmey, L. Keil, H. EL-Kadi, and V. DeBari. Reference calibrators for IgG antibodies to β 2 -glycoprotein I: preparation, properties and availability to investigators. Clinical Chemistry, 42: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institute of Health, 5 th Edition, A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Műszaki szolgálat Az Egyesült Államokon kívül: support@inovadx.com Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: HUN September 2010 Revision 2 8