Mátrix effektus a 25(OH)D-vitamint és a parathormont mérő módszerekben valamint. a 2013-as QuliCont eredményekből levonható tanulságok

Átírás

1 Mátrix effektus a 25(OH)D-vitamint és a parathormont mérő módszerekben valamint a 2013-as QuliCont eredményekből levonható tanulságok Toldy Erzsébet, Kányási Mária, Walentin Szilvia QuliCont Fórum január 30. Budapest, Lurdy Konferencia-és Rendezvényközpont Könyves Kálmán Krt

2 Fehérjekötésen alapuló módszerek speciális hibalehetőségei I. Analittel összefüggő a standardként használt molekula nem azonos a páciensével- oka az analit in nate heterogenitása II. A biológiai minta mátrixával összefüggő Interferencia Keresztreakció Mátrix effektus

3 Interferencia: A mért eredményben torzítást okozó olyan szubsztancia jelenléte, amely zavaró interferenciát okoz. Jelenléte izolálható. Keveréses vizsgálat. Eltérő módszerek között is ellentmondásos leletet okozhat. Complementek, fibrinogén, EDTA, bilirubin, haemolisis,

4 Keresztreakció: a biológiai testnedvekben előforduló keresztreagáló metabolit, gyógyszer, vagy antitest (Rf, HAMA, HAHA, endogén antitestek) A potenciálisan keresztreagáló ágensek nincsenek jelen a standardokban és kontroll mintákban, de jelen lehetnek a beteg szérumában.

5 MÁTRIX EFFEKTUS: Főként a fehérjekötésen alapuló (immunoassay, protein binding assay) analitikai módszereknél tapasztalható az eredményekben olyan torzítás, amely az analit mátrix összetétel különbözőségből adódik. pl. szérum-plazma; aktív szénnel kezelt szérum-natív szérum, vagy vizelet-szérum, ascites-szérum, liquor-szérum között. A gyakorlatban a mátrix effektus jelenséget a kalibrátor görbéhez használt szérum-mátrix és a biológiai minta-mátrix között fennálló különbség okozza.

6 Ambient assay - R. Ekins Az eredmény függ f a biológiai minta-mátrixt trixtól Az analit és az antitest közötti kötést befolyásolja a reakciótérben lévő környezet: = analit (pl. hormon) ph-ja, ion erőssége, protein jelenléte, szintje. fehérjefrakciók mennyisége és aránya a hidrofób molekulák - döntő fontosságú a Ag-Ab Ab komplexek kialakulásához hoz Globulin Albumin

7 Lehetőségek a mátrix effektus csökkentésére a biológiai minta mennyiségének csökkentése, a reagens mennyiség javára, amelyben növeljük a protein és ionkoncentrációt valamint a puffer kapacitást. Ugyanakkor a biológiai mintamennyiség csökkentésével rontjuk a módszer szenzitivitását is. - Klinikai használatra a standardok készítésénél egészséges fehérje és ionkoncentrációkra beállított humán szérum matrixot használjuk. Ettől eltérő a súlyos betegek szérum mátrixa. - Kérdés, hogy a reakciótérben a reagensek milyen fokban képesek ezt az eltérést kompenzálni?

8 MUNKACSOPORTUNK MÁTRIX EFFEKTUS IRÁNYÚ VIZSGÁLATA: Több irodalmi adattal rendelkezünk már arra nézve, hogy a D vitamin ellátottság javításával egyes betegségek iránti fogékonyság, valamint a már fennálló betegségek relapszusának elkerülése is jobban biztosítható. Ezért, a klinikai gyakorlatban egyre gyakrabban felmerül az igény a 25OHD szintek pontos mérésére olyan biológiai mintákban is, ahol a normálistól eltérő fehérjefrakciókkal (pl. alacsony albumin, alacsony v. magas D vitamin bindig protein (DBP), stb ) is számolnunk kell. Ezért végeztünk in vitro és in vivo vizsgálatokat a hazánkban a klinikai kémiai gyakorlatban leggyakrabban alkalmazott két 25OHD vitamint mérő módszerrel.

