QUANTA Lite TM LKM-1 ELISA In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

Átírás

1 QUANTA Lite TM LKM- ELISA In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM LKM- egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA), amely a humán szérumban lévő LKM- antitestek félkvantitatív kimutatására szolgál. Az LKM- antitestek jelenléte a klinikai eredményekkel és más laboratóriumi tesztekkel együtt felhasználható a 2-es típusú autoimmun hepatitisz diagnosztizálásában. A teszt összegzése és magyarázata Az autoimmun hepatitisz (AIH) egy heterogén betegség, melynek etiológiája nem ismert. Az -es típusú autoimmun hepatitisz (lupoid AIH) a gyakoribb AIH típus, az anti-nukleáris (ANA), a simaizom (AMA) és az aktin antigénekkel szembeni reaktivitás jellemzi. A 2-es típusú autoimmun hepatitiszt (AIH) az indirekt immunfloureszcenciával, rágcsálóvese- és máj szöveti metszeteken kimutatható máj/vese mikroszóma (LKM-) antitestek jelenléte jellemzi. Az LKM- reaktivitás a májsejt citoplazma és a proximális vesetubulusok (a disztális nem) festődése jellemzi. A 2a-típusú AIH beteg jellemzői: fiatal, nő, súlyos beteg, alacsony IgA szintje van, az immunszupresszív kezelésre jól reagál és hepatitisz C vírus tekintetében negatív.,2 Az LKM- antitest fő célantigénjeként egy, az endoplazmatikus retikulumban található mikroszómális fehérjét, a citokróm P452D6-t azonosították. 3-6 LKM--ről a krónikus HCV fertőzőtt betegek mintegy 8%-ában számoltak be. 2,3,7-9 A HCV betegek széruma által felismert epitóp különbözik az AIH-2 szérum által felismerttől és valószínű, hogy autoantitestek termelődnek a krónikus HCV fertőzés lefolyása alatt, inkább mint a valódi 2-es típusú AIH során. 6,7,, Az egyidejűleg LKM- és HCV pozitív beteg tipikusan idősebb, gyakrabban férfi, és KM- antitest szintje általában alacsonyabb, mint az AIH-2a betegeknek.,2 Azon betegek, akik HCV-pozitívak és LKM- pozitívak is nehéz helyzet elé állítják a kezelőorvost, mivel a HCV és az AIH-2 kezelése drámai módon különbözik egymástól. 9,,2 Ezen felül, az LKM- elleni antitestek, a citokróm P45 2C9 entitestek (LKM-2) társulnak a tienilsavindukált hepatitisszel, illetve azonosították az uridin-difoszfát-glükuronozil transzferáz elleni antitesteket (LKM-3), amelyek a hepatitisz D fertőzéssel társulnak. 3 Jelentések szerint szolubilis májantigén (SLA) elleni antitesteket vagy máj-pankreász antigén (LP) elleni antitesteket találtak olyan AIH betegekben, akik más autoantitestekre negatívak voltak, lehetséges, hogy ez egy másik AIH-alcsoportot jelent. A módszer elve A részben tisztított, teljes méretű rekombináns humán citokróm P45 2D6 antigént a polisztirol mikrotiter lemez celláihoz kötik olyan körülmények között, amelyek az antigént natív formában megőrzik. Az előzetesen hígított kontroll mintákat és a betegek hígított szérummintáit a különbözõ cellákba adagolják, lehetővé téve bármely jelenlévő LKM- autoantitest immobilizált antigénhez kötõdését. A nem kötődött mintát lemossák és mindegyik cellához enzimjelölt anti-humán IgG konjugátumot adnak. Egy második inkubáció lehetővé teszi, hogy az enzimjelölt anti-humán IgG minden olyan, a beteg mintájából származó antitesthez hozzákötődjön, amely korábban a cellához kötődött. Az összes megkötetlen enzimjelölt antihumán IgG lemosása után a megmaradó enzimaktivitást kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakuló szín intenzitásának mérésével határozzák meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a betegminták celláiban kialakult szín intenzitását mérjük és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez, részlegesen tisztított teljes méretű rekombináns humán citokróm P45 2D6 antigénnel (2- x 8 cella) tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA negatív kontroll, ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, LKM elleni antitestek nélkül, előhígítva,,2 ml. 3. LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontroll, ampulla tartósítószert, valamint rekombináns humán citokróm P45 2D6-hoz elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva,,2 ml. 4. LKM- ELISA