9 Albuminfüggés vizsgálata: in vitro ANYAG ÉS MÓDSZER: Összesen 6 db alacsony albuminszintű szérum poolhoz 5 lépésben adtunk 20%-os human albumint tartalmazó oldatot annyi mennyiségben, hogy lépcsőzetesen növeltük a minta albuminszintjét addig, hogy annak értéke a normális albuminszintet elérje, illetve meghaladja. Mindegyik mintából (N=36) meghatároztuk mindkét módszerrel a 25OHD szinteket

10 25(OH)D vitamint mérő két teljesen automatizált módszer I. Antitest kötésen alapuló: IMMUNO-ASSAY CLIA (DiaSorin) DBP 25(OH)D 25(OH)D a szérumban Albumin II. Fehérje kötésen alapuló : ECL-PBA (Roche)

11 A két módszerrel mért 25OHD szintek az albuminmanipulációt követően Mérhető 25OHD szintek 25OHD szintek változása%

12 25OHD vitamin szintek az alacsony és a közel normális albuminszintű minták esetében 70 PBA KW-H(1;36) = 7,85; p = 0, IMMUNO-ASSAY KW-H(1;36) = 1,1725; p = 0,279 N.S. 25(OH)D nmol/l ** 25(OH)D nmol/l <30 >30 g/l Albumin szintek Median 25%-75% Min-Max 16 <30 >30 g/l Albumin szintek Media 25%-7 Min-M

13 KORRELÁCIÓK AZ ALBUMINSZINTEK ÉS A MÉRT 25OHD VITAMIN SZINTEK KÖZÖTT Protein Binding-Assay Immuno-Assay *** N.S. *** *** %-os változás a 25OHD szintekben

14 In vitro albuminmanipuláció eredményekből levonható következtetések

15 IN VIVO: klinikai tapasztalat elemzése A Belgyógyászati betegek diagnózis szerinti megoszlása Nephrosis+Malnutritio N=64. Chronical renal faileure Cirrhosis Kontrollként állítottunk 48 nemben és életkorban illesztett, aktív életvitelű személyt Elemzett paraméterek: albumin, DBP, PTHi, 25OHD vitamin szintek.

16 A kontroll és a beteg csoportban mért albumin és DBP szintek közötti különbség Albumin g/l: KW-H(1;112) = 80,6; p = D-vitamin binding protein mg/l: KW-H(1;111) = 27,5 ; p = 0, Albumin g/l *** D-vitamin binding protein mg/l *** Beteg Aktív-Kontroll Mean Mean±SE Mean±1,96*SE 220 Beteg Aktív-Kontroll Mean Mean±SE Mean±1,96*SE

17 25OHD szintek a két módszerrel mérve: a módszerek között szignifikáns különbséget csak az alacsony albuminszintű betegekben találtunk

18 Korrelációk az albumin és a 25OHD szintek között Beteg Kontroll Log25(OH)D nmol/l PBA 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 *** r = 0,40; p = 0,001 Log25(OH)D nmol/l PBA 2,2 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 N.S. Nincs korreláció 0, Albumin g/l 0,95 Conf.Int. 1, Albumin g/l 0,95 Conf.Int. Log25(OH)D nmol/l Immunoassay 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 *** r = 0,40; p = 0,001 Log25(OH)D nmol/l Immunoassay 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 N.S. Nincs korreláció 0, Albumin g/l 0,95 Conf.Int. 1, Albumin g/l 0,95 Conf.Int.

19 A DBP és albumin között csak a betegek esetében áll fenn szignifikáns pozitív korreláció Beteg Kontroll

20 A két 25OHD módszer albumin függése A betegminták csoportosításában PBA P=0,057 IA N.S. In vitro kísérletnek ellentmond az IA esetében Albumin

21 Korreláció a 25OHD és a DBP között Beteg Kontroll Log25(OH)D nmol/l PBA 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 * r = 0,30; p = 0,020; Log25(OH)D nmol/l PBA 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 N.S. Nincs korreláció Log25(OH)D nmol/l Immuno assay 0, ,0 1,9 1,8 1,7 *** DBP mg/l r = 0,44; p = 0,0004 0,95 Conf.Int. 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0, DBP mg/l 0,95 Conf.Int. Log25(OH)D nmol/l Immunoassay 1, DBP mg/l Nincs Korreláció 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 N.S. 0,95 Conf.Int. 1, DBP mg/l 0,95 Conf.Int.