erősen pozitív kontroll, ampulla tartósítószert, valamint rekombináns humán citokróm P45 2D6 elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva,,2 ml. 5. HRP mintahígító, üveg rózsaszínű, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot, Tween 2-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 5 ml. 6. HRP mosókoncentrátum, üveg, 4-szeres koncentrátum - vöröses színű, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot és Tween 2-at, 25 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók. 7. HRP IgG konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, üveg kékes színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, ml. 8. TMB kromogén, üveg, stabilizátorokat tartalmaz, ml. 9. HRP stop oldat,,344 M kénsav, üveg színtelen, ml. Figyelmeztetések. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék olyan kémiai anyagot (,2% kloramfenikol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen

2 ezért az LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az LKM- ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicseppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekhez vezethet. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA cellákból nem megfelelõ pontosságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. A teszt adaptációja automatikus mintakezelő rendszerek, vagy más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja a manuális módszerhez képest. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt teljesítményét több tényezõ befolyásolhatja. Ilyen a reagensek kezdeti hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványok az ELISA lemez celláiból történő eltávolításának alapossága, a kiértékeléshez használt fotométer, illetve az inkubációs idők hossza. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. A protokoll szigorú betartása javasolt. 7. A mikrotiter csöveket és deszikkánst tartalmazó, visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját, és a teszt pontosságának romlását okozza. 8. A HRP konjugátum ugyanazon csövének bizonyos idõ elteltével két- vagy többszöri használata, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. Az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt a HRP konjugátum kémiailag szennyeződhet. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítőszerek, alkohol vagy detergensek maradványai idővel a HRP konjugátum lebomlását okozzák. Kémiai tisztítószerek/fertőtlenítőszerek használata után a készülékeket és az eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csövek a deszikkánssal együtt, a fóliatasakot biztonságosan lezárva 2-8 C között tárolandók. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva hétig stabil. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérumminták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H8-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: ) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -2 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 2

3 A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok LKM- ELISA mikrotiter lemez (LKM- ELISA microwell plate), (2- x 8 cella) tartókerettel,2 ml előhígított ELISA negatív kontroll (ELISA Negative Control),2 ml előhígított LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontroll (LKM- ELISA Low Positive),2 ml előhígított LKM- ELISA erősen pozitív kontroll (LKM- ELISA High Positive) 5 ml HRP mintahígító (HRP Sample Diluent) 25 ml HRP mosókoncentrátum (HRP Wash Concentrate), 4-szeres koncentráció ml HRP IgG konjugátum (HRP IgG Conjugate), (kecske), anti-humán IgG ml TMB kromogén (TMB Chromogen) ml HRP stop oldat (HRP Stop Solution),344 M kénsav További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mikropipetták 5,, 2-3, és 5 µl-es méréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4 ml térfogattal Desztillált vagy ioncserélt víz l-es edény az HRP mosókoncentrátum hígításához Olyan mikrotiter lemez leolvasó, ami képes OD mérésre, 45 nm-en (illetve 62 nm-en a két hullámhosszon történő méréshez) Módszer Mielőtt hozzákezd. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (2-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosókoncentrátumot :4 arányban úgy, hogy a HRP mosókoncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. Ha nem egyszerre kerül a teljes lemez felhasználásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 6 felhasználandó cellánként adjon 2, ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez. A hígított puffer 2 8 C között tárolva hétig stabil. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából : arányú hígítást, a következő módon: adjon 5 µl mintát 5 µl HRP mintahígítóhoz. A hígított mintákat az elkészítésüket követő 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA az LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, az LKM- ELISA erősen pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 4. Az LKM- antitestek jelenlétének vagy hiányának tetszõleges egységekben való meghatározásához használjon mindhárom kontroll méréséhez két-két cellát, és minden betegminta méréséhez egy vagy két cellát. A betegmintákból párhuzamos minták (duplikátumok) meghatározását javasoljuk. A teszt kivitelezése. AZ ASSAY MEGKEZDÉSE ELŐTT VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBAHŐMÉRSÉKLETET (2-26 C). Helyezze a szükséges számú cellát/csövet a keretbe. A fel nem használt csöveket haladéktalanul tegye vissza a deszikkánst tartalmazó fóliatasakba és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a cellák minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon - µl-t az előhígított LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, az LKM- ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított betegmintákból a cellákba. Fedje be és 3 percig szobahőmérsékleten inkubálja a lemezeket, egy vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta adagolása után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes cella tartalmát. Adjon 2-3 µl hígított HRP mosó puffert minden egyes cellához, majd ezt is szívassa le. Ismételje meg ezt az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé és egy nedvszívó felületen, finoman ütögetve tökéletesen távolítsa el az utolsó mosás után visszamaradt folyadékot. Nagyon fontos, hogy a cellák minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. Leszíváskor a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet tartsa be. 4. Minden egyes cellához adjon µl HRP IgG konjugátumot. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között, és a helyes laboratóriumi eljárásoknak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a mérés elvégzéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a cellákat 3 percig úgy, mint a második lépésben. 5. Mosás: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Adjon µl TMB kromogént minden egyes cellába és inkubálja sötét helyen, 3 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon µl HRP stop oldatot minden egyes cellába. A HRP stop oldat adagolásakor ugyanazt az idõzítést és sorrendet tartsa, amit a TMB kromogén esetében alkalmazott. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, hogy a cellák tartalma alaposan összekeveredjen. 8. Olvassa le minden egyes cella abszorbancia (OD) értékét 45 nm-en, a reakció leállítását követő egy órán belül. Ha bikromatikus mérést kíván végezni, referencia hullámhossznak használja a 62 nm-t. 3

4 Minőség-ellenőrzés. Futassa együtt az LKM- ELISA mérsékelten pozitív, az LKM- ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontrollt minden egyes betegminta sorozattal annak ellenőrzésére, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is megfelelõen mûködik. 2. Ne feledje, hogy mivel az LKM- ELISA mérsékelten pozitív, az LKM- ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontroll is elõhígított, ezért egyikük sem kontrollálja a minta hígításával kapcsolatos lépéseket. 3. Kiegészítő kontrollok is használhatók a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelő módon. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérumminták szétosztásával, és -2 C alatt történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit valósnak tekinthessük, valamennyi alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított LKM- ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell legyen, mint az előhígított LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, ami nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított LKM- ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája,-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb,2-nél. c. Az LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy nagyobbnak kell lennie, mint,25. d. Az ELISA negatív kontroll és az LKM- ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek alapvetõ hibájának jelzésére szolgál. Az LKM- ELISA erősen pozitív kontroll nem garantálja a precizitást a teszt diagnosztikai küszöbértékének közelében. e. A felhasználó az adott minõség-ellenõrzési eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A -ban találhat. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg az egyes párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja az LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Majd az így kapott eredményt megszorozza az LKM- ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén feltüntetett egységek számával. Minta OD Minta értéke = x LKM- ELISA mérsékelten pozitív (egységek) LKM- ELISA mérsékelten pozitív OD (egységek) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának hígítási sorát kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a minta antitest titerértékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA teszt a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, valamint képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alább mutatott értékek csak javaslatok. Minden egyes laboratóriumnak meg kell határoznia a saját referencia tartományait, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a saját eljárásaiknak megfelelően. A minta besorolása az alábbi táblázat szerint lehet negatív, nem egyértelmű vagy pozitív. Egységek Negatív <2, Nem egyértelmű 2, 24,9 Pozitív >25 Az eredmények közlése előtt a nem egyértelmű mintákat újra kell tesztelni.. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában rekombináns humán P452D6 elleni IgG antitestek vannak, és felveti a 2-es típusú autoimmun hepatitisz fennállásának lehetőségét. 2. Azok a minták, melyekben az LKM- IgG antitest koncentráció nem egyértelmű, alkalmatlanok az antitest státusz megállapítására. Ha az eredmény ismételt vizsgálattal is a kétes tartományba esik, az eredményt kétesként jelentjük és/vagy a vizsgálatot frissen vett mintából megismételjük. 3. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincsenek LKM-elleni IgG antitestei, vagy azok koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 4. A mikrotiter lemez leolvasó mérési tartománya feletti OD értéket adó mintákról úgy kell jelenteni, hogy a mérhető legmagasabb OD értéknél nagyobb értéket el kell osztani a mérsékelten pozitív kontroll OD-jának 25-szörösével, vagy egy számítható érték érdekében a mintát hígítani kell, majd újramérni. 5. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredményeket az INOVA QUANTA Lite TM LKM- ELISA 4

5 használatával kaptuk. Más gyártók tesztjével kapott LKM- értékek ettől eltérőek lehetnek, ezek fel nem cserélhetőek. A közölt IgG érték mennyisége nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai. Egy negatív LKM- eredmény nem zárja ki a 2-es típusú autoimmun hepatitisz lehetőségét. 2. Egy negatív LKM- antitest eredmény nem zárja ki az LKM- antitestek jelenlétének lehetőségét, mivel lehetséges, hogy az antitest koncentrációja a teszt kimutatási küszöbértéke alatt van. 3. A pozitív eredmény mindössze a humán rekombináns citokróm P452D6 elleni antitest jelenlétét jelzi és nem feltétlenül jelent 2-es típusú autoimmun hepatitiszt. 4. A 2-es típusú autoimmun hepatitisz diagnózisához a beteg demográfiai jellemzőinek, klinikai tüneteinek és más diagnosztika vizsgálatainak összegzése szükséges. 5. Néhény beteg esetén az LKM- antitestek kimutathatósága HCV fertőzés eredménye, nem pedig AIH-2-é. Az LKM- pozitív mintákat HCV fertőzés tekintetetében is tesztelni kell. 6. Ezen teszt eredményeit a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 7. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő mátrixok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek A 2-es típusú autoimmun hepatitisz becsült előfordulása 5-3 eset az egy millióból. Ez a betegség leggyakrabban 2 és 4 éves kor között fordul elő és nők esetén gyakoribb, mint a férfiaknál (8:). 4,5 Referencia tartomány 5 felnőtt és 43 gyermekkorú egyénből öszeállított, 94 mintát tartalmazó panelt teszteltek QUANTA Lite TM LKM- ELISA kittel. Egy minta a küszöbértéken lévő, ezért kétes eredményű volt (2,7 egység). A maradék 93 mintát negatívként értékelték. A kétes mintát kizárva, a specificitás % volt (93/93). Ezen populáció átlagértéke 6,3 egység volt, a medián 5,7 egység, a legmagasabb érték pedig 2,7 egység volt. A személyek életkora és 75 év között volt. Specifikus jellemzők Klinikai vizsgálatok Az első vizsgálatban egy 84 klinikailag meghatározott mintából összeállított panelt teszteltek egy külső klinikán. A tesztelt minták részleteit és a vizsgálat eredményeit az.ábra foglalja össze. A QUANTA Lite TM LKM- ELISA kit %-os (22/22) specificitást mutatott azon minták tekintetében, melyek 2-es tipusú autoimmun hepatitisz pozitívak, LKM- IFA pozitívak, és HCV negatívak voltak. A HVC pozitív minták LKM- reaktivitása alacsony szintű volt. A QUANTA Lite TM LKM- ELISA az LKM- IFA+/HCV+ kiválasztott csoport 7%-át (4/2) találta pozitívnak. QUANTA Lite TM LKM- ELISA %-osan specifikus volt arra a 34 mintára, melyeket LKM- IFA pozitívnak, de klinikailag nem AIH-2 pozitívnak, illetve nem HVC pozitívnak találtak. Továbbá, 3 LKM-2 és 5 LKM halotán pozitív beteg a QUANTA Lite LKM- ELISA alapján negatív volt. A második külső vizsgálatban egy 4, dokumentáltan AIH-2 beteget (életkorok: 2,2,4,/2 és 6 éves) tartalmazó panelt, valamint 4 más autoimmun és májbeteg mintát teszteltek. Mind a 4 AIH-2 mintát pozitívként értékelték. 3 HCV pozitív minta volt LKM- ELISA és IFA pozitív, egy pedig csak LKM ELISA pozitív. További minták tesztjei a Kereszt-reaktivitás c. fejezetben találhatóak.. ábra QUANTA LITE LKM- ELISA Evaluation of Clinical Specimens 4 2 U N I T S LKM- Positive Autoimmune Hepatitis 2 positive HCV negative n=22 LKM- Positive - HCV positive n=2 LKM- Positive - NOT Autoimmune Hepatitis 2 - HCV negative n=34 LKM-2 Positive n=3 LKM- Halothane positive n=5 A belső vizsgálat során referencia laboratóriumokból és saját archívált mintákból összeállított, 79 mintát tartalmazó panelt teszteltek. A QUANTA Lite TM LKM- ELISA és LKM- IFA vizsgálatok eredményeit az. táblázat foglalja össze.. táblázat n=79 LKM- IFA POZ EQ NEG QUANTA LITE POZ 4 LKM- ELISA EQ NEG Összesített egyezés = 9,5% (65/7) (a kétes eredményeket kihagyva) 5

6 Kereszt-reaktivitási vizsgálat QUANTA Lite TM LKM- ELISA lehetséges kereszt-reaktivitásának megállapítására különböző klinikai csoportok mintáit tesztelték. Az eredmények az alábbi, 2. táblázatban láthatók. 2. táblázat Kereszt-reaktivitási vizsgálat Betegcsoport n= Poz. Kétes* neg. HCV * 4 5** 35 LKM LKM-halotán 5 5 Szolubilis májantigén (SLA) 5 5 -es típusú autoimmun hepatitisz 5 4 Crohn-betegség 6 6 Akut colitis Cirrózis (egy alkoholos, egy nemspec.) C 2 2 primer biliaris cirrhosis Cryoglobulinemia 3 3 Nem alkoholos steatohepatitis Post-obstruktív pankreatitisz Coeliakia Szkleroderma Addison kór (adreal poz.) Szigetsejt elleni antitest (ICA) 2 2 Glutaminsav dekarboxiláz (GAD) 2 2 AMA 8 8 SMA 3 3 TPO 9 9 Sm RNP SS-A SS-B Scl-7 Jo- Riboszóma P Kromatin PCNA ANA/DNA 9 9 Centromer * HCV pozitív minta (LKM- IFA rektivitásra nem kiválasztott) **** 5-ből 4 volt LKM- IFA pozitív Pontosság és reprodukálhatóság A teszt intra-assay teljesítményét 6 minta; egy-egy negatív, nem egyértelmű, éppen pozitív, mérsékelten pozitív, közepesen pozitív, illetve erősen pozitív minta 2-szeri teszteléséből értékelték ki. Az eredmények az alábbi, 3. táblázatban láthatók. 3. táblázat. szérum2. szérum3. szérum4. szérum5. szérum6. szérum Átl. 6,7 3,5 4,9 2,9 43,6 66,2 SD 2,6,8,3,4,8 2,8 CV % 4,2 5,8 5,3 3,2,8 4,3 Az inter-assay teljesítmény vizsgálata során 3 nap alatt összesen hatszor teszteltek mintát, köztük negatív, mérsékelten pozitív, közepesen és erősen pozitív mintákat, majd a kapott eredményeket értékelték. Naponta két teszt-futtatás volt, egy reggel, egy pedig délután. Az eredmények, melyeket a 4. táblázat foglalja össze, azt mutatják, hogy a CV% kb. 5%, vagy kevesebb volt valamennyi mintára 5,5 vagy annal magasabb teszt értékek mellett. 4. táblázat. szérum2. szérum3. szérum4. szérum5. szérum6. szérum7. szérum8. szérum9. szérum. szérum Átl. 58, 3,2 65,8 5, 5,2 46,9 4,4 48,5 44,2 5,4 SD,4,7 2,7,7,2 2,4,8 2,2 2,2,8 CV % 2,3 22,7 4, 4, 2,5 5, 7,6 4,5 4,9 4,2 A laboratóriumok közötti reprodukálhatóságot oly módon állapították meg, hogy 2 mintát vakon teszteltek a 2. külső klinikai helyen, majd az eredményeket összevetették az INOVA Diagnostics-ban korábban mértekkel. A regresszió analízis,99 R 2 értékkel, kiváló egyezést mutatott. 6

7 Linearitás 3 minta hígításával megmutatták, hogy a teszt jó linearitást ad az :5 - :25 hígítási tartományban. 2. ábra LINEARITY ASSAY QUANTA LITE TM LKM- ELISA its n U :5 : :2 :4 :8 : 6 y = -9,6737x + 75,98 R² =.988 y = -,896x + 3,4 R² =,9878 y = -2,63x + 75,67 R² =.9976 Dilution Hivatkozások. McFarlane IG. The Relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut 42: , Manns MP. Liver/kidney microsomal autoantigens. In: Autoantibodies, eds: Peter JB and Shoenfeld Y. Elsevier. pp , Manns MP and Obermayer-Straub P. Cytochromes P45 and uridine triphosphateglucoronosyltransferases: model autoantigens to study drug-induced, virus-induced, and autoimmune liver disease. Hepatology 26(4):54-66, Zanger UM, Hauri HP,Loeper J, Homberg JC and Meyer UA. Antibodies against human cytochrome P45 dbl in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: , Manns MP, Johnson EF, Griffin KJ, Tan EM and Sullivan KF. Major antigen of liver kidney microsomal auto-antibodies in idiopathic autoimmune hepatitis is cytochrome P45 dbl. J. Clin. Invest. 83:66-72, Gueguen M, Yamamoto AM, Bernhard O and Alvarez F. Anti-liver-kidney microsome antibody type recognizes human cytochrome P45 dbl. Biochem. Biophys. Res. Commun. 59: , Miyakawa H, Kitazawa E, Abe K, Kawaguchi N, Fuzikawa H, Kikuchi K, Kako M, Komatsu T, Hayashi N and Kiyosawa K. Chronic hepatitis C associated with anti-liver/kidney microsome- antibody is not a subgroup of autoimmune hepatitis. J. Gastroenterol. 32(6): , Clifford BD, Donahue D, Smith S, Cable E, Luettig B and Manns MP. High prevalence of serological markers of autoimmunity in patient with chronic hepatitis C. Hepatology 23:63-69, Gregorio GV, Pensati P, Iorio R, Vegnente A, Mieli-Vergani G and Vergani D. Autoantibody prevalence in children with liver disease due to chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Clin. Exp. Immunol. 2(3): 47-6, Declos-Valee JC, Hajoui O, Yamamoto AM, Jacqz-Aigrin E and Alvarez F. Conformational epitopes on CYP2D6 are recognized by liver/kidney microsomal antibodies. Gastroenterology 8: , Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H and Manns MP. Epitope mapping of cytochrome P45 2D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alpha-interferon treatment. J. Hepatol. 3(3): , Todros L, Saracco G, Durazzo M, Abate ML, Touscoz G, Scaglione L, Verme G and M Tissetto. Efficacy and safety of interferon alfa therapy in chronic hepatitis C with autoantibodies to liverkidney microsomes. Hepatology 22: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 27, Fifth Edition. 4. Beaune P, Pessayre D, Dansette P, Mansuy D and Manns MP. Autoantibodies against cytochromes P45: a role in human diseases. Adv. Pharmacol. 3:99-245, Homberg JC, Abuaf N, Bernard O, Islam S, Alvarez F, Khalil SH, Poupon R, Darnis F, Levy VG, Grippon P, et al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type : a second type of autoimmune hepatitis. Hepatology 7(6): 333-9,

8 A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 99 Old Grove Road San Diego, CA 923 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 8 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service HUN January 29 Revision 8