22 A két módszerrel mért 25OHD szintek az alacsony és a normál DBP szintű mintákban A 25OHD IA módszer DBP függése erősebb, mint a PBA esetében PBA IA

23 Klinikai adatokból levonható következtetések, összevetve az In vitro albuminmanipuláció eredményekkel

24 A 2013-as QuliCont eredményekből levonható tanulságok QuliCont: Gyógyszerek, hormonok- 196-os és Cametabolismus 301-es 4 ill. 6 körvizsgálat/év 25(OH)D vitamin és PTHi adatok.

25 25(OH)D-vitamin

26 Beküldött kontroll eredmények száma

27 A 25(OH)D vitamint mérő módszerek megoszlása

28 Melyik tartományt ellenőrizték a QuliCont kontroll szérumok 2013-ban Nem ellenőriztük: Elégtelen Hiány 1.) Toxikus tartományt ( >250 nmol/l) 2.)Súlyos hiányt (<20-25nmol/l) Súlyos hiány

29 Miként is mérünk összességében 25OHD Szinteket a módszertől függetlenül: K1 szérum!!

30 Miként is mérünk összességében? módszertől függetlenül: K2 szérum?!!

31 Eltérés a célértékektől százalékban

32 Laboratóriumonként leadott 25OHD eredmények 4 azonos kontroll szérum esetében Szaggatott vonal: Célértékek átlaga

33 Laboratóriumonként leadott eredmények eltérése a módszer specifikus célértéktől Cél

34 Célértéktől való eltérések az 5 módszer esetében

35 PTH intact H 2 N COOH

36 Parathormon (PTH) mérés Mit mérnek a PTH-intact módszerek? PTH molekulaformák a keringésben 3. Generáció BIO-intact (1-84) Generáció 4. generáció!!! 2014-től

37 A 40 laboratórium által alkalmazott 7 PTHi módszer megoszlása

38 Beküldött PTH kontroll eredmények száma

39 Melyik PTHi tartományt ellenőrizték a QuliCont kontroll szérumok 2013-ban Alacsonyabb N=6 Magasabb N=6

40 Miként is mérjük a PTHi szinteket az alacsony és a magas mérési tartományban: Alulmérünk picit? Referencia tartományok: átváltási faktor: 1 pg/ml=0,106 pmol/l ECLIA (Roche): 1,6-6,9 pmol/l CLMA (DiaSorin): 1,2-6,48 pmol/l Vesepotló terápiában: 5,3-31,8 pmol/l

41 PTHi kontrollok %-os eltérése a célértéktől a két mérési tartományban Cél

42 Kontroll eredmények eltérése a célértékektől 6 módszerrel mérve

43 Laboratóriumonként leadott PTH eredmények 3 kontroll szérum esetében-i.

44 Laboratóriumonként leadott PTH eredmények 3 kontroll szérum esetében-ii.

45 Laboratóriumonként leadott PTH eredmények eltérése a módszer specifikus célértéktől

46 Köszönöm a megtisztelő figyelmet! ÉS

47 Köszönet munkatársaimnak éstdk hallgatóimnak! Köszönet a klinikus kollégáknak

48 Regression Summary for Dependent Variable: t-25(oh)d-ia nmol/l (Csak betege-belosztaly- Modszer-osszemereshez) R=, R2=, Adjusted R2=, F(2,61)=8,0177 p<,00081 Std.Error of estimate: 15,908 b* Std.Err. - of b* b Std.Err. - of b t(61) p-value Intercept -5, , , , Albumin g/l 0, , , , , , D-vitamin binding protein mg/l 0, , , , , ,004217

49 Regression Summary for Dependent Variable: t-25(oh)d-pba nmol/l (Csak betege-belosztaly-modszerosszemereshez) R=, R2=, Adjusted R2=, F(2,61)=2,9779 p<,05835 Std.Error of estimate: 15,741 b* Std.Err. - of b* b Std.Err. - of b t(61) p-value Intercept -1, , , , Albumin g/l 0, , , , , , D-vitamin binding protein mg/l 0, , , , , ,176069